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    1. 2. 第一部分 高通量基因组技术在农林领域中的应用 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com
    2. 3. 讲座主要内容 <ul><li>基因组学发展历史回顾 </li></ul><ul><li>高通量基因组学技术简介 </li></ul><ul><li>高通量基因组学技术应用 </li></ul>06/08/09
    3. 4. 一、基因组学发展历史回顾 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    4. 5. 回顾基因组学的不寻常历程 06/08/09 人类基因组研究战略和实验技术源源不断地产生了日益庞大及复杂的基因组数据,这些数据已被载入公共数据库,并改变了对几乎所有生命过程的研究。
    5. 6. 利用已有基因组数据对转录组进行注释 06/08/09
    6. 7. 基因组学开创了新的研究时代 06/08/09 遗传学、比较基因组学、高通量生物化学和生物信息学的交织进展,为生物学家提供了一系列显著进步的研究工具,可以使生物体的功能在前所未有的分子细节上得到详尽的分析和理解。基因组序列这一指导生物发育和发挥功能的信息综合体,是当今生命科学革命的核心。
    7. 8. 人类基因组计划是基因组学的基石 06/08/09 ELSI : Ethical , legal and social implications 法律和社会应用 Nature , 2003 , 422 : 835 - 847
    8. 9. 基因组学和高通量筛选方法的出现改变了生物学家提出问题的方式 06/08/09 基因组 转录组 蛋白组 相关分析 聚类分析 功能分析 方差分析 多参数分析 主成份分析 核酸多态性 拷贝数变异 表达谱差异 大量实验数据的迅速产生,使得对生命现象进行多角度,多层次的网络分析成为新的研究方法,对生命科学的研究从个体走向系统。
    9. 10. 二、 基因组时代的高通量技术 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    10. 11. 基因组时代的高通量技术 <ul><li>前基因组时代分子生物学经典实验技术 </li></ul><ul><li>Polymerase Chain Reaction ( PCR ) </li></ul><ul><li>Northern/Southern </li></ul><ul><li>Dot blot </li></ul><ul><li>DNA Sequencing </li></ul><ul><li>经典实验技术的高通量革命 </li></ul><ul><li>Microarray </li></ul><ul><li>High Throughput sequencing/next generation sequencing/deep sequencing </li></ul>06/08/09
    11. 12. 生物芯片技术 <ul><li>生物芯片的概念由 Fodor , ( Science, 1991, )等人在 1991 年提出 , 是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件 </li></ul>06/08/09 它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法 , 只是由于其所处理和分析的对象是生物样品 , 所以叫生物芯片 (Biochip) 。
    12. 13. 生物芯片的分类 DNA 芯片 cDNA 芯片 Oligo 芯片       信息 生物芯片   多肽芯片 生物 芯片   微流体芯片 功能 生物芯片 芯片实验室 组织芯片   蛋白芯片   抗体芯片   蛋白质芯片 SAGE/CAGE epigenetics 芯片 质粒 microarray Oligo 芯片 基因组 genetics 转录组 mRNA
    13. 14. 高通量测序技术 <ul><li>是传统 Sanger 法测序的高通量革命 </li></ul><ul><li>代表产品, Roche 454 , illumina Solexa , ABI SOLiD </li></ul><ul><li>目前一次运行的测序能力高达数十个 G 的碱基 </li></ul><ul><li>SOLiD 3 , 2009 年底冲击 150G 碱基 </li></ul>06/08/09 Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation
    14. 15. 三、高通量基因组学技术应用 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09 —— DNA 芯片技术 —— 高通量测序技术
    15. 16. DNA 芯片在基因组学中的应用介绍 <ul><li>基因组 </li></ul><ul><li>Single Nucleotide Polymorphism(SNP) , 单核苷酸多态性 </li></ul><ul><li>array-based Comparative Genomic Hybridization(aCGH) , 比较基因组 </li></ul><ul><li>Genome tiling , 基因组叠瓦 </li></ul><ul><li>Copy Number Variation(CNV) , 拷贝数变异 </li></ul><ul><li>ChIP-chip : DNA-protein interaction/DNA methylation , 蛋白质— DNA 相互作用 /DNA 甲基化 </li></ul><ul><li>转录组 </li></ul><ul><li>mRNA profiling , mRNA 表达谱 </li></ul><ul><li>microRNA profiling , microRNA 表达谱 </li></ul>06/08/09
    16. 17. Genome tiling 06/08/09 用芯片对水稻 4 号进行 tiling 分析,寻找水稻 6 个不同器官中发育阶段特异性和组织特异性的基因表达情况
    17. 18. 全染色体 tiling 实验的探针设计和芯片制作 06/08/09 1 、 PCR 扩增片段 2 、纯化鉴定 3 、直接点样
    18. 19. 实验结果 06/08/09 Lane 1, panicle; lane 2, flag leaf; lane 3, tillering shoot; lane 4, seedling shoot; lane 5, seedling root. 各个部位基因表达的聚类分析 A :染色体上平均每 100kb 距离内基因表达的平均强度,定量 B :染色体上平均每 100kb 距离内基因表达的比例,定性
    19. 20. 第二年同一个课题组 06/08/09 用芯片技术同时检测水稻的两条染色体基因组甲基化, H3K4 两重 / 三重甲基化,基因表达。揭示了水稻中,表观遗传学修饰,染色质结构和基因表达之间的联系。
    20. 21. mRNA 表达谱 06/08/09 利用表达谱芯片监测拟南芥在外界压力刺激下( Actinomycin D ),细胞内基因转录水平在各个时间点的下降情况,并对几种刺激(渗透压,物理损伤,遗传毒性,氧化和 UV-B )造成的影响进行了比对。
    21. 22. 实验结果 06/08/09 A : SOM 聚类,针对不同的时间点寻找表达谱模式类似的转录本。 B :整体聚类,同时和其他刺激进行了比对 渗透压,物理损伤,遗传毒性,氧化和 UV-B 照射。右侧的功能分类显示主要改变的功能,蛋白合成,代谢,转录,细胞间通讯,细胞间运输。
    22. 23. 06/08/09 有 12 个转录本在至少三种以上的刺激中重复出现,其中 5 个是与转录相关
    23. 24. SNP Array 06/08/09 Worldwide Human Relationships Inferred from Genome-Wide Patterns of Variation , Science 22 February 2008: Vol. 319. no. 5866 Genotype, haplotype and copy-number variation in worldwide human populations , Nature 451 , 998-1003 (21 February 2008) | 用 SNP 差异寻找人类迁移
    24. 25. Slide : June 8, 2009 拷贝数变异和精神发育迟缓 缺失 扩增 扩增 扩增 芯片筛查拷贝数变异区段 FISH (荧光原位杂交) aCGH and CNV
    25. 26. 三、 高通量测序技术的应用 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09 —— 高通量测序技术 —— DNA 芯片技术
    26. 27. 高通量测序技术在基因组学中的应用介绍 <ul><li>De Novo Sequencing 基因组测序 </li></ul><ul><li>Resequencing 重测序 </li></ul><ul><li>Transcriptome Analysis 转录组分析 </li></ul><ul><li>Gene Regulation Studies 基因调控 </li></ul><ul><li>Epigenetic Changes 表观遗传学 </li></ul><ul><li>Metagenomes & Microbial Diversity 宏基因组和分子生态 </li></ul>
    27. 28. 细菌基因组 de novo 测序 对棒状杆菌 DSM44385 进行基因组 de novo 测序,并对其基因组进行注释,绘制代谢图,初步了解亲脂杆菌在缺乏霉菌酸的条件的生理过程。
    28. 29. 利用已知数据库,对棒状杆菌 DSM44385 进行功能注释,并利用已有数据库构建了一个代谢通路。 参照已有数据: C. jeikeium K411 (red), C. urealyticum DSM7109 (blue), C.diphtheriae NCTC 13129 (green); 对 DSM44385 进行了基因注释 测序结果统计
    29. 30. Small RNA 深度测序 formation of trans-acting siRNAs (tasiRNAs) 用 microRNA 深度测序研究了拟南芥中的 RNA 干扰通路 通过全基因组的分析,证明拟南芥中 RNA 依赖的 类 RNA 聚合酶 6/dicer 通路 ( RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE6/DICER-LIKE Pathway ) ,是基于 microRNA 和 siRNA 的反式作用。
    30. 31. Small RNA 深度测序 陆生植物中不同种类,不同序列的 Small RNA 具有类似的功能。植物的小分子 RNA 在功能上有很高的保守性。
    31. 32. Digital expression profiling & microRNA re-sequencing : hESC : human embryonic stem cells EB : embryoid bodies Genome Res. 2008. 18: 610-621
    32. 33. ChIP-seq : Sequenced short reads (typically 25–50 bp) from ChIP-Seq experiments are first mapped onto the reference genome. The mapped reads are then used to estimate statistical parameters, which include the estimation of the average length F of sequenced DNA fragments. 用染色质免疫沉淀( ChIP )富集 DNA ,然后进行高通量测序( seq ),根据参比基因组数据,寻找新的蛋白质— DNA 结合位点。
    33. 34. 第二部分 SBC 综合解决方案 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com
    34. 35. 讲座主要内容 <ul><li>农林领域面临的基因组研究问题 </li></ul><ul><li>高通量技术在农林领域的研究策略 </li></ul><ul><li>应用实例 </li></ul><ul><li>SBC 的平台优势 </li></ul>06/08/09
    35. 36. 一、农林领域面临的基因组研究问题 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    36. 37. 1 、农林领域面临的基因组研究问题 <ul><li>个性化的物种 </li></ul><ul><li>实用性强的物种 </li></ul><ul><li>非实验模式生物 </li></ul><ul><li>没有商品化的芯片可以利用 </li></ul><ul><li>大量物种缺乏基因组信息 </li></ul><ul><li>研究对象大多未经大规模测序 </li></ul><ul><li>基因组信息不完整 </li></ul><ul><li>前期的人类基因组和模式生物基因组学研究为农林领域摸索出了一套快速高效的研究路线 </li></ul>06/08/09
    37. 38. 二、高通量技术在农林领域的研究策略 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    38. 39. 农林领域针对性的基因组学研究策略 06/08/09 有 没有
    39. 40. 充分享受高通量技术的比较优势 <ul><li>测序技术 </li></ul><ul><li>开放系统,具有发现能力和寻找新的信息的能力 </li></ul><ul><li>—— 快速、大量发现新信息的能力 </li></ul><ul><li>芯片技术 </li></ul><ul><li>封闭系统,能检测人们已知序列的特征 ( 或有限的变异 ) </li></ul><ul><li>—— 快速、高效检测已知信息的能力 </li></ul><ul><li>比较优势 </li></ul><ul><li>分析测序获得的信息 </li></ul><ul><li>制备芯片 </li></ul><ul><li>对样品进行快速,高通量,低成本的检测 </li></ul><ul><li>短时间内获得大量有效数据 </li></ul>06/08/09
    40. 41. 信息获得 -De novo sequencing <ul><li>主流测序技术平台中,目前 454 具有最大的读长( read length , 250-450bp ) </li></ul><ul><li>无需构建传统文库即可进行单分子测序 </li></ul><ul><li>对于没有参考序列的物种,进行 454 测序和序列拼接是首选 </li></ul><ul><li>通过 454 的 de novo 测序获得所需物种的基因组 / 转录组信息 </li></ul>06/08/09 DNA 双螺旋结构发现者,美国诺贝尔奖获得者 - 沃森手中小盒子内装的就是耗时 2 个月 , 价值 100 万美元的“个人版”基因组图谱 DVD 光盘 4 万欧元 ( 约 6.33 万美元 ) , 31 May 2007 芯片制备
    41. 42. 信息检测 - 定制原位合成芯片 <ul><li>无需克隆产物 </li></ul><ul><li>无需合成 Oligo 探针 </li></ul><ul><li>根据已有序列信息,原位合成基因芯片 </li></ul><ul><li>避免克隆差错,消除系统误差 </li></ul><ul><li>高重现性的有效数据 </li></ul><ul><li>极其灵活的芯片格式和密度( format ), 244k , 2×105k , 4×44k , 8×15k ,优化性价比。 </li></ul>06/08/09
    42. 43. 芯片的片间重复 R 2 >=0.997 <ul><li>Inter-array variation: 10 replicate hybridizations across 3 chips using the new blockers during the hybridization </li></ul><ul><li>Average correlation: R 2 =0.999 </li></ul>chip 1 chip 2 chip 3 Pooled control RNA
    43. 44. 芯片的片内重复 R 2 >=0.998 <ul><li>Inter-array variation: 5 replicate hybridizations within one chip using the new blockers during the hybridization </li></ul><ul><li>Average correlation: R 2 =0.999 </li></ul>chip 1 pooled - RNA
    44. 45. 高通量测序 + 原位合成芯片的成本优势 <ul><li>8*15k 5000RMB/ 个 + 分摊测序费用(如果需要) </li></ul><ul><li>获得 10000 个 Unigene 的高通量测序, 20-30 万 </li></ul><ul><li>点样芯片 4000RMB/ 个 + 分摊探针合成费用 / 测序费用 </li></ul><ul><li>合成探针: 10000 个 60mer 探针,每个合成以及 HPLC 纯化 100RMB ,探针库耗费 100 万 </li></ul><ul><li>PCR 克隆:获得 10000 个 Unigene ,大约需要测序 30000-50000 条,测序费用 70-100 万 </li></ul><ul><li>这些芯片制造成本之外的费用将直接分摊到每张芯片上,造成总体实验成本上升 </li></ul>
    45. 46. 原位合成芯片的总体实验成本优势 06/08/09 方法 1 方法 2 总体成本平衡点 点样芯片 测序后原位合成芯片 750 张 点样芯片 原位合成芯片 1000 张
    46. 47. 植物领域原位合成芯片使用的代表文献 06/08/09 WRKY45 在水稻由苯并噻二唑(植物激活剂)诱导下激发的抗性反应中起到关键作用 相关芯片技术链接: nature biotechnology • VOLUME 19 • 342-47• APRIL 2001
    47. 48. 根据芯片筛查结果,做了 WRK62,-76,-19 和 45 高表达的转基因植株,其中只有 WRK45 对稻瘟菌侵袭表现出抗性。 分别生长在在培养箱( Growth Camber , GC )和温室( Green House , GH )中的 WRKY45 转基因水稻和野生型( wt )受感染后菌斑计数。
    48. 49. 三、应用实例 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    49. 50. <ul><li>研究策略需要一个系统的基因组学研究平台的支撑 </li></ul>06/08/09 测序 定制 分析
    50. 51. SBC 在基因组学研究案例 <ul><li>微生物菌株深度测序 </li></ul><ul><li>深度测序后 microRNA 预测, SNP 筛查 </li></ul><ul><li>杨树受到细菌感染后表达谱的变化 </li></ul><ul><li>科考队员在极端环境下的转录组差异 </li></ul><ul><li>大鼠 iPS 细胞(诱导多功能干细胞) </li></ul>06/08/09
    51. 52. 微生物菌株深度测序 <ul><li>Reference Genome length : 4,767,128 </li></ul><ul><li>Solexa Sequence : 177,46,569 ; After Cut Repeat Sequence:16,452,090; </li></ul><ul><li>Fragment Mapping reference genome: 5,045,490, </li></ul><ul><li>mapping times 18,692,127 </li></ul>
    52. 53. microRNA 预测和 SNP 筛查 通过和 Sanger database ( http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ )的序列比对,预测到 4831 个 microRNA 前体( precursors ) 通过与 reference sequence 的比对,筛查到 14318 个可能的 SNP 位点。
    53. 54. 其他进行或完成的项目 <ul><li>与上海交通大学医学院合作开展了问号勾端螺旋体无毒株( 4.3Mb )的测序 </li></ul><ul><li>与西安药厂合作进行了 α- 溶血性链球菌 (2-3 Mb)  的测序 </li></ul><ul><li>与中科院植生所合作进行了厌氧梭菌( 3.9-4.2Mb )的测序 </li></ul><ul><li>与上海交通大学生科院合作进行了链霉菌( 8-10Mb )的测序 </li></ul>
    54. 55. 杨树感染菌后的表达谱变化 杨盘二孢菌感染导致的杨树差异表达基因的功能和染色体定位,研究植物在受到致病感染时启动的自我保护。 —— PCR 克隆,点制芯片
    55. 56. 芯片制备 <ul><li>建库: 2 个杨树 cDNA 文库 </li></ul><ul><li>测序:从两个库中测了 21657 个 EST </li></ul><ul><li>拼接: 10681 个 UniGene </li></ul><ul><li>PCR :选择了 2952 个克隆进行探针制备 </li></ul><ul><li>点样:每个 PCR 产物重复点样 3 次 </li></ul>
    56. 57. 实验结果 06/08/09 植物能够在受到外界致病感染时启动一系列防疫机制,如形成厚的细胞壁,启动二级代谢,改变离子流和突发氧化 —— 植物不是好欺负的
    57. 58. 科考队员在极端环境下的转录组差异 表达谱芯片在此次中国南极科考中的使用 <ul><li>南极内陆冰盖严酷的自然环境,内陆 Dome-A 地区全部为冰雪覆盖,平均冰厚在 2000 米以上,平均海拔 4000 米以上,夏季极端气温接近于 -50℃ ,气压为 590-600kPa ,氧分压比海平值减少约 40% 左右。紫外线辐射强烈。 </li></ul><ul><li>科考队员在如此的极端环境下,生理和心理发生巨大的变化 </li></ul><ul><li>利用表达谱芯片对科考队员在不同时间点采样的白细胞进行表达谱分析,期望找到人对极端环境的适应能力的分子水平的解释 </li></ul>
    58. 59. :吴淞码头出发 :在南极 DoomA :雪龙号返程途中 数据结果显示人在不同的环境和心理因素下 1 、即将出发去极地 2 、到达极地,高寒,缺氧,孤独,强紫外 3 、结束考察,返航 会表现出不同的基因表达谱模式,各有一组特异的基因持续的升高 部分明确的功能为 hemoglobin complex oxygen transport oxygen transporter activity Platelet degranulation Formation of Platelet plug Platelet Activation IL 3 signaling pathway IL 6 signaling pathway
    59. 60. 他山之石可以攻玉 <ul><li>对于这样一类未知切入点的课题,用芯片进行初筛再进一步研究是非常好的方法,快速,高效。 </li></ul>高产品系特征谱 优良品系特征谱
    60. 61. 大鼠 iPS 细胞(诱导多功能干细胞) 诱导的大鼠 ES 细胞是否具有和 ES 细胞相同的特性 —— 用基因表达谱检验不同组织和细胞之间的亲缘性 从成纤维细胞诱导成的 ES 细胞,是否具有和其他 ES 细胞一样的基因表达模式, iPS 细胞(诱导多功能干细胞)到底是不是 ES 细胞。
    61. 62. 1 、用基因表达谱芯片分别检测上述这些组织和细胞的全基因组表达谱 2 、利用数据库检索,挑选具有同源蛋白的的编码基因 约 2 万个 3 、在这两万个基因中挑选出具有显著性差异表达的 2 千个基因 4 、用非监督层次聚类分析这些样品的亲缘性
    62. 63. 由于 ES 细胞是具有全能性的细胞,因此不同物种的 ES 细胞仍具有较高的同源性。大鼠 iPS 细胞具有同其他 ES 细胞高度的亲缘性。 <ul><li>Human fetal lung firbroblast cell line </li></ul><ul><li>Mouse lung </li></ul><ul><li>Mouse heart </li></ul><ul><li>Rat lung </li></ul><ul><li>Rat heart </li></ul><ul><li>Human ES cell </li></ul><ul><li>Mouse ES cell </li></ul><ul><li>Rat iPS cell line-1 </li></ul><ul><li>Rat iPS cell line-2 </li></ul>
    63. 64. 06/08/09 生化细胞所肖磊课题组 北大生科院邓宏奎课题组
    64. 65. 06/08/09 邓宏奎组用动物实验证明诱导的 iPS 细胞植入大鼠胚胎后具有全能性(花老鼠) 肖磊组用基因芯片证明诱导的 iPS 细胞具有同其他 ES 具有高度亲缘性,同样证明
    65. 66. 四、 SBC 的平台优势 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com 06/08/09
    66. 67. SBC, 中国最系统的基因组学研究服务平台之一 投资 2.9 亿人民币于 2001 年建立于上海浦东张江高科技园区 拥有超过 300 名员工, 4 万平方米土地, 7 幢主建筑, 22 万平方米面积的实验室,包括部分 GMP 实验室( Good Manufacture Practice ,良好药品生产规范)和 GLP 实验室( Good Laboratory Practice , 良好药品实验研究规范 ) 。 —— 用我们的平台,加速您的研究
    67. 68. SBC 提供高质量数据的保障体系 06/08/09 通过 ISO 9001:2000 版质量管理体系认证 中国首家 Affymetrix 服务认证的技术服务供应商 中国唯一 A gilent 服务认证的技术服务供应商 通过 Affymetrix SNP 6.0 芯片技术培训认证 “ Agilent 亚太地区最佳服务供应商”奖 “ Affymetrix 优秀服务商”奖 “ 上海服务外包重点企业” 2005 年 2 月 2005 年 4 月 2007 年 8 月 2007 年 9 月 2008 年 1 月 2008 年 12 月 2008 年 12 月
    68. 69. SBC 拥有的主流芯片平台 06/08/09 SBC 芯片服务平台 Nimblegen 芯片服务平台 illumina 芯片服务平台 Agilent 芯片服务平台 Affymetrix 芯片服务平台
    69. 70. 已经有很多研究者已经在享受 SBC 的技术服务 06/08/09 SBC 服务平台产生的数据质量得到国内研究者和跨国药物研发企业的广泛认可。
    70. 71. SBC 署名的部分研究论文
    71. 72. SBC 参与新进发表在 nature genetics 上的研究论文 对 1139 例银屑病病人, 1132 例对照进行了 SNP 关联分析,发现基因组上的疾病易感区段。
    72. 73. 需要了解更多?请访问 ebioservice 06/08/09 www.ebioservice.com
    73. 74. 技术服务热线: 800-820-5086 / 800-820-3665 技术服务网站: http://www.ebioservice.com Thank You !

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