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Pcr secuenciacion

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Pcr secuenciacion

  1. 1. Secuenciar ????Establecer el orden exacto de las 4 bases(A,C,G,T) a lo largo de un fragmento de ADN.
  2. 2. Métodos básicos de secuenciaciónMétodo químico de Maxam y GilbertMaxam, A.M. and Gilbert,W.(1977) A new method for sequencing DNA.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564.Método enzimático de SangerSanger, F., Micklen, S.,and Coulson, A.R.(1977) DNA sequencing and chain terminatinginhibitors.Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 74, 5463-5467
  3. 3. Frederick Sanger y Walter Gilbert compartieron, en 1980, el premio Nobel de química por haber desarrollado independientemente métodos de secuenciación del ADN . Sanger ganó anteriormente el premio Nobel de 1959 por la secuenciación de la proteína insulina.F. Sanger W. Gilbert
  4. 4. Método químico de Maxam y GilbertEl fragmento de ADN se marca en sus extremoscon Ɣ 32P ó Ɣ 32S dATP por acción de laPolinucleótido Quinasa.Las moléculas marcadas se rompen conreacciones químicas específicas para cada unade las cuatro bases.Los productos luego se resuelven enfunción de su tamaño en geles depoliacrilamida.
  5. 5. Extremo marcado radioactivamente 5 o 3‘.El tratamiento químico rompe la uniónglicosídica entre la ribosa y el nucleótido.Reacciones químicas específicas–G : DMS, piperidina–A + G: DMS, ácido fórmico,piperidina– C+T: Hidracina, piperidina–C : Hidracina en 1.5M NaCl, piperidina(rompe la uniónfosfodiester)Electroforesis en gel + Autoradiografía
  6. 6. USOSSecuenciar oligonucleótidos sintéticosAnalizar modificaciones en laestructura del adn (ejemplo: metilaciónde bases)Estudiar la estructura secundaria delADN o su interacción con proteínas(ejemplo: experimentos de protecciónquímica).
  7. 7. Método de secuenciación de SangerDesarrollado en 1977 por Frederick Sanger.Método Bioquímico (usa una polimerasa).Basado en la incorporación deDideoxinucleótidos (ddNTPs) que detienen elcrecimiento de la cadena de ADN.
  8. 8. Los dideoxinucleótidos no tienen OHen carbono 2 ni en 3 de ladesoxirribosa, por lo que no puedenformar enlaces fosfodiéster.
  9. 9. Durante la secuenciación se llevan a cabo cuatroreacciones de síntesis separadas incluyendo encada una de ellas pequeñas cantidades de losdideoxinucleótidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP,ddTTP)
  10. 10. se requiere:+ Primer Marcado+ ADN polimerasa+ 4 dNTPs+ ddATPAl incorporarse un dideoxinucleótido finaliza la copia deltemplado y se generan fragmentos de distintos tamaños. Los ddNTP compiten con los dNTP para ser incorporados. produciendo una mezcla de cadenas de distintas longitudes.
  11. 11. La sustitución de uno delos dNTPs por el mismonucleótido marcadoradiactivamente permitela visualización de lasbandas de distintalongitud porautoradiografía.
  12. 12. En el gel la separación de lasdistintas bandas se produceen funciónde su tamaño y la secuenciapuededeterminarse leyendo lasbandas de loscuatro carriles.
  13. 13. Los protocolos de secuenciaciónautomática:Son una alternativa al método de Sanger.Se utilizan compuestos fluorescentes para “marcar” al “primer” ó a los terminadores.Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis.Los fluoróforos son excitados por la luz de un láser y luego el equipo detecta la fluorescencia emitida.La reacción se realiza en un ciclador
  14. 14. Las reacciones de secuenciaciónautomática pueden emplear:Terminadores fluorescentesPrimers fluorescentes
  15. 15. Secuenciación empleandoterminadores fluorescentesSe realiza una única reacción desecuenciaen presencia de los cuatro ddNTPs, cadauno de ellos marcados con una sondafluorescente distinta.
  16. 16. Las sondas empleadas son:A ---> JOE.Emisión: verde. Derivado defluoresceínaC ---> FAM.Emisión: azul. Derivado defluoresceínaG --> TAMRA.Emisión: amarillo. Derivado derodaminaT --> ROX.Emisión: rojo. Derivado derodamina
  17. 17. Secuenciación empleandoprimers fluorescentesSe realizan cuatro reacciones de secuenciadistintas en cada una de las cuales se añade el“primer” marcado en 5´ con una sondafluorescente distinta, junto con la polimerasa, losdNTPs y el ddNTP correspondiente.En la secuenciación cíclica solo se utiliza UNO de losdos primers a la vez.Si utilizáramos al mismo tiempo ambos “primers”,como en un PCR común, resultarían dos secuenciassolapadas ( la del templado y la de su cadenacomplementaria).
  18. 18. Aplicaciones de la secuenciación de ADNSecuenciación genómicaEvaluación del clonado en vectoresDiagnóstico de enfermedades :bacterianasviralesprotozooshongoscáncergenéticasDetección de polimorfismos (single nucleotidepolymorphism)ForenseADNs fósiles

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