Inmunoterapia: Células dendríticas

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Inmunoterapia: Células dendríticas

  1. 1. INMUNOTERAPIA : VACUNAS ANTITUMORALES BASADAS EN CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs)
  2. 2. INTRODUCCIÓN <ul><li>Inmunoterapia y vacunas antitumorales </li></ul><ul><li>Células Dendríticas (DCs) </li></ul><ul><li>PROYECTO </li></ul>
  3. 3. INMUNOTERAPIA <ul><li>Es un tratamiento el cual intenta estimular el S.I. a cualquier persona o paciente. </li></ul>
  4. 4. VACUNAS <ul><li>VACUNAS son procedimientos efectivos que se basan en generar y expandir poblaciones de linfocitos (T y B) contra un antígeno e inducir memoria a largo plazo. </li></ul><ul><li>Preventiva/Terapéutica. </li></ul>
  5. 5. INMUNOTERAPIA <ul><li>Para aplicar este tipo de tratamiento necesitamos un antígeno. </li></ul><ul><li>En tumores, estos son Antígenos Asociados a Tumor (AATs) </li></ul><ul><li>AATs tienen expresión aumentada o disminuida de algunas proteínas normales, reprimidas o alteradas </li></ul><ul><li>En menor frec. estos AATs derivan de prot. mutadas </li></ul>
  6. 6. TIPOS DE VACUNAS ANTITUMORALES <ul><li>PASIVA  introduce anticuerpos contra estos AATs </li></ul><ul><li>ACTIVA  se introducen los AATs de diferentes formas </li></ul>
  7. 7. ACTIVA <ul><li>1- Proteínas o péptidos solubles </li></ul><ul><li>2- Virus recombinantes o bacterias como vectores de portadoes de AATs. </li></ul><ul><li>3- Inyección de DNA desnudo o acomplejado con liposomas catiónicos (que codifican para AATs) </li></ul><ul><li>4- Células tumorales modificadas genéticamente para poder expresar moléculas coestimuladoras y/o citoquinas </li></ul><ul><li>5- DCs son CPA cargadas con AATs o transducidas con genes específicos de tumor </li></ul>
  8. 8. INMUNOTERAPIA VENTAJAS I NCONVENIENTES <ul><li>Específica (va a céls tumorales ) </li></ul><ul><li>Muy destructiva </li></ul><ul><li>Pacientes sin recaídas </li></ul><ul><li>Tratamiento complementario </li></ul><ul><li>No todos los tumores tienen AATs </li></ul><ul><li>Substancias inmunosupreso-ras </li></ul><ul><li>Ausencia de diferentes moléc de membrana, como de adhesión, coestimuladoras, HLA, </li></ul>
  9. 9. CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs) <ul><li>DCs fueron descubiertas en 1868 en la epidermis </li></ul><ul><li>En 1973 se identificaron en otros tejidos (se han identificado en todos los tejidos excepto en testículo y cerebro) </li></ul><ul><li>Forman parte del sistema linfohematopoyético y su función era de centinela y iniciador de la respuesta inmunológica </li></ul>
  10. 10. OBTENCIÓN DE DCs <ul><li>1. Sangre Periférica y en Tejidos (0.1-1%) </li></ul><ul><ul><ul><li>Se pueden diferenciar de SP a partir de MONOCITOS </li></ul></ul></ul><ul><li>2.Células Progenitoras Hematopoyéticas </li></ul><ul><ul><ul><li>Médula Osea </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Cordón Umbilical </li></ul></ul></ul>
  11. 11. BIOLOGIA DE LAS DCs 1. Céls progenitoras 2.Precursores de sangre 3. DCs inmaduras 4. DCs maduras Estados Maduración
  12. 13. FUNCIONES DE DCs <ul><li>(Depende del estado de maduración) </li></ul><ul><li>1. CAPTURAR ANTÍGENOS (en tejido) y PROCESARLO </li></ul><ul><li>2. PRESENTAR EFICIENTEMENTE A LOS LINFOCITOS (estos antígenos en órganos linfoides secundarios) y INICIAR LA EXPANSIÓN Y MADURACIÓN DE LOS LINFOCITOS </li></ul>
  13. 14. DCs Linfocitos Células con igual antígeno Presentación del antígeno Proliferación de linfocitos Transducción
  14. 15. ” buffy-coat ” CA (monocitos) CnA (linfocitos) DCimmaduras DCmaduras Linfocitos CMNs Purificación con gradiente de densidad Purificación por el método de adhesión al plástico Congelación Descongelac + IL-2 IL-4 + GM-CSF Transducción Ad- GFP/  GAL TNF-  + GM-CSF
  15. 16. Linfocitos sin pre-est.(0) Linfocitos pre-est. GFP linfocitos pre-est.  GAL Linfocitos DCs transducidas HeLas - HeLas sin transducir HeLas transducidas con GFP HeLas transducidas con  GAL   Ensayo de proliferación con timidina tritiada Los linfocitos pre-estimulados con un antígeno (GFP o  GAL) se activan y PROLIFERAN al reconocer a este antígeno al cual esta pre-estimulado Transducción Ad-GFP/  GAL
  16. 17. “ Buffy-coat” CMNs CnA(linfocitos) CA (monocitos) Purificación por método de gradiente de densidad Purificación por método de adhesión al plástico
  17. 18. Proporción de CD14 positivo
  18. 19. Porcentaje de células positivas para marcadores celulares
  19. 20. CA (Monocitos) DCs inmaduras DCs maduras IL-4 + GM-CSF Transducción TNF-  + GM-CSF
  20. 21. Porcentaje de células positivas para marcadores celulares
  21. 22. Transducción con Ad-  , Ad-GFP y Ad-  GAL DCs HeLas 2.91% 17.34% 3.16% 2.96% 79.99% 88.17%
  22. 23. Linfocitos sin pre-est.(0) Linfocitos pre-est. GFP linfocitos pre-est.  GAL Linfocitos DCs transducidas HeLas - HeLas sin transducir HeLas transducidas con GFP HeLas transducidas con  GAL   Ensayo de proliferación Transducción Ad-GFP/  GAL
  23. 24. Objectivos de la proliferación 1. Observar que a mayor nº estimuladoras mayor proliferación. Ratios (proporción de respondedoras:estimuladoras) cuando aumenta la ratio disminuye el nº de HeLas, el nº de linfocitoses siempre constante 2. Observar que cuando enfrentamos respondedoras (linfocitos) con estimuladoras (HeLas) de la misma expresión (GFP-GFP y  GAL-  GAL) tendríamos que observar mayor proliferación de estos linfocitos
  24. 25. HeLas sin transducir HeLas transducidas con GFP HeLas transducidas con  GAL Control negativo/positivo
  25. 26. HeLas sin trasducir Linfocitos sin pre-estimular Linfocitos pre-esti- mulados GFP Linfocitos pre-esti- mulados  GAL
  26. 27. HeLas transducidas con GFP Linfocitos sin pre-estimular Linfocitos pre- estimulados con GFP Linfocitos pre- estimulados con  GAL
  27. 28. HeLas transducidas con  GAL Linfocitos sin pre-estimular Linfocitos pre- estimulados con GFP Linfocitos pre- estimulados con  GAL
  28. 29. CONCLUSIONES (1) <ul><li>1. Intentar ajustar el método de transducción de DCs para obtener mayor nº de células transducidas. </li></ul><ul><li>2. Repetir el experimento de proliferación para ver si los datos son reproducibles. </li></ul>
  29. 30. CONCLUSIONES (2) <ul><li>3. En el control negativo observamos proliferación. Esto nos sugiere que estos linfocitos estan pre-estimulados contra antígenos de SBF (suero bovino fetal). </li></ul>
  30. 31. CONCLUSIONES (3) <ul><li>4. Cuanto menor nº de estimuladoras mayor proliferación nos podría indicar que estas (HeLas) estan sintetizando substancias inhibitorias. Por tanto, cuanto mayor nº de HeLas más concentración de estas substancias y menor proliferación. Para comprobar esta hipotesis podríamos coger SN del cultivo de HeLas y poner diferentes concentraciones y hacer crecer los linfocitos. </li></ul>
  31. 32. CONCLUSIONES (4) <ul><li>5. Las HeLas por si solas tendrían que producir una reacción alogénica. Para evitar esto se podrían guardar células del donante y utilizarlas como céls estimuladoras. </li></ul><ul><li>6. Para evitar la problématica de si la reacción ha sido contra adenovirus o contra gen podríamos transducir las células estimuladoras con otro vector (retrovirus, electroporación,...) </li></ul>

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