Master Rinaudo Marzo 09

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Proprietà biochimiche e strutturali delle
idrolasi acide, ceramide glicosidasi e
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alla base rispettivamente della malattia di Gaucher e di Niemann-Pick.

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Master Rinaudo Marzo 09

  1. 1. Proprietà biochimiche e strutturali delle idrolasi acide, ceramide glicosidasi e sfingomielinasi, il cui deficit funzionale è alla base rispettivamente della malattia di Gaucher e di Niemann-Pick. Prof.ssa Maria Teresa Rinaudo Facoltà di Medicina e Chirurgia - Università di Torino
  2. 2. Classificazione delle malattie da accumulo La malattia di Gaucher (GD) e di Niemann Pick (NPD), il cui nome si riferisce ai due medici che per primi ne hanno descritto la sintomatologia, fanno parte di un gruppo relativamente numeroso di malattie ereditarie prevalentemente autosomiche recessive note come malattie da accumulo. Infatti sono caratterizzate da accumulo di due lipidi complessi ceramide beta- glucosio (GlcCer) e sfingomielina o ceramide fosforilcolina o fosforiletanolamina (SM). In senso più ristretto, le due patologie sono definite malattie lisosomiali in quanto l’accumulo di GlcCer e SM ha luogo nei lisosomi. GD e NPD sono definite anche sfingolipidosi in quanto GlcCer e SM sono due sfingolipidi che hanno come componente comune la sfingosina. Quasi tutte le malattie da accumulo lisosomiale sono dovute a ridotta degradazione del composto accumulato. Poiché la degradazione solitamente coinvolge processi idrolitici, la patologia è spesso dovuta a ridotta attività di idrolasi specifiche attive sul composto oggetto di accumulo. Nella GD è tale GlcCerase (glucoceramidasi) acida. Nella NPD è tale ASMase (sfingomielinasi) acida. La definizione acida sta ad indicare che entrambe le idrolasi richiedono per essere attive un pH acido (5,5-6,5) caratteristico dei lisosomi.
  3. 3. I lisosomi Sono organelli subcellulari che all’interno hanno un pH fra 5,5-6,5 e quindi acido, mantenuto tale ad opera di pompe protoniche presenti sulla membrana del lisosoma che continuamente immettono protoni all’interno prelevandoli dal citoplasma; questo trasporto è molto dispendioso e comporta un considerevole e costante consumo di ATP. Ne consegue che con la morte della cellula queste pompe collassano, i lisosomi vanno incontro a lisi permettendo alle idrolasi, in essi segregate, di diffondere e indurre la necrosi della cellula.
  4. 4. Funzioni dei lisosomi: Sono deputati alla degradazione di composti vari derivati dal circolo (particelle estranee, ormoni, tossine batteriche) e di frammenti di membrana che necessitano di essere rinnovati o sostituiti nei loro componenti, i quali tutti vengono veicolati al lisosoma per un processo denominato endocitosi. Per un processo noto come esocitosi provvedono a riportare in membrana o rilasciare all’esterno i prodotti della loro attività o componenti ad essi veicolati e non degradati.
  5. 5. Struttura delle membrane Sono formate da un doppio foglietto ESTERNO lipidico all’interno del quale si Catene oligo- inseriscono glicoproteine che saccaridiche attraversano la membrana da parte a glicolipide parte (proteine integrali di membrana), e proteine adese sul lato Doppio citosolico della membrana (proteine strato lipidico esterne). Le prime sono sia elementi Teste polari strutturali sia concorrono alla sterolo formazione di canali ionici (trasporto di Proteine Proteine Proteine ioni sodio, potassio, calcio, cloro etc), Proteine integrali periferiche integrali periferiche funzionano come recettori (ormoni) e INTERNO trasduttori o generatori di cascate di GlcCer segnale. Il doppio foglietto lipidico è formato da lipidi complessi, molecole anfipatiche (affini sia a composti di natura Gruppo idrofilico Gruppo idrofobico idrofobica che idrofilica) in quanto caratterizzate da una parte idrofobica, nello spessore della membrana, e un’altra idrofilica, sui lati citosolico ed SM esterno.
  6. 6. Lipidi complessi 1. Glicerofosfolipidi: l’alcol è il glicerolo, presente anche in tutti i trigliceridi, legato a due acidi grassi (parte idrofobica) e a un gruppo fosfato legato a colina, etanolamina o serina (parte idrofila); 2. Sfingolipidi: l’alcol è la sfingosina, che consiste di una catena C18 alla quale sono uniti in posizione 1 e 3 due funzioni alcoliche ed in posizione 2 un gruppo aminico a cui si lega costantemente un acido grasso a lunga catena. Questo raggruppamento sfingosina/acido grasso detto ceramide costituisce la parte idrofobica dello sfingolipide. La componente idrofila è legata al gruppo alcolico in posizione 1 della sfingosina;
  7. 7. Classificazione degli sfingolipidi Sfingomieline in cui al C1 della ceramide è legata la fosforilcolina o la fosforiletanolamina. L’idrolisi della sfingomielina in ceramide e fosforilcolina o etanolamina è catalizzata dalla sfingomielinasi (Smase), in particolare nei lisosomi da ASMase, la cui scarsa attività è causa di NPD. Glicosfingolipidi suddivisi in: 1) cerebrosidi e sulfatidi: alla ceramide sono legati i monosaccaridi galattosio o galattosio solfato; 2) Globosidi: alla ceramide sono uniti i monosaccaridi glucosio, galattosio, galattosio, N-acetilgalattosamina; 3) Gangliosidi: alla ceramide sono uniti 4 monosaccaridi quali glucoso, galattosio, N-acetilgalattosamina, galattosio e una o più molecole di acido sialico. Pertanto dalla degradazione di globosidi e gangliosidi origina sempre GlcCer substrato specifico nei lisosomi di GlcCerase, l’idrolasi la cui scarsa attività è causa di GD.
  8. 8. Malattia di Gaucher (GD) deficit della idrolasi β-glucosidasi acida o glucoceramidasi (GlcCerase) La causa primaria di GD è una ridotta attività nei lisosomi di GlcCerase, l’idrolasi che selettivamente risolve GlcCer in glucoso e ceramide, conseguente a mutazioni del gene codificante localizzato sul cromosoma 1q21. Fra le malattie da accumulo lisosomiale, GD è quella che ha l’incidenza più elevata. Anomalia tipica di GD consiste in accumulo di GlcCer nei lisosomi di cellule macrofagiche che di conseguenza aumentano di volume assumendo aspetto spumeggiante (cellule di Gaucher) particolarmente marcato nel Sistema Reticolo Endoteliale del fegato, milza e midollo osseo (epatosplenomegalia progressiva) e in macrofagi di altri tessuti; questo fenotipo è proprio della forma meno grave di GD definita GD viscerale compatibile con una sopravvivenza fino all’età adulta. Se l’accumulo compare anche nel tessuto nervoso, in particolare nel cervello, la malattia diventa neuronale (GD neuronopatica) con danni neurologici così gravi da limitare la sopravvivenza ai primi anni di vita. L’accumulo di GlcCer compare anche nelle membrane neuronali inclusa la mielina. .
  9. 9. Malattia di Gaucher (GD) GD è suddivisa in tre sottotipi: 1) GD1: forma viscerale, spesso asintomatica per molto tempo, contraddistinta da epatomegalia, osteopenia, deformazioni ossee, trombocitemia e anemia; 2) GD2 e GD3: forme neuronopatiche caratterizzate da danni neuronali gravi (disturbi oculomotori, difficoltà di deambulazione, notevole compromissione del midollo allungato, necrosi neuronale) che si sommano a quelli della forma viscerale. Questi danni sono più severi in GD2 che è letale nei primi anni di vita.
  10. 10. Proprietà strutturali e biosintesi GlcCerase, come la maggior parte delle idrolasi coinvolte nelle patologie da accumulo lisosomiale, è una glicoproteina in cui la catena polipeptidica è legata a catene oligosaccaridiche ricche in mannoso. La sintesi della catena Glicoproteina oligosaccaridica ha luogo sulla catena peptidica, procede nel reticolo endoplasmico e si conclude nell’apparato di Golgi, in cui alcuni residui di mannoso vengono fosforilati sul C6 (catene ricche in mannoso fosfato), mentre altri rimangono invariati (catene ricche in mannoso). Il gruppo mannoso-fosfato è indispensabile per la traslocazione della proteina al lisosoma via recettori specifici.
  11. 11. Localizzazione A livello del lisosoma, le molecole dell’enzima in parte perdono il fosfato legato a mannoso e in questa forma rimangono nel lisosoma dove svolgono il loro ruolo di idrolasi; altre invece conservano il mannoso-fosfato, vengono incluse all’interno di vescicole (endosomi secondari), e veicolate alla membrana plasmatica dove concorrono al turnover degli sfingoglicolipidi del doppio foglietto lipidico. Nei pazienti con GD l’enzima poco attivo provocherà accumulo di GlcCer oltre che nei lisosomi anche in membrana, difetto che caratterizza in modo evidente soggetti con GD di tipo 2 e 3. Questo riciclaggio di GlcCerase alla membrana plasmatica è comune anche ad altre idrolasi attive sugli sfingolipidi tra cui la sfingomielinasi acida di cui parleremo successivamente.
  12. 12. Fattori che intervengono nella regolazione della attività di GlcCerase Circa 200 mutazioni sono state individuate sul gene (cromosoma 1), la maggior parte riscontrate negli ebrei Ashkenazi. L’accumulo di GlcCer è tipico di tutte le forme di GD in cui spesso si associa ad accumulo di glucosio-sfingosina (GlcSph), che deriva da GlcCer per distacco dell’acido grasso. GlcSph normalmente non compare nei tessuti ma la sua presenza è elevata nel sistema nervoso di pazienti con GD2 e GD3 e pare concorrere a potenziare gli aspetti deleteri della malattia. Per avere una attività ottimale GlcCerase deve essere associata a saposina C (SapC), proteina di piccola massa molecolare con funzione di attivatore, in quanto facilita l’interazione di GlcCerase con GlcCer facendo da ponte tra le due entità. Mutazioni della SapC potrebbero essere causa di alcune forme di GD; in alternativa mutazioni su GlcCerase potrebbero rendere difficile l’interazione con SapC.
  13. 13. Modalità di trattamento di GD Per le malattie da accumulo, ed in particolare quelle con accumulo lisosomiale, non esistono ad oggi delle terapie efficaci; trattamenti diversi sono in fase di progetto o addirittura trovano applicazione seppure a costi esorbitanti e con vantaggi spesso molto limitati. Le terapie già in applicazione o in fase sperimentale sono le seguenti: 1) Enzyme Replacement Therapy (ERT): l’enzima difettoso è sostituito dall’enzima fisiologico somministrato in circolo come tale o legato ad un supporto di varia natura che ne facilita il trasporto, l’inserzione sulla membrana cellulare e la successiva internalizzazione ai lisosomi. • Ostacoli : a) applicabilià solo in pazienti affetti da GD1, in quanto la massa molecolare della idrolasi ne pregiudica il superamento della barriera emato- encefalica; b) instabilità della proteina in rapporto alla sua natura; c) possibile interazione con molecole con funzione inibitoria presenti in circolo e nei tessuti. Inoltre è richiesta una costante integrazione dell’enzima, stante la sua labilità, in quanto proteina, e questo comporta costi notevoli. • ERT è il trattamento attualmente maggiormente utilizzato nella terapia di GD. L’enzima è in commercio con il nome di Cerezyme ed è utilizzato da oltre 15 anni; attualmente nel mondo sono circa 4000 i pazienti in trattamento.
  14. 14. Modalità di trattamento di GD 2) Substrate Reduction Therapy (SRT) Terapia basata sulla riduzione della quantità di substrato disponibile per l’idrolasi; si basa sulla somministrazione di molecole che si comportano come inibitori competitivi o di tipo allosterico nei riguardi dell’enzima che concorrono a formare GlcCer. Questa terapia si è rilevata di qualche vantaggio per GD1, minimo o nullo per GD2 e GD3. Inoltre spesso l’antagonista induce effetti aspecifici tossici e quindi la terapia si presenta non scevra di rischio. 3) Enzyme Enhancement Therapy (EET) Terapia basata sulla somministrazione di molecole che si comportano come chaperonine nei riguardi dell’idrolasi in quanto ne potenziano la stabilità o ne correggono un errato ripiegamento. Nel caso di GD alcune mutazioni sono causa di non corretto ripiegamento della molecola dell’enzima, o alternativamente ne rendono difficile l’accesso ai lisosomi, o ne precludono il rilascio dal Golgi o dal reticolo endoplasmico. Poiché nella malattia il deficit di funzione dell’enzima mutato non è mai totale, ne consegue che EET può avere un effetto positivo seppure molto limitato.
  15. 15. Malattia di Niemann Pick (NPD) NPD è una malattia ereditaria autosomica recessiva causata da deficit dell’idrolasi sfingomielinasi acida (ASMase); si manifesta in due forme identificate come NPD di tipo A (NPD-A) e NPD di tipo B (NPD-B) con fenotipo solo in parte sovrapponibile. Entrambe le forme sono caratterizzate da accumulo nei lisosomi di sfingomielina (SM) particolarmente evidente in cellule macrofagiche presenti in circolo e accentrate nel sistema reticolo endoteliale di organi quali fegato, milza e midollo osseo; tuttavia l’accumulo lisosomiale è presente anche in altri tessuti tra cui il sistema nervoso centrale (CNS) in particolare il cervello. Se l’accumulo è limitato ai tessuti periferici la malattia è definita viscerale e classificata come NPD-B; se si presenta anche in CNS (e soprattutto nel cervello), la malattia è definita neuronopatica ed è classificata come NPD-A. In entrambe le forme i segni clinici non sono evidenti alla nascita e si rendono tali solo dopo alcuni mesi di vita (NPD-A) o nell’infanzia e talvolta solo in età adulta (NPD-B).
  16. 16. Incidenza della malattia NPD-A è altamente invasiva e comporta danni neurologici gravi (ipomielinizzazione, degenerazione dei neuroni, atrofia del cervelletto); la morte è stimata intorno ai tre anni di vita. NPD-B è invece meno aggressiva ed è compatibile con una durata di vita fino all’età adulta. NON c’è separazione netta fra le due forme in quanto nei pazienti il quadro clinico sfuma da quello tipico di NPD-B a quello di NPD-A. Il diverso grado di severità della malattia spesso si associa a un diverso grado di deficit funzionale di ASMase, notevolmente più elevato nei casi con NPD-A. L’incidenza della malattia e la distribuzione demografica non sono note con esattezza: la frequenza maggiore è stata rilevata negli ebrei, in particolare nella comunità degli Ashkenazi. Su 1000 pazienti affetti da deficit di ASMase circa 200 sono colpiti da NPD-A e di questi il 66% sono ebrei Ashkenazi; il rimanente 34% include soggetti del Nord- America, Europa Occidentale, Nord-Africa e Medio Oriente.
  17. 17. Isoforme della sfingomielinasi Esistono differenti forme di SMase identificate, sulla base del pH ottimale per la attività: 1) SMase acida (ASMase) attiva a pH 5,5-6,8 (coinvolta in NPD) 2) SMase neutra (NSMase) attiva a pH 6.8-7,4 3) SMase alcalina o basica (BSMase) attiva a pH oltre 7. Ognuna di queste forme è codificata da geni differenti, il gene Smpd1 (cromosoma 11) codifica ASMase; per NSMase sono state identificate differenti isoforme la cui espressione è regolata da almeno tre differenti geni, Smpd2, Smpd3, Smdp4, apparentemente indenni da mutazioni.
  18. 18. Vie di sintesi e distribuzione intracellulare Le diverse isoforme sono tutte glicoproteine e sono differentemente distribuite nella cellula. NSMase è presente nel citoplasma, sulla membrana del reticolo endoplasmico e dell’apparato di Golgi e sul lato citosolico della membrana plasmatica. ASMase prevale nei lisosomi (forma definita L-ASMase); tuttavia dal lisosoma essa può migrare via endosomi secondari di origine lisosomiale alla membrana plasmatica localizzandosi sul lato esterno. Inoltre ASMase può migrare direttamente dall’apparato di Golgi, via vescicole di secrezione, alla membrana plasmatica e localizzarsi sul lato esterno; questa forma è definita secretoria o S-ASMase. Ne consegue che il gene Smpd1 codifica per un solo trascritto che a seguito di modificazione post-translazionali si esprime in almeno due proteine attive nella degradazione di SM. La differenziazione avviene nell’apparato di Golgi dove in alcune molecole residui di mannoso vengono fosforilati, mentre in altre ciò non avviene.
  19. 19. In alcune molecole della proteina residui di mannoso della catena oligosaccaridica in via di formazione vengono addizionati su C6 di radicali fosfato. Le molecole di ASMase con mannoso-fosfato vengono veicolate al lisosoma a mezzo recettore, oppure portate alla membrana all’interno di endosomi, quelle con mannoso non fosforilato vengono traslocate via vescicole secretorie direttamente alla membrana plasmatica. Ne consegue che in soggetti con NPD le membrane, in particolare quella plasmatica, delle cellule neuronali inclusi gli oligodendrociti, e quindi la mielina, accumulano SM in quanto il suo turnover sarà pregiudicato dalla presenza delle due forme di ASMase con attività precaria.
  20. 20. Modello animale della malattia di Niemann Pick di tipo A (NPD-A) Attualmente esistono due modelli animali di NPD-A rappresentati da topi in cui il gene di ASMase, SMPD1, è stato inattivato; questi animali sono identificati come topi knockout per il gene o topi ASMKO. Nei tessuti di questi animali l’attività di ASMase è del tutto assente. Il fenotipo del topo ASMKO riflette da vicino quello di soggetti affetti da NPD-A; come nel caso umano il topo ASMKO alla nascita apparentemente è indenne da alterazioni di qualsiasi tipo; i danni neurologici compaiono intorno al terzo mese di vita post natale, aumentano rapidamente nei mesi successivi in cui i danni neurologici si rendono sempre più manifesti e si identificano con accumulo di SM nel cervello, in toto e nello specifico nella mielina, alterazione dell’assetto degli glisfingolipidi, ipomielinizzazione, atrofia cerebellare e morte delle cellule di Purkinje. Su questo modello il laboratorio in cui risiedo da anni ha svolto indagini approfondite di recente pubblicate che hanno fornito una spiegazione circa la mancanza di sintomi alla nascita osservata nel nostro studio sull’animale transgenico, documentata ampiamente in soggetti con NPD-A.
  21. 21. Alterazioni metaboliche La ricerca, che si è focalizzata su 4 proteine tipiche della mielina, MBP,PLP, MAG, CNP, prodotti dell’attività metabolica degli oligodendrociti, ha messo in evidenza come alla nascita l’ammontare di queste proteine nella mielina e nel cervello del topo AMSKO è confrontabile con quello del topo di controllo, mentre si riduce significativamente a partire dal primo mese in avanti; questa riduzione si accompagna con accumulo progressivamente più marcato di SM nella mielina e nel cervello in toto; alterazioni evidenti riguardano anche alcuni glicosfingolipidi. Questo quadro non è riportabile ad una riduzione in termini numerici degli oligodendrociti, bensì ad una loro ridotta attività metabolica (Figura). E’ probabile quindi che la ipomielinizzazione osservata nel soggetto affetto da NPD-A soltanto intorno al sesto mese rifletta anche anche in questo caso una ridotta attività metabolica degli oligodendrociti che si instaura solo dopo la nascita.
  22. 22. Possibili modalità di trattamento Terapia Una terapia specifica per NPD è in fase di progettazione per la forma B mentre è solo ipotizzata come possibile per la forma A. Questa differenza è dovuta al fatto che per essere efficace nel caso di NPD-A il principio attivo deve superare la barriera emato-encefalica praticamente refrattaria a innumerevoli molecole in particolare a proteine. La terapia ERT è stata sperimentata sull’animale transgenico con scarso successo utilizzando una ASMase ricombinante sia immessa come tale in circolo, sia veicolata in combinazione con diversi supporti (liposomi, particelle di differente natura). L’ostacolo principale ancora una volta è stata la barriera emato-encefalica ed il recettore per l’enzima a livello della membrana scarsamente recettivo. La terapia genica con introduzione del gene SMPD1 clonato e veicolato da particelle virali inattivate è in fase di sperimentazione sul topo ASMKO. Del pari sono in progetto terapie di tipo SRT utilizzando composti in grado di ridurre la sintesi di SM o potenziare l’attività residua di ASMase nelle forme NPD-B (EET); da ultimo un nuovo approccio concerne il tentativo di stabilizzare l’enzima difettoso prevenendone la demolizione mediante inibitori di proteasi specifiche quali ad esempio il proteasoma, la proteasi specifica della via proteolitica ubiquitina dipendente (UBS).

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