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Parte 06 del Módulo IV del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Dr. Carlos Esquerre Aguirre
Fecha: 13 de Setiembre de 2015. Trujillo - Perú.

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6 Investigacion de anticuerpos irregulares

  1. 1. DIPLOMADO EN HEMATOLOGÍA Y BANCO DE SANGRE MÓDULO IV (13 de Setiembre de 2015) CLASE 6
  2. 2. 2 INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES
  3. 3. GENERALIDADES  Los aloanticuerpos antieritrocitarios, diferentes de los Ac naturales anti-A o anti-B se denominan inesperados o irregulares.  Un aloanticuerpo es aquél Ac que se produce como resultado de la exposición de un organismo a Ag extraños. Desde el punto de vista de la medicina transfusional, los Ac contra los Ag sanguíneos se clasifica como: 3
  4. 4. GENERALIDADES  Ac contra Aloantígenos: Los que se producen contra Ag de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.  Ac contra los propios Ag del individuo: Autoanticuerpos contra Ag. eritrocitarios y plaquetas y los producidos en enfermedades autoinmunes. De tal forma se considera a los anticuerpos autoinmunes como anticuerpos irregulares o adquiridos y a los aloanticuerpos los podemos dividir en: 4
  5. 5. GENERALIDADES  Regulares naturales: producidos con el Sistema ABO (anti-A y anti-B).  Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1, anti-E, entre otros.  Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh-Hr (anti-D, anti-c, anti-C y otros), anti-Kell, anti-Duffy. 5
  6. 6. GENERALIDADES  Ac naturales regulares: Preferentemente Ig M. Fijan de manera eficiente el complemento. Pueden provocar lisis intravascular insuficiencia renal e incluso la muerte del paciente. 6  Ac adquiridos o inmunes : Generalmente Ig G. Producen hemólisis extravascular en el bazo o en el hígado, mediante fagocitosis del complejo eritrocito + Ac.
  7. 7. 7 Son aquellos capaces de inducir reacción hemolítica con acortamiento “in vivo” de la vida de los hematíes incompatibles o en la EHRN. Sinónimo: Aloanticuerpos. Por estimulación antigénica: – Transfusión de hematíes – Embarazos o abortos – Mecanismos desconocidos Incidencia: – Población general 0,3 a 2,0%. – Politransfundidos 9%. ¿Qué son Anticuerpos Irregulares? ¿Cómo se forman los aloanticuerpos? 37°C C’
  8. 8. 8 ¿Son importantes? Ac. considerados importantes o potencialmente peligrosos de significado clínico: – Anti-D (D, C, c, E, e), Kell, Duffy, SsU, Diego (Dla) Ac. que pueden ser de significado clínico o importancia cuestionable: – Anti-Lea, Leb, -M, -N, -P1, I, Cartwright. Ac. que casi nunca presentan significado clínico o sin importancia: – Anti-Ch/Rg (Chido/Rodgers), York (yka), Sda, Xga, Bg.
  9. 9. 9 ¿Cuándo estudiarlos? Suministro de sangre compatible: Type & Screen (GS + Detección anticuerpos). Evaluación prenatal: Mujer Rh- sin anti-D (inmunoprofilaxis) ó ↑↑ título (evaluación fetal). Evaluación de la EHRN: Identificar la causa. Evaluación de anemias hemolíticas: Causa, clasificar, sangre compatible, aloanticuerpos escondidos. Resolución de reacciones transfusional hemolítica: Investigación de la causa, reacción tardía (10 Ac/GR)
  10. 10. 17/09/2015 10 Objetivos de Investigar Anticuerpos - Conocer la presencia de anticuerpos clínicamente significativo fuera del sistema ABO. - Obtener los conocimientos teóricos y básicos para la realización de esta prueba. - Comprobar que los pacientes no tengan anticuerpos no esperados (anticuerpos irregulares). Los únicos esperados deben ser los correspondientes al Sistema ABO. - Asegurar la supervivencia de los hematíes y minimizar los riegos para la salud del paciente.
  11. 11.  Aglutinación en medio macromolecular (albúmina, dextrán, gelatina, polivinilpirrolidona- PVP); la albúmina incrementa la constante dieléctrica del agua, lo que disminuye el potencial Z. El dextrán y el PVP potencializan la reacción con puentes de polímeros.  Prueba Coombs; es útil para poner de manifiesto anticuerpos incompletos o sensibilizantes.  Soluciones de baja fuerza iónica; reducen la barrera electroestática facilitando la reacción Ag- Ac. 11 ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIÓN Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS IRREGULARES
  12. 12.  Enzimas; potencializan la reacción Ag-Ac reduciendo la superficie de carga y removiendo estructuras que interfieren en el acceso de las moléculas del Ac.  Centrifugación; acelera la reacción Ag-Ac, por la fuerza que produce la misma.  Temperatura; afecta la reacción Ag-Ac de acuerdo a la T° óptima de reacción: 4 a 22°C para los Ac fríos, o 37°C para los Ac calientes.  Proporción de Ag-Ac; importante en la búsqueda de la zona de equivalencia de la reacción Ag-Ac. 12 ELEMENTOS QUE INFLUYEN EN LA REACCIÓN Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS IRREGULARES
  13. 13. 13 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR CÉLULAS PANTALLA Reactivos:  NaCl 9%  Suspensión de GR del donante 5%  Célula Pantalla I  Célula Pantalla II  Albúmina 22%  Antiglobulina humana poliespecífico  Célula Control de Coombs IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR CÉLULAS PANEL Reactivos:  NaCl 9%  Suspensión de GR del donante 5%  Células Panel  Albúmina 22%  Antiglobulina humana poliespecífico  Célula Control de Coombs Sinónimos: Detección, pantalla, escrutinio, pesquisa, rastreo, screening, tamizaje, Coombs indirecto.
  14. 14. 17/09/2015 14 Células que se utilizan para detección de anticuerpos antieritrocitarios. Generalmente vienen identificadas con números romanos I,II, III. Son preparadas a partir de sangre donada por individuos de grupo sanguíneo O. CÉLULAS PANTALLA CÉLULAS PANEL Son glóbulos rojos seleccionados con antígenos de grupo sanguíneo conocidos. Provienen de distintos individuos. Para ser funcional el panel de glóbulos rojos debe identificar con certeza los aloanticuerpos significativos.
  15. 15. Panel
  16. 16. 17/09/2015 16 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR CÉLULAS PANTALLA
  17. 17. 17 Técnica en Tubo Enumerar los tubos como I, II, III según sea el caso 2 ó 3 células. Fase Salina 2 gotas de suero + 1 gota de GR, centrifugar y leer. Fase Térmica o Albúmina 2 gotas de Albúmina al 22% e incubar (37°C x 30’). Centrifugar y leer. Fase Coombs o AGH Lavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar. 2 gotas de suero Coombs (AGH). Centrifugar, leer e interpretar. Si en negativo adicionar 1 gota de Célula Control Coombs.
  18. 18. 18 Técnica en Gel En un microtubo (LISS/Coombs): - 50 ul de GR - 25 ul de suero/plasma - Incubar 37°C x 15 minutos - Centrifugar y leer.
  19. 19. 19 Interpretación de los Resultados : Células Pantalla Negativo: La reacción negativa en todas las células indica la ausencia de anticuerpos irregulares. Positivo: Una reacción positiva en 1 ó 2 células y un autocontrol (-) hace pensar la presencia de un aloanticuerpo. Donde hay una reacción positiva en todas las células de la prueba y un autocontrol (+), puede ser debido a un autoanticuerpo.
  20. 20. 20 IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR CÉLULAS PANEL
  21. 21. 21 Técnica en Tubo Enumerar tantos tubos como muestras tenga el panel (1,2,3,4, hasta 11 o según sea el caso más células). Fase Salina 2 gotas de suero problema + 1 gota de GR del reactivo panel, en cada uno de los tubos rotulados. En el tubo para el autocontrol colocar 1 gota de GR al 5% del propio paciente, mezclar, centrifugar y leer. Fase Térmica o Albúmina 2 gotas de Albúmina al 22% e incubar (37°C x 30’). Centrifugar y leer. Fase Coombs o AGH Lavar 3 veces con SSF 0.9%. Decantar. 2 gotas de suero Coombs (AGH). Centrifugar, leer e interpretar. Si en negativo adicionar 1 gota de Célula Control Coombs.
  22. 22. 22 Interpretación de los Resultados : Células Panel POSITIVO: La aglutinación presente en 1 o más tubos del panel con autocontrol (-). Nos indica la presencia de 1 o más Ac de los Ag presentes en el panel. NEGATIVO: Ninguna aglutinación en todos los tubos indica la ausencia de Ac perceptibles a los Ag listados en el panel. AUTOCONTROL POSITIVO: Indica presencia de autoanticuerpo. TÉCNICAS ESPECIALES: Como autoabsorción (elución) pueden ser requeridas para revelar el aloanticuerpo subyacente.
  23. 23. 23 Ejemplo: INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES I II III
  24. 24. 24 DETECCION DE ANTICUERPOS IRREGULARES 4 posibilidades F S F A F 3 7 ° F C - - + + - - - -
  25. 25. 25EN ESTE PANEL SE IDENTIFICA QUE EL ANTICUERPO TIENE ACTIVIDAD EN FASE 37°C Y CON EL SUERO ANTIGLOBULINA HUMANO: ES TIPO Ig G. descartados F S F A F 3 7 FC - - + + - - + + - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - - - - - + + - - + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
  26. 26.  ¿ES LO MISMO UN AUTOANTICUERPO QUE UN ALOANTICUERPO? Un autoanticuerpo : anticuerpo que esta dirigido contra antígenos propios del paciente, pueden ser específicos (el paciente presenta un fenotipo Rh: EeC y presenta anti-e, anti-E) e inespecíficos (panaglutininas: aglutinan todo con una característica homogénea).  Un aloanticuerpo es un anticuerpo que esta dirigido contra un antígeno que el paciente no posee. (El paciente presenta un fenotipo Rh: ECc y presenta un anti-e)
  27. 27.  REALIZAR LA PRUEBA DE COOMBS DIRECTO (CD) Esto es para discernir entre la presencia de un posible autoanticuerpo o un aloanticuerpo.  CD (+): Posibilidad de estar frente un autoanticuerpo o un aloanticuerpo + autoac ¿De que dependerá? Historia transfusional del paciente¿Ha recibido unidades de sangre?  Sí (no descartar los aloanticuerpos, siempre y cuando el tiempo de la transfusión no exceda de los 90 días)  No (descartar los aloanticuerpos)
  28. 28. FINALIDAD * Detección de Anticuerpos Incompletos (IgG) dirigidos contra antígenos del Glóbulo Rojo. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
  29. 29. FINALIDAD * Detección de Fracciones de Complemento Fijados en la membrana del Glóbulo Rojo. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA C3d C3b C3d C3b C3d
  30. 30. En resumen: El principio de la prueba de A.G.H es detectar inmunoglobulinas de la clase Ig G y/o fracciones del Complemento unidos a los glóbulos rojos.
  31. 31. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD) FINALIDAD * Detección de GR sensibilizados “in vivo” - Anticuerpos y/o Complemento fijados en la membrana del GR en el torrente sanguíneo.
  32. 32. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD) = GR sensibilizados “in vivo” Suero de Coombs poliespecífico (Anti-IgG Anti-C3d) REACCIÓN POSITIVA
  33. 33. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD) o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD) APLICACIONES DEL TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD) 1.- Investigación de Reacc. Hemolíticas Transf. 2.- Investigación de E. H. R. N. 3.- Investigación de A. H. A. I. 4.- Investigación de Anemias Hemolíticas inducidas por Drogas.
  34. 34. Interpretacion: Si la prueba muestra aglutinación , se interpreta POSITIVA, significa que hubo sensibilización IN VIVO de los eritrocitos y se informa: PAD Positiva , señalando en cruces la intensidad de la reacción, por ej. 4 + Si no hubo aglutinación, la prueba es NEGATIVA, y significa que no hubo sensibilización IN VIVO
  35. 35. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS EQUIVALENCIA ENTRE EL GRADO DE AGLUTINACIÓN Y EL SCORE Grado de Aglutinación Score 4 + 10 3 + 8 2 + 6 1 + 4 1/2 + visibles a simple vista 3 1/2 + visible al microscopio 1 0 o ausencia de aglutinación 0
  36. 36. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS IMPORTANCIA DEL TÍTULO Y SCORE TÍTULO del test de Coombs (Anti- IgG) 2 4 8 16 32 64 SCORE 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 46MUESTRA 1 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 26MUESTRA 2 TÍTULO del test de Coombs (Anti- IgG) 2 4 8 16 32 64 SCORE 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 48MUESTRA 1 4+ 4+ 3+ 3+ 1+ 1+ 44MUESTRA 2 Caso 1 Caso 2
  37. 37.  CD: 2+  CD Monoespecífico IgG IgA IgM C3c C3d Ctl 2+ 0 0 0 0 0
  38. 38. Existen una serie de técnicas que permiten realizar procedimientos que proporcionan ayuda en ciertas determinaciones. Las uniones Ag Ac se rompen por medios físicos ó químicos (éter,xileno,digitonina)   Elución por calor (Físico).   Elución por glicina ácida (químico).   Elución por cloroquina (químico).   Absorción
  39. 39.  Elución por calor: Consiste en disociar los anticuerpos adosados al hematíe aplicando calor (56 °C) por un tiempo de 10 min. Los hematíes se incuban en una solución de albumina al 6% v/v en un tubo de vidrio en constante agitación, luego se centrifuga por 5 min a 3500 rpm y el sobrenadante obtenido se denomina eluato.  Ventajas: se puede trabajar el eluato a manera de suero se puede enfrentar a pantalla para determinar que ac es y también se puede trabajar con los hematíes tratados.  Desventajas: ocasiona hemólisis de los hematíes y se corre el riesgo de perder sitios antigénicos.
  40. 40.  Elusión por Cloroquina Mediante esta técnica se puede realizar el desprendimiento de los anticuerpos y despejarlos de los hematíes, se agrega un volumen de hematíes lavados frente a cuatro de cloroquina y se deja a T°ambiente por una hora.  Ventajas: los hematíes no son sometidos al calor y se trabajaría con ellos.  Desventajas: No se puede trabajar con el eluato
  41. 41. CD de los hematíes
  42. 42. ¿Cómo saber que tipo de técnica de elución utilizar?  Dependerá de lo que se quiera realizar y con lo que se desee realizar.  Si se desea realizar autoabsorciones utilizando los hematíes del paciente: elución por calor/ cloroquina.  Si sólo deseo trabajar con el eluato: elución por calor.
  43. 43. ¿Qué es una autoabsorción?  Consiste en enfrentar el plasma del paciente con los hematíes eluidos con la finalidad de disminuir la cantidad de autoanticuerpos del plasma (plasma autoabsorbido).  Tiene como finalidad dejar limpio el plasma de autoanticuerpos para poder evidenciar la presencia o ausencia de aloanticuerpos en el paciente.  En px, Si al exponer a la pantalla es( +): se trata sólo de autoac + aloanticuerpos; si es (-), sólo se trató de autoanticuerpos.
  44. 44.  La detección de un Ac y su identificación, constituyen una de las prácticas más interesantes en el campo de la Inmunohematología.  Muchos de éstos Ac son problemas complejos, que requieren ciertas facilidades en el laboratorio para su resolución y de parte del investigador, exigen tiempo y experiencia. 44 CONCLUSIONES:

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