Metodo de Elisa y Microelisa

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Metodo de Elisa y Microelisa

  1. 1. TÉCNICA ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay)<br />La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y mediante el uso de la fase sólida, consigue una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.<br />Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.<br />Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.<br />Desarrollo de los métodos inmunoquímicos<br />Debido que las micotoxinas no son antigénicas, los primeros estudios que se desarrollaron fueron en el sentido de lograr la conjugación con proteínas o polipeptidos que pudieran servir como transportadores en las condiciones óptimas de producción de anticuerpos en conejos y en otros animales. Con los avances en la tecnología se han logrado producir anticuerpos monoclonales contra diversas micotoxinas. Este desarrollo se ha incrementado en los últimos 8 años. En la Tabla 14.1. se presenta la relación actual de los anticuerpos para micotoxinas disponibles.<br />Como es de suponer se han desarrollado diferentes tipos de inmunoensayos entre los que destacan los sistemas ELISA (ensayos inmunologicos de enzimas ligadas), RIA (radioinmunoensayos) y las columnas de inmunoafinidad. La mayoría de estos métodos son muy sensibles, específicos y faciles de operar. Con lo que ha surgido una dimensión en cuanto a la metodología para análisis de micotoxinas.<br />Antes de proceder a la discusión de los diferentes tipos de inmunoensayos, debemos considerar lo siguiente:<br />Debido a que en la mayoría de los inmunoensayos se basan en la competición por los sitios de enlace de las moléculas de los anticuerpos entre las toxinas presentes en la muestra y las toxinas marcadas características del sistema, micotoxinas conjugadas. Por lo tanto es necesario contar con una micotoxina perfectamente marcada además del anticuerpo específico en el sistema de ensayo.<br />Es necesario contar con un buen método de extracción de las micotoxinas y con un procedimiento adecuado de separación de toxinas enlazadas y libres.<br />Debe conocerce el grado de especificidad de los anticuerpos, entrecruzamiento, contra compuestos análogos.<br />Debido a que siempre existe la posibilidad de que algún constituyente de la muestra reaccione con los anticuerpos se hace necesario estudiar detalladamente cada tipo de matriz, antes de realizar los ensayos respectivos.<br />En la mayoría de los sistemas de inmunoensayos no es necesario efectuar los procedimientos de limpieza de extractos. De modo tal que el extracto de la matríz sólida puede ser usado directamente en el ensayo, previa dilución con una solucióm amortiguadora característica del propio sistema. Sin embargo la sensibilidad de las determinaciones se incrementa cuando se utilizan un procedimiento adecuado de limpieza de los extractos.<br />Anticuerpos contra micotoxinasMicotoxinasTipoAflatoxinas: B1, B2, G1M y PMetabolitos de aflatoxinas B2a, Q1, M1, RoM y PAcido ciclopiazónicoPErgotaminaPFusarocromanonaPFumonisinaMAcido kojicoPOcratoxina AM y PToxina PRPRubratoxina BPAcido SecalonicoPEsterigmatocistinaPTricotecenos: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 y sus metabolitosM y PZearalenonaM y PPatulinaP<br />Ensayos cualitativos rápidos<br />Cuando se busca obtener información cualititativa de manera muy rápida es posible utilizar sistemas ELISA, directos o indirectos, que requieren periodos más cortos de incubación en los que se ha ajustado la concentración de anticuerpos. Principalmente se han desarrollado sistemas en que los anticuerpos se inmovilizan en un filtro de papel o en una membrana que se monta ya sea en una tarjeta de plástico (card screen test), en una copa de plastico (cup test, Cite), o en una jeringa (Cite probe) (Dorner and Cole, 1990, Trucksess et al., 1990, Chu 1990, Stubblefield, 1988). La reacción se lleva a cabo sobre la membrana humedecida. Después de la reacción la ausencia o disminución de color, generalmente azul, en el sitio donde se colocó la muestra indica la presencia de la toxina en la muestra. La reacción se lleva a cabo de manera muy rápida del orden de 10 a 15 minutos.<br />Dispositivos empleados en ELISA<br />6286523698203091815255905Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción (fenómeno de superficie) de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High-throughput system').<br />Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.<br />Fases de un ensayo ELISA<br />Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:<br />Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. <br />Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.<br />Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.<br />Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.<br />Tipos de ensayos ELISA<br />Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.<br />ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).<br />7581902000414<br />ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.<br />ELISA sándwich (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.<br />Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados<br />En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.<br />EnzimaSustratoTampónHRP (peroxidasa de rábano)OPD10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; añadir microL de 30% peróxido de hidrógeno 30%TMB2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0.1M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30%ABTS60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0.1 M pH 6; añadir 35 microL de peróxido de hidrógeno 30%; parar con fluoruro sódico 1.25%; leer a 405 nmDAB10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 20 microL de peróxido de hidrógeno 1%CNP6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30%AEC80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno 30%ASA80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y añadir 10 % por volumen de 0.05% peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de NaOH 1 MAP      (Fosfatasa alcalina)PNPP5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesioNAPFB(A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. NAPR(A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. BCIP1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol)beta-GONPG2.5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanolureasaBP8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; añadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar elpH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4ºCPGISAñadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampón fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidón en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampón fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solución stock (en una botella oscura)<br />Características que deben reunir las enzimas para ELISA <br />Debe ser económica y obtenerse con un alto grado de pureza<br />Elevada actividad específica<br />Estable en condiciones de almacenamiento y prueba<br />Soluble<br />Sencilla, sensible y medible con gran rapidez<br />No debe estar presente en el medio analizado<br />Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo<br />No perder actividad cuando se conjuga<br />Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo <br />Limitaciones del ELISA<br />Anticuerpos solo son producidos en centros especializados.<br />Anticuerpos necesitan tener propiedades correctas.<br />ELISA necesita ser validado para cada aplicación.<br />ELISA necesita estar acoplado con confirmación de identidad.<br />DETECCION DE MICOTOXINAS POR MEDIO DE TEST DE ELISA<br />Un grupo de técnicas que se vienen desarrollando desde los años ochenta para el análisis de micotoxinas son las técnicas inmunológicas, basadas en los procedimientos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) para la detección y cuantificación.<br />El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.<br />Las técnicas analíticas para la detección de micotoxinas están en continuo desarrollo, existen kits ELISA comerciales de análisis basados en la técnica enzimo-inmuno análisis competitivo. El principio básico de estos kits como se nombro anteriormente se basa en la afinidad de las micotoxinas por anticuerpos específicos fijados a un soporte. La reacción de competición entre la micotoxina y un producto enzimo/conjugado (coloreado) que contiene el kit indica la ausencia de la toxina cuando el resultado de la prueba es una señal coloreada, y presencia de las mismas en caso de ausencia de color.<br />Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación:<br />Anticuerpos marcados:<br />ELISA Directo<br />ELISA Indirecto<br />ELISA sándwich<br />Antígeno marcado<br />ELISA competitivo (Biofarm 2007).<br />RIDASCREEN Aflatoxin M130/15.<br />El formato de pozos de microtitulación en el sistema ELISA se adapta al análisis en serie de gran número de muestras. Esto permite economizar gastos. ELISA permite la inclusión de controles positivos durante el análisis. <br />Esto no ocurre en el sistema de la Columna de Inmuno Afinidad. La única forma de asegurarse que el sistema está siendo efectivo es mediante algún tipo de control concomitante. El formato de pozo de titulación permite el uso de controles, lo que asegura el buen funcionamiento del ensayo.<br />Los llamados kits de ELISA que utilizan anticuerpos policlonales no especificos para la micotoxina que se pretende analizar, hay que aplicarlos exclusivamente al sustrato o sustratos indicados por la empresa responsable por los mismos. Ocurre a menudo que son aplicados indiscriminadamente para cualquier sustrato, como es el caso de los piensos. Estos tienen una gran heterogeneidad y algunos componentes pueden interferir con esos anticuerpos y dar lugar a resultados falsos positivos o bien que se encuentre una concentración de micotoxina superior a la que existe. <br />Es aconsejable y en especial en los piensos, que cuando un método basado en ELISA (con anticuerpos policlonales) dé un resultado positivo, se reconfirme por otros métodos. <br />Hay que saber muy bien las características del kit ELISA que se pretende comprar. Sin embargo, y considerando los comentarios anteriores, los kits de ELISA son válidos y nos ofrecen la posibilidad de ahorrar dinero y tener resultados rápidos. <br />LAS MICOTOXINAS Y SEGURIDAD ALIMENTARIA<br />Según la FAO la seguridad alimentaria se define como “la disponibilidad local de alimentos y su distribución, y el acceso de la persona a los alimentos para una vida saludable”.<br />El interés de los hongos y las micotoxinas es enorme, no solo desde el punto de vista científico, sino desde la perspectiva económica. Son muchos los problemas que originan, desde el agricultor hasta el consumidor final. Por ejemplo, las bajadas de rendimientos de las cosechas, los empeoramientos en los índices técnicos de los animales de granja, enfermedades de los mismos, alteraciones en los alimentos, perdidas de características organolépticas y nutricionales, coste derivados con la prevención o el tratamiento.<br />

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