Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Prote on moscow

Система Proteon - оптический биосенсор, основанный на технологии поверхностного плазмонного резонанса
для оценки силы, динамики, продолжительности взаимодействия между молекулами.

Related Books

Free with a 30 day trial from Scribd

See all

Related Audiobooks

Free with a 30 day trial from Scribd

See all
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

Prote on moscow

  1. 1. September 24, 2013 Система для анализа межмолекулярных взаимодействий ProteOn XPR36
  2. 2. Life Science Group Методы исследования межмолекулярных взаимодействий С использованием метки  Флуоресцентная  Радиоизотопная  Пр. Без использования метки В растворе  Двух и более гибридные системы в культурах дрожжевых клеток  Изотермическая титрационная калориметрия (ITC)  Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) На поверхности (биосенсоры)  Оптические – Поверхностный плазмонный резонанас (SPR)* – Эллипсометрия – Поглощение/отражение  Электрические (Амперометрия, проводимость, емкость)  Механические (Акустические, микромеханические и пр)
  3. 3. Life Science Group Использование меток Традиционный биохимический анализ – цветовое мечение продуктов реакции ELISA: фермент-опосредованный иммуносорбционный анализ ИФА – Иммунофлуоресцентный анализ Традиционные методологии (1) Мечение требует времени и может влиять на взаимодействие молекул между собой (2) Низкая точность кинетических параметров (3) Затруднения при работе с низкомолекулярными
  4. 4. Life Science Group Преимущества биосенсоров Поглощение/испускание света Полимерная поверхность Металлизированная поверхность Коэффициент преломления/ световая интерференция Вместо детектирования светового сигнала из области реакции, можно определять изменения коэффициента преломления подложки SPR – наиболее широко применяемая технология для измерения биомолекулярных взаимодействий без применения меток Таг-репортер испускает световой сигнал непосредственно из области реакции Существует ли другой способ детекции?
  5. 5. Life Science Group Поверхностный плазмонный резонанс…. ППР – это возбуждение электронного газа (плазмона) вдоль поверхности металл/диэлектрик посредством света.  позволяет обходиться без меток  обеспечивает измерения в режиме реального времени  возникает на поверхности чипа Детекция SPR  Измеряются изменения коэффициента преломления на слое золота  Эти изменения пропорциональны изменениям массы на поверхности – Масса меняется при иммобилизации белка на чипе – Масса еще раз меняется при пропускании потока аналита – Масса меняется при диссоциации аналита  На выходе = двухфазная кривая, сенсограмма, по которой можно судить о кинетике взаимодействия (ka и kd) Что такое SPR? -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 50 100 150 200 250 300
  6. 6. Life Science Group Геометрия Кречманна Призма Поляризованный свет Отраженный свет Слой золота Сенсорная поверхность Проточный канал Светоиспускающие диоды освещают призму под различными углами CCD
  7. 7. Life Science Group Базовая терминология SPR На поверхности взаимодействуют 2 молекулы • Поверхность: обычно это полимер с функциональными карбоксильными группами • Лиганд: один из партнеров взаимодействия, иммобилизован на поверхности • Аналит: один из партнеров взаимодействия, протекает вдоль поверхности Лиганд Аналит Поверхность
  8. 8. Life Science Group Поверхность биосенсора Иммобилизация лиганда Ток аналита Присоединение аналита/ взаимодействие Этапы Поверхность биосенсора Технология SPR СЕНСОГРАММА Поверхность биосенсора
  9. 9. Life Science Group ПотокПоток Проточная ячейка ДиссоциацияДиссоциация СвязываниеСвязывание Достижение равновесияДостижение равновесия Технология SPR
  10. 10. Life Science Group Преимущества безметочного подхода Биомолекулярные взаимодействия • Белок-Белок • Белок-Пептид • Антиген-Антитело • Белок-Низкомолекулярное соединение • НК-Белок • НК-ДНК • Углеводы-Белок • Липиды – Низкомолекулярные соединения • Насколько специфично взаимодействие? • Насколько быстро происходит взаимодействие (ka)? • Насколько стабилен комплекс (kd)? • Насколько сильно взаимодействие (KD)?
  11. 11. Life Science Group Типы анализов, осуществляемых посредством SPR • ДаДа//НетНет – являются ли молекулы партнерами взаимодействия • КинетическийКинетический – ka и kd константы скоростей ассоциации и диссоциации, соответственно • РавновесныйРавновесный – KD константа аффиности • КонцентрационныйКонцентрационный – определение активной концентрации аналита • ТермодинамическийТермодинамический – свободная энергия, энтальпия, энтропия. Объяснение значений кинетических констант связывания
  12. 12. Life Science Group Одинаковая аффинность – различная кинетика KD=1x10-6 [M] -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 50 100 150 200 250 300 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 50 100 150 200 250 300 ka=1x105 (1/Ms); kd=1x10-1 (1/s(ka=1x102 (1/Ms); kd=1x10-4 (1/s( Полный спектр кинетических данных – преимущество SPR
  13. 13. Life Science Group Области применения биосенсоров Скрининг/ранжирование антител Характеризация антител Изотипирование антител Картирование эпитопов Скрининг лекарств/ низкомолекулярных соединений Определение концентраций Анализ мутантов Картирование поверхности белка Формирование белкового комплекса Лиганд-рецепторное взаимодействие
  14. 14. Life Science Group Ограничения существующих SPR систем Biosensor Surface Низкая производительность  Последовательное пропускание образцов – Иммобилизация – Ввод аналита – Регенерация – Повтор шагов Получение кинетических данных в полном объеме требует проведения серии экспериментов  Трудоемкость экспериментального дизайна  Ограниченность автоматизации
  15. 15. Life Science Group Системы с последовательным пропусканием образца Ввод аналита Принцип работы 1 канал - образец 2 канал – канал сравнения 2 канал – канал сравнения 1 канал - образец 2 канал – канал сравнения Активация Иммобилизация лиганда 1 канал - образец
  16. 16. Life Science Group Анализ белковых взаимодействий ProteOn XPR36 Система анализа белковых взаимодействий
  17. 17. Life Science Group ProteOn XPR36 Система анализа белковых взаимодействий Поверхностный плазмонный резонанс Система пересекающихся микроканалов Измерьте 36 взаимодействий за один запуск Новое слово в SPR: одновременный анализ нескольких образцов 6 x 6 = 6 Лигандов x 6 Аналитов Оптический биосенсор
  18. 18. Life Science Group Шаг 1 Иммобилизация (до 6 лигандов) • Активация • Иммобилизация • Деактивация Шаг 2 Инъекция до 6 аналитов в перпендикулярном направлении Шаг 3 Увеличенное изображение одной из 36 областей взаимодействий Особенности XPR подхода 6x6
  19. 19. Life Science Group Параллельная проточная система Одновременное протекание нескольких образцов в системе ProteOn XPR36 реализовано при помощи системы пересекающихся микроканалов Преимущества 1. 6 x 6 инъекций в перпендикулярных направлениях 2. Одновременный анализ 36 взаимодействий 3. Снижение длительности эксперимента 4. Высокая производительность при низкой себестоимо 5. Различные варианты нормирования базовой линии
  20. 20. Life Science Group Каналы иммобилизации лиганда 6 Каналов Сенсорный чип
  21. 21. Life Science Group Иммобилизация лигандов Функциональные группы, по которым возможна иммобилизация  NH2  COOH  SH  COH
  22. 22. Life Science Group Каналы для протекания аналита 6 Каналов для аналита
  23. 23. Life Science Group 1.1 3.3 11 100 nM 33 0.37 analyte 1.1 3.3 11 100 nM 33 0.37 Отмывка 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Вся кинетика одним выстрелом
  24. 24. Life Science Group Лиганды Аналиты L1 L2 L3 L4 L5 L6 A1 A2 A3 A4 A 5 A 6 Интерспоты Канал Life Science Group, Bulletin 3172 Уникальные возможности для установки базовой линии: интерспоты
  25. 25. Life Science Group  6Во время ввода аналитов в ряд подается буфер  Корректировка в режиме реального времени Life Science Group, Bulletin 3172 L1 L2 L3 L4 L5 L6 A1 A2 A3 A4 A 5 A 6 Буфер Уникальные возможности для установки базовой линии: вычитание сигнала ряда
  26. 26. Life Science Group Дрейф базовой линии обусловлен подтеканием лиганда с захватывающей поверхности sec sec Рабочий буфер Подача буфера – пустой «впрыск» - в режиме реального времени полностью компенсирует наклон базовой линии Дрейф базовой линии Уникальные возможности для установки базовой линии: двойной контроль в режиме реального времени
  27. 27. Life Science Group Возможности экспериментального дизайна “1 к 1” (Оптимизация взаимодействия) 6 лигандовГрадиент 1 лиганда “6 к 1” (Высокопроизводительная кинетика) 6разведений1аналита 6разведений1аналита
  28. 28. Life Science Group “6 к 6” (мультиплексный скрининг) 1аналит 36 лигандов6 лигандов 6аналитов “36 к 1” (высокопроизводительный скрининг) Возможности экспериментального дизайна
  29. 29. Life Science Group Эффективность эксперимента A1 A2 A3 A4 A5 A6 L1 L2 L3 L4 L5 L6 Дизайн типичного эксперимента “1 к 1”(Набор «Низкомолекулярное соединение» ) L1 L1 L1 L1 L1 L1 L6 L6 L6 L6 L6 L6 L2 L2 L2 L2 L2 L2 L3 L3 L3 L3 L3 L3 L5 L5 L5 L5 L5 L5 L4 L4 L4 L4 L4 L4 L1: CA II L2: CA II L3: CA II L4: CA II L5: CA II L6: CA II Лиганд: CA II A1: CBS 6.67 μM A2: CBS 2.22 μM A3: CBS 0.74 μM A4: CBS 0.25 μM A5: CBS 0.08 μM A6: CBS 0.00 μM Аналит: CBS в разведениях High Low Градиен
  30. 30. Life Science Group За 1 запуск: (1) получены достоверные данные по кинетике (2) подобраны оптимальные условия эксперимента без использования регенерации. Это и есть “Кинетика одним выстрелом”. Эффективность эксперимента
  31. 31. Life Science Group Выбор чипа GLC/GLM/GLH LCP HTG/HTE NLC MNT Чипы для Конъюгации через аминогруппу различной емкости Поверхность для иммобилизации липосом Поверхность для захвата белков с His- тагами (3-NTA-комплекс), Различная емкость Нейтрави диновая поверхность для захвата Биотини лированных молекул Чип для обслуживания Виды сенсорных чипов
  32. 32. Life Science Group Изучение свойств рецептора IL-1 человека Рецептор IL-1 иммобилизовали в буферах с различными значениями pH , :для поиска оптимальных условий при которых  достигается достаточная плотность лиганда  лиганд остается активным 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 pH Пример 1: Оптимизация экспериментальных условий за 1 запуск
  33. 33. Life Science Group Результаты взаимодействия рецептора с IL-1 и его антагонистом 1500 2000 2500 3000 3500 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 pH Liganddensity(RU) 0 100 200 300 400 500 Rmax(RU) Ligand density Rmax IL-1 Rmax IL-1 ra • Максимальную плотность лиганда наблюдали при pH 5.0 • Наибольшая активность - при pH 5.5
  34. 34. Life Science Group Интерлейкин-1 человека и его антагонист ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M] 3.42E+06 8.81E-03 2.57E-9 ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M] 5.13E+05 5.21E-05 1.02E-10 Антагонист IL-1 IL-1
  35. 35. Life Science Group С помощью одного экспериментального протокола на одном чипе: 1. Рецептор IL-1 человека был иммобилизован на поверхности в буфере при пяти различных значениях pH (pH 4 - 6) 2. Наивысшая плотность лиганда - при pH 5.0 3. Инъекция IL-1 и его антагониста показывает, что оптимальная активность (по Rmax) – при pH 5.5 4. Более высокиое значение KD антагониста обусловлено более медленной диссоциацией Рецептор IL-1 человека: резюме
  36. 36. Life Science Group Быстрый отбор супернатантовБыстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител Быстрый отбор супернатантовБыстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител ЦельЦель:: скрининг и определение кинетических констант искрининг и определение кинетических констант и равновесной константы 250 супернатантовравновесной константы 250 супернатантов Пример 2: скрининговые работы с применением техники захвата
  37. 37. Life Science Group Анти-мы ш ины е Анти-мы ш ины е IgG IgG 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 Захват мышиных АТ к антителам человекаЗахват мышиных АТ к антителам человека;; номер супернатантаномер супернатанта 5 разведений человеческого 5 разведений человеческого антигена антигена БуферБуфер -10 15 40 65 90 115 -50 50 150 250 350 sec RU -10 15 40 65 90 115 -50 50 150 250 350 sec RU -10 10 30 50 70 90 -50 50 150 250 350 sec RU -10 30 70 110 -50 50 150 250 350 sec RU -10 15 40 65 90 115 -50 50 150 250 350 sec RU -10 15 40 65 90 115 -50 50 150 250 350 sec RU Базовая линия поБазовая линия по интерспотаминтерспотам 11 22 33 Скрининг и ранжирование супернатантов: схема работы РегенерацияРегенерацияРегенерацияРегенерация 44
  38. 38. Life Science Group -10 40 90 140 190 240 290 -50 150 350 550 750 sec RU -10 40 90 140 190 240 290 -50 150 350 550 750 secRU -10 30 70 110 150 190 -50 150 350 550 750 sec RU -10 10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 -50 150 350 550 750 sec RU -10 15 40 65 90 115 140 165 190 -50 50 150 250 350 450 550 650 750 sec RU -10 15 40 65 90 115 140 165 190 -50 50 150 250 350 450 550 650 750 sec RU 11 супернатант в 1 каналесупернатант в 1 канале 2 супернатант во 2 канале2 супернатант во 2 канале 3 супернатант в 3 канале3 супернатант в 3 канале 4 супернатант в 4 канале4 супернатант в 4 канале 5 супернатант в 5 канале5 супернатант в 5 канале 6 супернатант в 6 канале6 супернатант в 6 канале Используемые концентрации: 50 (красный), 25 (розовый), 12.25 (желтый), 6.25 (голубой) и 3.12 (зеленый) nM Данные одного из запусков: 6 супернатантов
  39. 39. Life Science Group 1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 ka [1/Msec] kd[1/sec] Скрининг и ранжирование супернатантов: результаты ВысокоаффинноеВысокоаффинное взаимодействиевзаимодействие НизкоаффинноеНизкоаффинное взаимодействиевзаимодействие 100100nMnM 1010nMnM 11nMnM 0.10.1nMnM 0.010.01nMnM Линии изоаффинностиЛинии изоаффинности
  40. 40. Life Science Group Скрининг и ранжирование супернатантов: итоги НаНа 11 ЦиклЦикл:: • Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов. • Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут. • Регенерация: 1 минута. Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов НаНа 11 ЦиклЦикл:: • Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов. • Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут. • Регенерация: 1 минута. Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 =: 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!! Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 =: 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!
  41. 41. Life Science Group Спасибо за внимание!Спасибо за внимание! ProteOn XPR36
  42. 42. Life Science Group

    Be the first to comment

    Login to see the comments

Система Proteon - оптический биосенсор, основанный на технологии поверхностного плазмонного резонанса для оценки силы, динамики, продолжительности взаимодействия между молекулами.

Views

Total views

418

On Slideshare

0

From embeds

0

Number of embeds

3

Actions

Downloads

6

Shares

0

Comments

0

Likes

0

×