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INGENIERÍA GENÉTICA. MANIPULACIÓN GENÉTICA                     TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE        Bajo la denominación...
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Después se tiñen con un colorante y se obtienen una bandas. Cada banda corresponde a untamaño medido en pares de bases.   ...
¿Cómo se inserta el vector en el ADN de la célula huésped? Se corta el ADN delvector y el que contiene el gen deseado con ...
BIBLIOTECAS DE ADNc Y VECTORES DE EXPRESIÓNVER BRUÑO PAGINA 216Podemos obtener genes sin intrones.MÉTODO ACTUAL DE CLONACI...
La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para obtener copias de lamuestra de ADN de los sospechosos (huella...
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Ingenieria genetica

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Ingenieria genetica

  1. 1. INGENIERÍA GENÉTICA. MANIPULACIÓN GENÉTICA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Bajo la denominación de Genética molecular se engloban procesos y fenómenosrelacionado con el material genético como son la replicación, transcripción, traducción, elcódigo genético y las mutaciones. La Genética molecular empieza en 1953 cuando Watson yCrick descubren la estructura del ADN, que es la base de disciplinas absolutamenterevolucionarios en la Biología y podríamos decir que en toda la Ciencia. Más adelante, en 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de restricción, Teminy Baltimore descubren la retrotranscripción, en 1983 K.B Mullis desarrolla la PCR, sedesarrollan técnicas de secuenciación de ADN, y otras muchas más. Todas estas técnicasconstituyen la Ingeniería Genética (= Manipulación genética) que permitir manipular elgenoma de un ser vivo. Esta manipulación consiste en: • Introducir genes (normalmente de otro ser vivo) en un genoma. • Eliminar genes. • Modificar su secuencia de bases • Secuenciar genes • Clonar genes Realmente habría que denominar a dichas técnicas Tecnología del ADNRecombinante, ya que con ellas se obtienen nuevos ADN que no existían. Si aplicamos estos métodos y técnicas a los seres vivos para obtener un producto oservicio, hablamos de BIOTECNOLOGÍA, que ha experimentado una auténtica revolucióngracias a ellos. Por ejemplo, la insulina o la hormona del crecimiento que se inyectan losdiabéticos hoy día es la humana, pero la fabrican bacterias (E. coli), también se puede citarmuchas vacunas. Por tanto la Ingeniería Genética se sitúa entre la Genética Molecular y laBiotecnología. Es decir, para poder fabricar insulina con bacterias antes hay que manipularel gen humano (localizarlo, cortarlo, clonarlo e insertarlo en la bacteria, es decir, haceringeniería genética). Genética sirve Manipulación se aplica Biotecnología Molecular de base para la genética en la Algunos hechos destacables de la I.G. y la biotecnología son: • 1977 Herbert Boyer inserta el gen de la somatostatina en el ADN de E. Coli, • 1978 en EE.UU. se logra producir insulina humana en bacterias y en 1983 se comercializa. 1980 Weismann, en Suiza, sintetiza interferón con bacterias. • 1982 Se obtienen ratones transgénicos gigantes a partir de óvulos a los que se inyectó el gen de la hormona del crecimiento. • 1984 Obtención por biotecnología de la vacuna contra la hepatitis B • 1985 Alec Jeffreys, en Gran Bretaña desarrolla la técnica de la “huella genética” , que permite identificar personas a partir de muestras como pelo, sangre, esperma, INGENIERÍA GENÉTICA 1
  2. 2. etc. En 1995 sirve para exculpar a un jugador de futbol americano del asesinato de su mujer. • 1990 El médico French Anderson inicia la primera terapia génica en un niña con una inmunodeficiencia. Comienza el P.G.H. de manera oficial. • 1995 Secuenciación del genoma de la levadura Sacharomyces cerevisiae • 1997 Secuenciación del genoma de la bacteria Escherichia coli • 1998 Secuenciación del genoma del gusano Caenorhabditis elegans, y de las bacterias que producen el tifus y la tuberculosis. • 2000 La empresa Celera Genomics anuncia que ha terminado la secuenciación completa dl genoma humano.MANIPULACIÓN DEL ADN El hombre ha manipulado desde siempre el ADN de las especies y así han aparecidovariedades de animales domésticos, frutales, cereales, etc., a veces por intercambio entreespecies que de forma natural nunca se hubieran cruzado. Ha seleccionado individuos condeterminados caracteres y aquellos que les interesaba los ha cruzado de manera selectiva(cruzamientos selectivos.) Es la selección artificial. Es un proceso lento y no siempre seobtenían los resultados esperados. Desde el descubrimiento de Watson y Crick hasta 1970 la manipulación del ADNfue muy difícil. A partir de 1970 irrumpen con extraordinario éxito unas técnicas quepermiten manipular y modificar el ADN de los organismos con facilidad. Son las TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA o TECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE. Sus ventajas, frente a los procedimientos clásicos son muchas:  Mucho más rápido y preciso.  Se transmiten sólo los genes deseados.  Obtención de productos en mucho mayor cantidad.  Gracias estos métodos podemos obtener fragmentos de ADN idénticos encantidades ilimitadas (clonación), determinar la secuencia de los genes, alterarlos, insertargenes de una especie en otra distinta, bien en sus células somáticas o germinales. Algunas de estas técnicas son: 1. Tomar o aislar fragmentos específicos de ADN de un organismo, para ello se cortan en puntos concretos. Es decir, fragmentar o cortar el ADN. 2. Unión de fragmentos de ADN. 3. Clonación del ADN, para tener suficientes copias y estudiarlo mejor, o para que se exprese su proteína en grandes cantidades. Se utilizan VECTORES DE CLONACIÓN. También se puede hacer con la técnica llamada PCR (Reaction Chain Polymerase = Reacción en cadena de la Polimerasa.) 4. Insertar un gen en el ADN de otro ser vivo para que se exprese en él, o incluso en sus células germinales para que se transmita a la descendencia. Es la transformación, y el ADN es recombinante. Así se obtienen ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE ( = O.M.G.) o TRANSGÉNICOS. Para INGENIERÍA GENÉTICA 2
  3. 3. insertarlo en la célula huésped primero se inserta en unos VECTORES DE TRANSMISIÓN = DE EXPRESIÓN. 5. Identificación y secuenciación, y modificación para mejorar el producto, si su producto tiene interés industrial, farmaceútico, agrícola, etc. Para manipular el ADN se utilizan herramientas fundamentales: las enzimas derestricción o restrictasas (cortan), las ligasas (unen) y los vectores de transmisión(transportan genes y los insertan en ADN distintos, es decir, de otras especies)1.- OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN. CORTE DEL ADNSe puede hacer utilizando dos tipos de enzimas: las enzimas de restricción y lasretrotranscriptasa. Enzimas de retricción En 1970 se descubrió que las bacterias tienen un sistema de defensa para eliminarel ADN extraño que les infectaba. Eran unas enzimas que cortaban el ADN en unos puntosconcretos de la secuencia (dianas de restricción, formadas por cuatro u ocho bases). Se denominan enzimas de restricción, restrictasas o endonucleasas derestricción. Reconocen puntos concretos del ADN (secuencias palindrómicas o capicúas) y locortan ahí. Actúan como tijeras moleculares. Se conocen más de 100 distintas y cada unacorta en una secuencia específica a cada hebra de ADN.El corte puede ser de dos tipos y así se originan: • Extremos romos o lisos, • Extremos cohesivos o pegajosos o escalonado, así puede unirse a otros trozos que sean complementarios. Enzima Bacteria Tipo de extremo  Eco RI Escherichia coli cohesivos  Eco RII Escherichia coli  Bam HI Bacillus amyloquefaciens cohesivos  Hae III Haemophilus aegyptius romos  Hind III Haemophilus influenzae Rd cohesivos  Kpn I Klebsiella pneumoniae cohesivos  Sma I Serratia marcenscens romos  Bsu RI Bacillus subtitlis Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen unamezcla de fragmentos de distinto tamaño. Los fragmentos obtenidos se pueden separar porun método llamado electroforesis, basándose en la capacidad de desplazamiento en uncampo eléctrico según su tamaño y de carga eléctrica. Las pequeñas recorren una distanciamayor y las largas menor. Los fragmentos se mueven sobre una lámina de gel de agarosa. INGENIERÍA GENÉTICA 3
  4. 4. Después se tiñen con un colorante y se obtienen una bandas. Cada banda corresponde a untamaño medido en pares de bases. El tamaño de los fragmentos se suele expresar en KILOBASES (1000 nucleótidos) sison cadenas monocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla de bicatenarias. Si eltamaño es inferior a 1000 bases se habla de bases o pares de bases. Transcriptasa inversa También se puede obtener el fragmento de ADN, en este caso ADN estructural, esdecir, que codifica una proteína o enzima, si se conoce su secuencia de aminoácidos o la desu ARNm (éste se sintetiza “in vitro” o se aísla de la célula por hibridación). Una vezaislado, la transcriptasa inversa lee este ARNm y sintetiza se obtiene el ADN que locodifica, llamado ADNc o complementario, que es un ADN sin intrones. Este método es muyimportante si el gen que se introduce es de eucariontes y se introduce en una bacteria. Elgen introducido no tiene intrones.HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Por medio de la hibridación de ácidos nucleicos podemos localizar genes en el ADN.Hibridamos el ARNm sin intrones con el ADN y con fluorescencia o autorradiografía(isótopos) localizamos el gen en el cromosoma.CLONACIÓN DEL ADN Para manipular el ADN es necesario disponer de una gran cantidad de moléculas.Esto se consigue con la clonación. Se puede hacer de dos formas: • Clonación molecular o génica, utilizando células. • Amplificación por PCR, sin utilizar células. Clonación molecular o génica La clonación molecular se hace utilizando células hospedadoras, bacteriasnormalmente. Es decir, se inserta el ADN deseado en su ADN y cuando la bacteria sereproduzca hará múltiples copias de ese ADN. Para ello, una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano. Para ellose utilizan los vectores de clonación o de clonado. Estos vectores son pequeños moléculasde ADN que tienen capacidad de autorreplicación independientemente del ADN de la célulahuésped, como plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. El gen deseado hay que insertarloprimero en estos vectores. Estos vectores llevan además unos genes llamados marcadores que sirven paradetectar o identificar las células que han incorporado los vectores. Estos marcadores songenes de resistencia a antibióticos (si se inserta en una bacteria) o genes debioluminiscencia (si se inserta en una eucarionte). Los plásmidos naturales no tienen estosmarcadores, sino que se añaden artificialmente. INGENIERÍA GENÉTICA 4
  5. 5. ¿Cómo se inserta el vector en el ADN de la célula huésped? Se corta el ADN delvector y el que contiene el gen deseado con la misma restrictasa y luego se unen con laligasa. Así tenemos un ADN recombinante, ya que procede de dos moléculas distintas. La introducción de un ADN extraño en bacterias, ya sea de forma natural o porvectores, se llama transformación. Si el vector es un virus, la transformación se llamatransducción. Si se hace en eucarionte se llama transfección, y si se inserta en las célulasgerminales de estos se llama transgénesis y los descendientes de estos organismos,transgénicos o modificados genéticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores másutilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en células animales, elvirus SV40. Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivopara que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y así seobtienen múltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que procedan de unasola, llevarán ese vector y ese gen, constituye un clon. Así se obtienen tantos clones comofragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias. El conjunto de clones obtenido sellama biblioteca genómica o genotecas.SELECCIÓN DE CLONES o TRANSFORMANTES De todos los clones obtenidos sólo uno portará el gen deseado. ¿Cómo se localiza ose extrae de la biblioteca genómica?. Es decir, hay que localizar un fragmento de ADN,que está dentro de una célula. El método depende del vector utilizado: • Transfiriendo los clones a cultivos con antibióticos. El que sobreviva es el que porta el marcador de resistencia. • Otro método muy usado es la hibridación de ácidos nucleicos, utilizando una sonda.La sonda es un fragmento de ADN o ARN de cadena sencilla complementaria a la secuenciadel fragmento que queremos localizar. Esta sonda puede ser: • El ARNm correspondiente a la proteína que codifica el en buscado, y que se ha sintetizado in vitro. • Un ADN llamado complementario (ADNc), obtenido a partir del ARNm por la transcriptasa inversa.La sonda lleva una molécula (reporter) que puede un isótopo radioactivo o una sustanciafluorescente. Sirve para “verla” por medio de autorradiografía (si lleva isótopos) o conmicrocosopio de florescencia si lleva sustancia fluorescente. VER PÁGINA 215 BRUÑO. Lasonda se añade al conjunto de clones y se espera que hibride.Si se quiere clonar el gen de la insulina humana y luego secuenciarlo, la sonda se prepara apartir de células del páncreas. Se aísla de ellas el ARNm de la insulina, luego con latranscriptasa inversa (y con nucleótidos marcados con isótopos radiactivos) se obtiene elADNc, que contiene únicamente secuencias codificantes, sin intrones porque procede delARNm maduro. INGENIERÍA GENÉTICA 5
  6. 6. BIBLIOTECAS DE ADNc Y VECTORES DE EXPRESIÓNVER BRUÑO PAGINA 216Podemos obtener genes sin intrones.MÉTODO ACTUAL DE CLONACIÓN DE ADN. AMPLIFICACIÓN DEL ADN.REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR. Para manipular el DNA se necesita grandes cantidades. En la actualidad se clonaADN sin necesidad de utilizar células, por tanto in vitro, con un método desarrollado en1983 por K.B. Mullis, denominado Reacción en Cadena de la Polimerasa, (Polymerase ChainReaction o PCR). Es una técnica mucho más rápida y productiva: a partir de una sola cadenade DNA en una tarde se pueden obtener hasta 100.000 millones de moléculas idénticas. El mecanismo es el mismo que utilizan las células cuando replican el DNA. Es decir,reproduce in vitro lo que ocurre dentro de la célula. Se utiliza la DNA polimerasa, que apartir de una cadena molde fabricará dos cadenas hijas idénticas. Para esto hay quesuministrarlas: • La cadena molde, que es una de las cadenas de la doble hélice • Desoxirribonucleótidos • CebadorEl mecanismo es simple: consiste en repetir ciclos de síntesis. Cada ciclo consta de: 1. Desnaturalización de la doble cadena a copiar, con temperaturas altas. Cada hebra sencilla servirá de molde. 2. Lectura de la hebra molde 3. Incorporación de nucleótidos 4. Mantener temperatura muy elevada durante todo el proceso De esta manera, en el primer ciclo se obtienen dos cadenas, en el segundo, cuatro,en el tercero 8, etc. El número de moléculas obtenidas se obtiene por esta fórmula N = 2 ndonde n es el número de ciclos realizados. Cada ciclo equivale a una replicación. Así al cabode 20 ciclos se obtienen 1048576 moléculas de ADN.Cada ciclo dura unos 5 minutos, ya para que se obtenga una amplificación útil se necesita 20ciclos. Hoy día se hace de manera automatizada. La DNA polimerasa utilizada al principio era la de Escherichia coli. Pero al elevar latemperatura para la desnaturalización del DNA la enzima se desnaturalizaba y había quereponerla en cada ciclo. Esto encarecía y ralentizaba el proceso. Esto se solucionó aldescubrirse las bacterias termófilas (extremófilas) que vivían en aguas termales, cuyasproteínas soportan temperaturas elevadas. Se utilizó la polimerasa de Thermus aquaticus,que soportaba hasta 95 ºC. Esta polimerasa se denominó Taq polimerasa. INGENIERÍA GENÉTICA 6
  7. 7. La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para obtener copias de lamuestra de ADN de los sospechosos (huella genética), pruebas de paternidad, yrecuperación de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse (lince, oso,bucardo, etc). INGENIERÍA GENÉTICA 7

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