Diluciones y graficas

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Diluciones y graficas

  1. 1. Introducción:El trabajar con diluciones es algo rutinario en un laboratorio de biología molecular e investigación ya sea porquenecesitas concentraciones muy pequñas para pesar y medir por lo que tienes que partir de una solución masconcentrada a una menor o porque las soluciones comerciales vienen a unas concentraciones (stocks) altas y seusan a unas concentraciones (working) mas ligeras. Igualmente en el conteo de células o bacterias para sembrar ocuantificar se usa mucho el concepto de diluciones en serie.Diluciones:Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo y añades mas solvente, bajando laconcentración del soluto. Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal! Revisael trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó. C1V1=C2V2Lo importante aqui es definir las variables bien.Ej: Si tienes un buffer de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua. Cual es laconcentración final de la nueva solución o de la dilución? Para esta fórmula necesitas 3 de las 4 variables;C1= concentración inicial, 0.2MV1= volumen inicial, 10mlC2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan!V2= volumen final, _____ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final, es 100ml.Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. - Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto más diluído está unasolución resultante preparada a partir de una solución stock o mas concentrada. Se calcula como el volumen finaldividido entre el volumen inicial (el que tomastes del concentrado). Cual es el factor de dilución en el ejercicioanterior? 100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; o sea 0.1 o sea diluido 10 veces!,Una vez tienes el factor de dilución, que se hace con el? - ó lo multiplicas por la C1 C2=C1 x fd C2= 0.2M x 0.1 = 0.02M - ó divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2= 0.2M/10 = 0.02M - la [ ] sera 1/10 de la original!Diluciones Múltiples: Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula de la siguienteforma: Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3Calculando el FD para cada paso de la serie y luego multiplicando los tres factores de dilución FDTotal= 10x25x3= 750 a 1Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentración: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM ó ________________________Gráficas Generalmente los resultados de experimentos se reportan o resumen en forma de gráficas. Repasaremoscomo hacer gráficas manuales y por computadoras.Manual: Una gráfica es una representación de la relación entre dos variables ó 2 cantidades. Una es la que secontrola, se llama variable independiente y se coloca en el eje de X. La otra cantidad es la que cambia conformecambia la independiente, se le llama variable dependiente y se coloca en el eje de Y. 1
  2. 2. Ejercicio: Se colocaron distintas cantidades de proteína en una serie de tubos y por espectrofotometría se midió laabsorbancia. Cuál es la variable independiente? La dependiente? Prepara una gráfica donde se representa p(proteina) vs q (Absorbancia), donde p va en x y q en y usando papel de gráfica. (Recuerda poner título, leyenda ydescripción de que es lo representado en la gráfica) Data: Concentración de proteinas Absorbancia (mg) 0.001 0.05 0.003 0.16 0.005 0.225 0.007 0.33 0.008 0.375Dibujar la Línea y La EscalaDebes conocer algo sobre el sistema y los resultados esperados. Por ejemplo con el ejercicio de proteina se esperauna línea recta, al menos hasta un límite de cantidad (ug) de proteina en el tubo. Asi que se espera o se trata dedibujar una linea recta, la mejor que pase por los puntos. Se hace por computadoras, con una calculadora conestadísticas que saca pendiente e intercepto, o al ojo, pero NO uniendo todos los puntos con una línea en zigzagtiene que ser una recta. Si la relación que se espera es una lineal, la mejor línea será determinada por una regresiónlinear, (operación que reduce la distancia entre la línea y los puntos que debe tocar). Esto tambien se conoce comoel método de los cuadrados mínimos. Explicar dicho método está fuera del objetivo de este ejercicio se asume queusted ya lo conoce.A veces el problema esta en comorepresentar los números en la gráfica por el Titulonúmero de ceros. Lo mejor es usarexponente o en este ejemplo, cambiar la 0.4unidad de mg a μg. 0.35 0.3Otro punto importante es la escala. A 0.25 Abs (x10)cuantos cm equivale un ug por ejemplo? Y 0.2siempre hay que ser consistente en la 0.15misma gráfica, no hagas ajustes para 0.1acomodar data a la mala. También esimportante usar la gráfica completa y tratar 0.05de que el ángulo de la línea sea lo mas 0cerca a un angulo de 45o. 0 2 4 6 8 10 ug protein (x1000)Los ejes tienes un X 10 o X1000, que dicenlo que se ha hecho con los números queestán en el eje. Se multiplicaron por 10 o por 1000. Asi que el eje de x indica que el valor representa el número de ugde proteina multiplicado por 1000. Cuales fueron las medidas originales de Abs?En cuanto al 0, mucha gente piensa que debe ser un punto en la gráfica siempre, hay veces que si y hay veces queno. Por ejemplo prepara la siguiente grafica. Se está graficando log de peso molecular de un fragmento de DNA vssu mobilidad en una gelatina.Mobilidad LogMW MW6 4.18 15,0002.9 4.6 40,0001 4.82 66,0000.1 4.95 90,000Si la gráfica se comienza en el origen (0) se vera comprimida en el eje de Y, si la comenzamos de 4 en adelante seusa mucha mas area. 2
  3. 3. 6 5 4.9 5 4.8 4 Log MW 4.7 3 4.6 2 4.5 1 4.4 0 4.3 0 2 4 6 8 4.2 4.1 Mobilidad (cm ) 0 2 4 6 8 Mo b ilid ad ( c m)Nota la diferencia entre la distribución de la data en el toda el área de la gráfica. El error al tratar de interpolar enla gráfica será mayor mientras menos area de esta se use.Escalas logarítmicas:Para hacer gráficas con estas escalas se puede utilizar papel “semilog”, el cual prácticamente hace los cálculos parauno. Este viene divididos en ciclos. En cada ciclo se puede poner la data que caiga dentro de una potencia de 10. Ladata desde 15000 a 90000 cae toda dentro de un ciclo (10000 a 100000). Si quieres incluir también a 200000,necesitas otro ciclo. En un papel logarítmico tu colocas los números 15000, 40000 etc directamente en la gráfica enY. NO trates de poner 4.18, 4.60 … etc en el papel log.! MW 100,000 10,000 0 1 2 3 4 5 6 7Puntos de data corruptos ugEscojer cuando estos puntos existen es algo que se puede hacer mejor a ojo que a proteina Absorbanciacomputadora.Si tu quieres poner en gráfica los datos de la tabla a la derecha tu notarás 0 05 de los 6 puntos caerán perfectamente bien en la línea recta. Pero un punto va a estarbien afuera. La mayoría de los programas de computadoreas dibujarán un línea 10 0.1incluyéndolo, cuando en realidad no se debe incluir. Lo que se debe hacer es o repetir la 20 0.2lectura de 30 ug ó hacer la línea sin incluirlo y si usando los otro 5 puntos. Obviamente 30 0.05la linea que mejor recoge la tendencia de esta data es la que no lo incluye . Como será 40 0.4la línea si eliminas el punto (30, 0.05). Demuestrálo. 50 0.5 3
  4. 4. Chart Tit le 0.6 0.5 Graficas con computadoras 0.4 La mayoría de las computadoras que tenemos en nuestras 0.3 0.2 casas u oficinas incluyen un paquete de programas que traen un 0.1 “spreadsheet” que trae capacidad para hojas de hacer cálculos y 0 graficar. Entre programas para este tipo de análisis están -0.1 0 10 20 30 40 50 60 Sigmaplot, Quatro, SPSS, y Excell. En nuestro lab lo mas que ug de prot e ina s tendremos oportunidad para usar es Excel asi que ese será el ejemplo para seguir.El primer paso es colocar la data en la página de cálculos. Columnas identificadas por Letras y líneas identificadaspor Números. Cada combinación entre estas es una celda. La data debe estar como en la tabla que sigue.Ug de proteina Absorbancia Al subir el programa Excell te abre una página vacía con0 0 celdas. Puedes poner o no titulos a la columnas. Coloca lo10 0.1 que va en el eje de X en la columna de la izquiera Asi se20 0.2 verá en Excell.30 0.2940 0.4050 0.52Para crear la gráfica luego que tengas la data en la hoja es cuestión de seguir las instrucciones del programa. - En primer lugar seleccionar las celdas que incluyen la data que ira en la gráfica. Ej desde A1 a A6 y B1 a B6, todo junto. - Luego hacer click en el ícono de chart, escoger el tipo de gráfica (línea, barra, pie) - Escoges “scatter plot” que no tenga líneas sobre la data, la que tiene líneas busca un 0,0. - Le das next y te pregunta la fuente de la data, esta fue seleccionada ya, asi que next - Lo próximo sería formatear la gráfica para ver como va a lucir (titulo, rotulos de los ejes, etc) la mini gráfica te da una idea de como se ve. Puedes ir adelante y atrás si cambias de idea. - Luego escojes incluirla en la misma hoja de cálculos o en hoja aparte. Abs vs ug de proteina Abs vs ug de proteina 0.6 y =0.0102x - 0.0024 0.6 R2 =0.9976 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0 0.1 -0.1 0 10 20 30 40 50 60 0 ug pro t e ina s 0 10 20 30 40 50 60 ug p rot e ina sHasta el momento la gráfica se verá como la de la izquierda. Como verás no hay línea que conecte los puntos paraque la máquina no una los puntos. Asi escogeremos la regresión lineal que asegura la línea que major pasa por lospuntos. Para hacer la linea: - escojer en “chart” en los menus superiores y luego “add trendline”. Lo que sale ahora te da varias opciones incluyendo la linea recta de regresión. 4
  5. 5. - Ademas de esto escojes en “option” para que puedas presentar en la grafica la ecuación y el coefficiente R de regresión. - La gráfica se vera como la de la derecha.Graficas No-lineares Que hacer si la gráfica no presenta una relación lineal? La Vel Conc 1/Vel 1/Concgráfica la harás igual que siempre pero usarás el wizard de gráficas 0.25 0.083 4 12.04819para adaptar la gráfica. Por ejemplo analiza un experimento de 0.5 0.127 2 7.874016cinética de enzimas. Cuando se representa la velocidad de unaenzima vs la concentración de sustrato, se obtiene una relación 1 0.158 1 6.329114hiperbólica (abajo izq). Luego que creas la gráfica sin línea, añades 2 0.178 0.5 5.617978“trendline” como antes. Para gráficas hiperbólicas no hay un menu 4 0.203 0.25 4.926108ideal. Lo mejor que se puede hacer es escojer “logarítmica” en 5 0.249 0.2 4.016064trendline. Y saldrá una curva hiperbólica. Esta se ve razonable, soloque es una función logarítmica. Una gráfica logarítmica es curva como una hiperbólica pero la equación no parea. Sise intenta interpolar valores dara resultados erróneos. Se puede usar el “spreadsheet” para manipular la data de lasiguiente forma.Si tomas el recíproco de la data y esta es la que pones Vel vs Concentracion de Sust.en la gráfica estarás haciendo una gráfica Lineweaver- 0.3 Velocidad (um ol/m in)Burk (abajo). Si ahora usas el “trendline podrás hacer y = 0.0481Ln(x) + 0.1534 0.25una linea recta que se extenderá cruzando el eje de y 0.2hasta interceptar el eje de X. De alli podrás obtenerconstantes cinéticas de la gráfica y valores como Km y 0.15Vmax. 0.1 0.05La capacidad para intrapolar dentro de la gráfica es 0posible con la línea recta en lugar de la hiperbole. 0 2 4 6 [ ] sustrato (m M)Barras de Errores en GráficasUn aspecto que le da mayor validez y solidez a resultadospresentados en forma de gráfica es el poder incluirles Linew eaver-Burk Reciprocal Plotanálisis estadísticos en ellas. Entre los análisis y = 1.9446x + 4.2253estadisticos mas comunes estan el promedio y la 15desviación o el error estandar. Ambas son medidas de 10dispersión que permiten tener una idea de cuanto se 1/ Veldesvian o alejan del valor promedio las muestras 5analizadas en la prueba. 0 -5 -3 -1 -5 1 3 5En el siguiente ejemplo se realizaron unas medidas entriplicado de conteo radioactivo para 4 muestras.. Prepare 1/[ ] sustratola gráfica donde presente individualmente cada muestra.Calcule el promedio para cada muestra y la desviaciónestandar y prepare la gráfica donde solo se presenten los promedios. Incluya en esta última las barras de errores enY con el valor de la desviación estándar.Coloque la data en el “spreadsheet” como se muestra. Luego para la gráfica de barra utilice el Wizar deExcell escojiendo la opción de graficas de barras. Prepare la siguiente data en una gráfica de barras: Control 3H DDT DEHP 1000 8000 4500 7000 1500 7500 5000 7500 1250 9200 6000 6500 5
  6. 6. Radioactividad Desplazada por EDCs 10000 10000 8000 8000 Series1 6000 6000 Series2 CPMs 4000 4000 Series3 2000 2000 Series4 0 0 Cont rol 3H DDT DEHP Control 3H DDT DEHPSi le da next a todos los pasos la grafica que saldra es la de la izquierda que muestra como comparan los valores decada medida con los de su grupo (1000, 1500, 1250; 8000, 7500, 9200; etcetera) pero esto no dice mucho sobre elresultado general del experimento porque estos valores son repeticiones (triplicados) de una misma prueba.Lo correcto aquí seria obtener el promedio de cada grupo (control, 3H, DDT, DEHP) y comparar estos promedios.Para esto haremos uso de las funciones y formulas de Excell para calcular. Colocas el cursor en la celda debajo de1250 y les das “insert” “function”. Aquí abren dos columnas, a la izquierda categorías de formulas (escoge Statistics)y a la derecha las formulas de esta categoria (escoge Average). En la linea de number 1 seleccionas las celdas quecorresponden a los 3 valores para control, enter y te coloca en la celda el valor del promedio de esos tres datos.Haces “copy” a esa celda, seleccionas las otras 3 celdas a la derecha y haces “paste” y verás que hace el mismocálculo para los otras celdas. A la izquierda rotula con AVG. Has la gráfica de barra pero solo seleccionando losvalores en AVG para cada muestra (arriba, derecha).Ahora en la celda debajo del AVG para control, insertas la función para STDEV. Escoje las mismas celdas queusastes para calcular el AVG del control y de las otras 3 muestras. La hoja presentará ahora la desviación estandarde cada promedio. Para incorporar este valor a la gráfica de barras haces doble click sobre cualquiera de lascolumnas de la nueva grafica y abre un menu donde escogerás, “Y error bar”. Luego escoges custom y alli pones elcursor al lado del signo + y seleccionas las celdas con los STDEV y luego lo pones al lado del signo (-) y colocas lasmismas celdas, OK. En las columnas saldrá una barra vertical que dice que ese promedio puede subir hasta unmáximo o bajar hasta un mínimo, o sea fluctuar por la cantidad del STDEV como un mas o menos.Preguntas para contestar:Como las ecuaciones de las lineas rectas se pueden usar para predecir resultados?Prepara las misma graficas menos las ultima en papel de gráfica manualmente.Prepara una grafica con la siguiente data de forma manual y en la computadoraUg de prot Absrobancia0 02 0.124 0.286 0.408 0.5210 0.6312 0.72Usa la ecuación de la recta de esta ultima data para interpolar, calcula los μg de proteínas en muestras que leen Absde 0.45 y 0.25. 6

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