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Aula Indice de Fragmentação de DNA espermático: como avaliar e tratar. Conrado Alvarenga M.D.

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Aula Indice de Fragmentação de DNA espermático: como avaliar e tratar. Conrado Alvarenga M.D. - XI Congresso Paulista de Medicina Reprodutiva, 2017 - mesa de andrologia.

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Aula Indice de Fragmentação de DNA espermático: como avaliar e tratar. Conrado Alvarenga M.D.

  1. 1. DR. CONRADO ALVARENGA INDICE DE FRAGMENTAÇÃO DE DNA ESPERMÁTICO
  2. 2. Urologista formado pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP), especializado em Andrologia e Infertilidade Masculina. Membro do corpo clínico do Hospital Sírio Libanês e da Divisão de Urologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP DR. CONRADO ALVARENGA APOIO
  3. 3. CONFLITOS DE INTERESSE
  4. 4. 16% Yearly decline in men’s Sperm count in the West SOURCE: HUMAN REPRODUCTION UPDATE
  5. 5. QUEDA DA FERTILIDADE MASCULINA PELO MUNDO The research = 26,600 men showed a "significant and continuous" 32.2% decrease in sperm concentration over 17 years Sperm per millilitre of semen fell at about 2% a year between 1989 and 2005 In French men with an average age of 35, sperm count reduced = 73.6 million/ml to 49.9 m/ml.
  6. 6. AUMENTO DO IMC E INGESTA DE GORDURA SATURADA AUMENTO DO SEDENTARISMO AUMENTO DOS NÍVEIS DE ESTRESSE PIORA A QUALIDADE DO SONO AUMENTO DOS DISRUPTORES ENDÓCRINOS POLUENTES AMBIENTAIS HIPÓTESES PRINCIPAIS QUEDA DA FERTILIDADE MASCULINA PELO MUNDO
  7. 7. QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DA FRAGMENTAÇÃO DA CROMATINA ESPERMÁTICA ? 15% dos homens inférteis apresentam espermograma normal
  8. 8. Não é marcador de fertilidade ou infertilidade Até 18% dos espg normais tem elevados IFDNA
  9. 9. COMEÇO
  10. 10. A integridade do DNA espermático = essencial para a correta transmissão da informação genética Alterações na cromatina ou dano direto ao DNA pode resultar em infertilidade Alterações na cromatina ou dano direto ao DNA RESULTAM EM AUMENTO NO RISCO ABORTO 18-20% DOS ESPG NORMAIS TEM IFDNA ALTERADO
  11. 11. SURGEM PRIMEIROS TRABALHOS Tempo mais longo para estabelecer uma gestação normal, maior número de ciclos de Fertilização in vitro e aumento do risco de abortamento espontâneo FRAGMENTACAO DE DNA NO SEMEM
  12. 12. Conclusions The SCSA analysis is a precise, timely and cost-effective diagnostic tool to help manage a couple’s infertility treatment, whereas the Comet and Tunel assays currently lack the consistency and reliability needed in a clinical setting. all idiopathic couples; men older than 40 years, even if prior fertility; men with known exposures to toxicants; men with above mentioned pathologies; and all couples presenting for infertility Patients presenting with the following should have a DNA fragmentation test:
  13. 13. In the words of Dr. Larry Lipshultz, a well recognized urologist who is at the forefront of modern urological practice at Baylor Medical College, ‘‘I perform DNA fragmentation testing for all my patients who are undergoing IVF with ICSI so that I can give them a general idea of how successful their cycles might be. If the tests show greater than 26% DNA fragmentation, chances for poor embryo development increase.’’ D.P. Evenson, R. Wixon / Theriogenology 65 (2006) 979–991
  14. 14. Mean (SD), median (range) Control Subfertile men P Mean no. of sperm analysed 7264 5212 DFI, % 8.4 (5.6), 5.0 (4–21) 22.8 (14.6), 17.0 (4–63) <0.001 Moderate DFI 6.4 (4.5), 4.0 (3–17) 16.4 (11.1), 13.0 (3–52) 0.001 High DFI 2.0 (1.3), 1.0 (1–4) 6.2 (6.1), 6.1 (0–26) 0.01 DNA FRAGMENTATION DATA FOR THE FERTILE CONTROL SUBJECTS AND SUBFERTILE MEN
  15. 15. Halosperm may not be the definitive technique, if indeed one exists, but its ease of use and interpretation facilitates its potential incorporation into any basic research and clinical laboratory in the world. This is in contrast to the more complex SCSA. With greater access to a simple, reliable, and sensitive sperm DNA fragmentation technique, perhaps conclusions about the clinical validity of such assays will be made more swiftly.
  16. 16. 500 células Normal Até 15% dos espermatozóides com DNA fragmentado Moderado Entre 16 a 30% dos espermatozóides com DNA fragmentado Elevada Acima de 30% dos espermatozóides com DNA fragmentado Resultado – 12,8% (porcentagem de espermatozóides com DNA fragmentado) Espermatozóides fragmentado / Espermatozóides analisados: 64 / 500 Metodologia – Dispersão da Cromatina Espermética (SCD Sperm Chromatin Dispertion) – HALOSPERM® FRAGMENTAÇÃO DO DNA ESPERMÁTICO
  17. 17. 16TRABALHOS 2.969 casais Is there an association between high levels of sperm DNA damage and miscarriage? Significant increase in miscarriage in patients with high DNA damage compared with those with low DNA damage [risk ratio (RR) = 2.16 P < 0.00001]
  18. 18. Whether sperm deoxyribonucleic acid fragmentation has an effect on pregnancy and miscarriage after in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a systematic review and meta-analysis. OBJECTIVE: To examine whether sperm DNA fragmentation has an effect on pregnancy and miscarriage after IVF and/or intracytoplasmic sperm injection (ICSI). DESIGN: Systematic review and meta-analysis. SETTING: University-affiliated teaching hospital. PATIENT(S): Infertility patient(s). INTERVENTION(S):
  19. 19. IncludedEligibillitySreeningIdentification Records identified through database searching (n=401) Studies included in quantitative meta-analysis for miscarriage (=14) Additional records identified though other sources (n=0) Records after duplicates removed (n=400) Records excluded (n=302) Records screened (n=98) Full-text articles excluded, with reasons (=75) Full-text articles assessed for eligibility (n=23) Studies included in quantitative meta-analysis for pregnancy (n=16)
  20. 20. 2013 Dar (20) Pro ICSI Acridine Orange 50 39 19 7 114 53 13 7 / 39 13 / 114>
  21. 21. MENSAGENS A grande maioria dos trabalhos publicados relacionando resultados da reprodução assistida com índice de fragmentação de DNA 1 POSSUEM NÚMERO PEQUENO DE PACIENTES 2 MÉTODOS DIFERENTES DE ANÁLISE E SELEÇÃO NÃO HOMOGÊNEA DOS CASOS Fica claro e evidente que o dano ao DNA espermático afeta sim os resultados da FIV/ICSI, principalmente nas taxas de gravidez clínica e de aborto
  22. 22. Ainda ha duvida e muitos pontos a serem esclarecidos Fertility and Sterility® Vol. 99, No. 1, January 2013 0015-0282
  23. 23. QUAIS SÃO OS TESTES DISPONÍVEIS TUNEL assay 1993 Comet assay1996 Sperm chmatin sperm structure (SCSA) 1980 Sperm chmatin dispersion test (SCD)2003 Aniline blue, toluidine blue 1995 ?
  24. 24. Métodos para avaliar a FDE Direto Indireto Incorporação de probes no local da fragmentação Ex: Tunel Susceptibilidade das quebras à desnaturação em uma solução ácida Ex: Sperm chromatin structure assay (SCASA), sperm chromatin dispersion test (SCD), Comet assay
  25. 25. Qual Teste Adotar em seu laboratório? DIFICULDADE TÉCNICA E TEMPO DE EXECUÇÃO NECESSIDADE DE EQUIPAMENTOS COMPLEXOS E CAROS SUBJETIVIDADE DA ANÁLISE VALIDAÇÃO E PADRONIZAÇÃO TUNEL O O O O O O O O O O O SCSA O O O O O O O O O O O COMET O O O O O O O O O O O SCD O O O O O O O
  26. 26. CENÁRIOS ASSOCIADOS COM ELEVADOS IFDNA
  27. 27. Obesidade e Fragmentação DNA Kort et al, J Androl; 2006 Chavarro et al, Fertil Steril, 2009 19.9 25.8 27 0 5 10 15 20 25 30 IMC 20-24 IMC 25-30 IMC > 30 DFI (%) IMC 20-24 IMC 25-30 IMC > 30
  28. 28. Varicocelectomy studies have reported significant improvements in one or more semen parameters in approximately 65% of men
  29. 29. Redução média de 14,4% nos IFDNA Studies have shown that men who achieved a post-operative total motile sperm count greater than 20 million and sperm DNA fragmentation decrease after varicocelectomy were more likely to initiate a pregnancy either spontaneously or via assisted reproductive technology (ART)
  30. 30. CASE REPORT IFDNA DURANTE USO > 30% 3 MESES SEM 21,2 % APOS 6 MESES 16,5% ESTUDO PURAMENTE ANDROLOGICO
  31. 31. Sperm DNA fragmentation after radioiodine treatment for differentiated thyroid cancer Background Treatment of differentiated thyroid cancer usually consists of a total thyroidectomy followed by one or several courses of radioiodine (131I). 131I is known to have deleterious effects on radiation sensitive tissues and irradiation to the testes has been shown after its administration. We investigated effects of such treatment on sperm DNA in a patient with differentiated thyroid carcinoma. Methods The patient, a 32-year-old male with differentiated thyroid carcinoma treated by total thyroidectomy and radioiodine therapy, performed 6 semen samples in total, 3 for sperm banking and 3 for semen exploration, that were analysed for classic semen parameters. DNA integrity was analysed by flow cytometry: sperm DNA fragmentation index (DFI) and high DNA stainability (HDS) were analyzed by sperm chromatin structure assay, DNA fragmentation was analyzed by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay. Results Moderate oligozoospermia was observed as early as 3 months after a first dose of 131I and became severe at 5 months. Total sperm count was reduced up to 12 months after the second dose of 131I. Sperm DFI was increased 3.25 months after the first dose of 131I. All parameters returned to normal values 28 months after the second 131I dose.
  32. 32. Radioiodine can affect not only classic sperm parameters but also the genetic material of spermatozoa !!!! 2016 Sem análise pré…....
  33. 33. Apresentação projeto doutorado Conrado Alvarenga / Dr. Raquel A. Moyses HCFMUSP – ICESP: 2017-2019
  34. 34. INFECÇÕES
  35. 35. TABAGISMO
  36. 36. O QUE FAZER PARA REDUZIR
  37. 37. 44 pacientes – normo e oligo – SEM CONTROLE Tratados com zinco (10mg/ml), aspartato (500mg/ml) e coenzima q10 40mg/ml Avaliados h/h por 6h e TUNEL ( DNA ) Melhora em todos os parâmetros – motilidade progressiva, peroxidacao lipidica e DNA FRAGM
  38. 38. Can You Treat Sperm DNA Fragmentation ASRM 2015 Reducing the amount of sperm DNA fragmentation includes such things as "having a urologist evaluate the man to determine if a varicocele is present and, if large, surgically repair it. Several studies have shown this not only brings down the DFI but increases pregnancy success,” . Keep the testes cool Stop smoking Eat a diet rich in antioxidants because oxidative stress is the primary culprit for breaking DNA Avoid some medications such as cortisone and SSRIs Ask your doctor about supplementary vitamins and antioxidants such as vitamins C and E, co-enzyme Q-10 and supplements containing carnitine. Fragmentação DNA
  39. 39. P < 0,001 após 24hs Tempo e Temperatura de incubação da amostra seminal
  40. 40. Gradiente e Swim up TÉCNICAS DE PROCESSAMENTO SEMINAL Swim up Zini et al Sakkas et al, Xue et al, Brahem et al Spano et al, Younglai et al Swim up e gradiente
  41. 41. NOVOS TESTES QUE PERMITAM USAR A CÉLULA AVALIADA Espectroscopia Raman
  42. 42. Fertil Steril. 2015 Dec;104(6):1398-405 ICSI com sptz ejaculado (N=91) ICSI com sptz testicular (N=81) 147 Homens inférteis com oligozoospermia ( 5 – 15 M/mL ) e alta FDE (>30%) após uso de antioxidantes
  43. 43. MENSAGENS FINAIS Espermograma convencional limitado avaliação potencial fértil; resultados devem ser interpretados com cautela Teste Fragmentação DNA Espermático emerge como ferramenta que permite avaliação cromatina nível molecular No campo laboratorial, as seguintes medidas parecem ser úteis para minimizar a fragmentação do DNA espermático b. Processamento seminal pelo gradiente descontínuo coloidal de 2 camadas c. Incubação por curto período de tempo das amostras pós-processadas (<3h) e à temperatura ambiente d. Utilização espermatozoides testiculares e. Técnicas de seleção espermática (PICSI, Sperm Slow, MACS, IMSI) Abstinência ejaculatória reduzida (1 dia), com coletas seriadas Necessário mais estudos (escassos e não padronizados) e meta-análises sobre o tema
  44. 44. SAÚDE REPRODUTIVA DO HOMEM Urologista Endocrinologista Biomédica Enfermagem Nutricionista Ginecologista Psicóloga Terapeuta Personal Trainer
  45. 45. A edição do DNA vai revolucionar a medicina CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

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