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Identificación y cuantificación del morfotipo
Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking
mediante la técnica FISH y e...
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a mis tutores José Luis Alonso y Luis Borrás Falomir por sus
consejos, ...
Ferrer-Roglán., 2014.
i
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………..……………………………………………………….…….. 1
1.1. La depuración de aguas r...
Ferrer-Roglán., 2014.
ii
3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)………………………………………………………………….…………… 24
3.2. Muestreo……………………………...
Ferrer-Roglán., 2014.
iii
4.1.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 48
4.2. Toma de imáge...
Ferrer-Roglán., 2014.
iv
7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………….. 90
8. ANEXOS……………………………………………………………………...
Ferrer-Roglán., 2014.
v
Anexo 3.3. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración
(mg SSVLM/L...
Ferrer-Roglán., 2014.
vi
Anexo.4.7 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias
H.hydrossis cuant...
Ferrer-Roglán., 2014.
vii
Anexo 4.20 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con
la sonda S...
Ferrer-Roglán., 2014.
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes”………………………………………………………....
Ferrer-Roglán., 2014.
ix
Figura 21. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de
la ...
Ferrer-Roglán., 2014.
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual…………………………………………………………..1
T...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Tabla 23. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las
sondas SA...
Ferrer-Roglán., 2014.
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ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS
ACP: Análisis de Componentes Principales
AGV: Ácidos grasos volátiles
A...
Ferrer-Roglán., 2014.
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FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes
he: habitantes equivalentes
H. hydrossis: Ha...
Ferrer-Roglán., 2014.
xiv
PT: Fósforo Total
PTaf: Fósforo total afluente
PTSSVLM: Fósforo Total del Licor Mezcla (mg/gSSVL...
1. INTRODUCCIÓN
Ferrer-Roglán., 2014.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. La depuración de aguas residuales urbanas
La generación de aguas residuales e...
Ferrer-Roglán., 2014.
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1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos
Los tratamientos biológicos son e...
Ferrer-Roglán., 2014.
3
En el flóculo se distinguen dos niveles estructurales: la microestructura y la
macroestructura (Se...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos
Formación de
es...
Ferrer-Roglán., 2014.
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contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de mucus. Son indicadores de un
buen funci...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes” (Bergey’s, 2011)
Bacterias filamentosas de...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia” (Bergey’s, 2011)
1.3.1.1 Haliscomenobacter hydros...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 3. Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x
(Eikelboom, 2008...
Ferrer-Roglán., 2014.
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bacteria filamentosa H. hydrossis. Los corchetes indican la cobertura de las sondas descritas en
l...
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6 de las 10 depuradoras. Se visualizó en gran medida como filamentos finos teñidos. Éstos,
normal...
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especies y son necesarias más sondas para una completa identificación de este morfotipo con
la té...
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Kragelund et al. (2008) observaron diferentes exo-enzimas excretados por filamentos similares
a H...
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 Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia celular.
 Baja Carga másica (CM). Eleva...
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desarrollaron unas claves de identificación dicotómicas en función de una serie de
característica...
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solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características
mor...
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La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta una
serie ...
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1.4.3. Análisis de imagen
La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección ...
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El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge
Coupled ...
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que son decantados y recirculados al reactor, hasta que salen por la corriente de purga de
fangos...
2. OBJETIVOS
Ferrer-Roglán., 2014.
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2. OBJETIVOS
 El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal la identificación y
cu...
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Ferrer-Roglán., 2014.
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3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Toma de muestras
En el presente estudio se tomaron muestras del licor ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB
3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX)
La E...
Ferrer-Roglán., 2014.
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La depuradora consta de cuatro líneas de agua residual compuestas de pretratamiento,
tratamiento ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)
Trata un caudal de 17.086 m3
/día con ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)
Para el año 2013, la EPSAR da como datos d...
Ferrer-Roglán., 2014.
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El transporte y conservación de las muestras en los botes fue en condiciones aerobias, dejando
en...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Tabla 7. Relación de muestras estudiadas
QB DE CS CX
04/12/08 R 10/12/08 R 03/12/08 R.1 03/06/09 ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla
Parámetro Abreviatura Unidade...
Ferrer-Roglán., 2014.
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3.4. Fijación y permeabilización de las muestras
El primer paso para realizar la técnica FISH es ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Gram -
1 ml de muestra
Centrifugar 3 min 7000 rpm
Lavar 1000 µl PBS 1X
Centrifugar 3 min 7000 rpm...
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Tampón fosfato salino (para fijación)
 Concentración PBS 1X
- NaCl.............…..…..7,60 g
- Na...
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Cloruro sódico 5M (tampón de hibridación y tampón de lavado)
- Cloruro sódico.......... 292.2 g
-...
Ferrer-Roglán., 2014.
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3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón
Todos los portaobjetos utilizados en ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas
Sonda Secuencia (5´-3´)...
Ferrer-Roglán., 2014.
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 Preparar 50 ml de solución de lavado (precalentar a 48ºC) para eliminar el exceso
de sonda que ...
Ferrer-Roglán., 2014.
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3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos
La cuantificación de la pobl...
Ferrer-Roglán., 2014.
37
3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1
Para la cuantificación de los microorganismo...
Ferrer-Roglán., 2014.
38
Todas las imágenes capturadas de cada pocillo se introducen en el software de cuantificación
desa...
2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica F...
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2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.

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Ferrer, M. (2014) Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana. Trabajo final de Máster en Ingeniería Ambiental. Valencia: Universitat Politècnica de València.
www.abgc.es

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2014 - Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.

  1. 1. Identificación y cuantificación del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis formador de bulking mediante la técnica FISH y estudio de su relación con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana TRABAJO FIN DE MÁSTER TIPO B MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL GESTIÓN AMBIENTAL Autora: MARTA FERRER ROGLÁN Director: DR. JOSÉ LUIS ALONSO MOLINA Codirector: DR. LUIS BORRÁS FALOMIR VALENCIA, SEPTIEMBRE 2014
  2. 2. AGRADECIMIENTOS En primer lugar quisiera agradecer a mis tutores José Luis Alonso y Luis Borrás Falomir por sus consejos, dedicación y colaboración en la realización del presente trabajo. Gracias José Luis por darme la oportunidad de realizar este trabajo en el Instituto Universitario del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) y por la confianza depositada en mí. A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR) por facilitar los datos para la elaboración de este proyecto y a Andrés Zornoza por ayudarme siempre en todo aquello que he necesitado. A todos mis compañeros de laboratorio por toda su ayuda prestada y buenos ratos pasados. A Yolanda Úbeda y Paula Serrano por su ayuda en mis dudas de estadística. A mis amigos por estar siempre ahí. A mis padres, a Marisa y a Antonio por vuestro apoyo incondicional, enseñanza y sacrificio. Y por último y siempre, a Miguel y en especial a Pablo… Across the Universe. Muchísimas Gracias a todos.
  3. 3. Ferrer-Roglán., 2014. i ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………..……………………………………………………….…….. 1 1.1. La depuración de aguas residuales urbanas……………………………………………………………… 1 1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos…………….........………….…... 2 1.2.1. El flóculo……………………………..……………………………………………………………………….…..……. 2 1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos……… 3 1.2.3. Composición de la microbiota………………………………………………………………………………... 4 1.3. La importancia de las bacterias filamentosas ………………………………………………………….... 5 1.3.1 Phyllum Bacteroidetes……………………………………………………………………………….…………… 5 1.3.1.1. HalIscomenobacter hydrossis…………………………………………………………………............... 7 1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH……………………………………. 8 1.3.1.3. Ecofisiología…………………………………………………………………………………………………………. 11 1.3.1.4. Operaciones de control…………………………………………………………………….…………………. 12 1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos……………………………… 13 1.4.1 Técnicas convencionales………………………………………………………………………………………….. 13 1.4.2. Técnica FISH……………………………………………………………………………………………………………. 15 1.4.3. Análisis de imagen………………………………………………………………..……………………….……….. 17 1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración………………………………………………. 18 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………………………………. 20 3. MATERIAL Y MÉTODOS……………………..…………………………………………………………………………. 21 3.1. Toma de muestras……………………………………………………………………………………………………… 21 3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………………………………. 21 3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………………………………. 22 3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE)…………………………………………………………………………………….. 23
  4. 4. Ferrer-Roglán., 2014. ii 3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS)………………………………………………………………….…………… 24 3.2. Muestreo…………………………………………………………………………………………………………………… 25 3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales.……………………………………………… 27 3.3.1 Parámetros físico-químicos……………………………………………………………………………………… 27 3.3.2 Parámetros operacionales……………………………………………………………………………………….. 28 3.4. Fijación y permeabilización de las muestras……………………………………………………………… 29 3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH).…………………. 30 3.5.1. Preparación de reactivos para FISH ………………………………………………………………………… 30 3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón …………………………………………… 33 3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos ………………………………………………………… 33 3.5.4. Sondas utilizadas…………………………………………………………………………………………………….. 33 3.5.5. Hibridación “in situ” ………………………………………………………………………………………………. 34 3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia………………………………………………………… 35 3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos …………………………….. 36 3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 36 3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1…………………………………………………….. 37 3.8. Análisis estadístico ……………………………………………………………………………………………………. 38 3.8.1. Análisis de variables categóricas: Tablas de contingencia y Prueba de Chi cuadrado………………………………………………………………………………………………………………………….. 39 3.8.2. Análisis de la varianza (ANOVA)………………………………………………………………………………. 40 3.8.3. Análisis bivariante………………………………………………………………………………………………….. 42 3.8.4. Análisis multivariante …………………………………………………………………………………………….. 43 4. RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………… 48 4.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos………………………………. 48
  5. 5. Ferrer-Roglán., 2014. iii 4.1.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 48 4.2. Toma de imágenes y cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de imagen……………………………………………………………………………………………………………………………… 52 4.2.1 Comparación entre EDAR de la cuantificación de bacterias hibridadas……………………. 59 4.3 Análisis Estadístico entre las señales obtenidas para las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY y los parámetros operacionales de la EDAR…………………………………. 63 4.3.1 Coeficientes de Pearson y Spearman. Análisis Bivariante…………………………………….. 65 4.3.2. Análisis de Componentes Principales (ACP)…………………………………………………………….. 72 4.3.2.1. ACP para las variables físico-químicas del afluente y las variables biológicas estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 72 4.3.2.2. ACP para las variables físico-químicas del licor mezcla y las variables biológicas estudiadas……………………………………………….…………………………………………………………………….... 75 4.3.2.3. ACP para las variables operacionales y las variables biológicas estudiadas…………… 77 5. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………………………………. 79 5.1 Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos.……………………………… 79 5.1.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006)………………………………………………………….. 79 5.1.2 Cuantificación de la señal de hibridación mediante el análisis de imagen………………… 79 5.1.3 Comparación entre IE y la técnica FISH con análisis de imagen……………………………….. 81 5.2 Ecofisiología de los morfotipos filamentosos ……………………………………………………………. 82 5.2.1. Parámetros físico-químicos del afluente respecto a Haliscomenobacter………………… 82 5.2.2. Parámetros físico-químicos del licor mezcla respecto a Haliscomenobacter…………… 84 5.2.3. Parámetros operacionales respecto a Haliscomenobacter……………………………………… 85 5.2.4. Correlaciones entre las variables biológicas estudiadas………………………………………….. 86 6. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………….. 88
  6. 6. Ferrer-Roglán., 2014. iv 7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………….. 90 8. ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………… 98 Anexo 1.1 Tabla de contingencia para El tipo de EDAR estudiada y el índice de Eikelboom de H. hydrossis…………………………………………………………………………………………………………………. 98 Anexo 1.2 Prueba Chi-cuadrado para IE y Tipo EDAR………………………………………………………. 99 Anexo 2.1. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Quart Benáger………………………………………………………………………………… 100 Anexo 2.2. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Denia- Ondara………………………………………………………………………………….. 101 Anexo 2.3. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Castellón Línea A+B………………………………………………………………………….. 102 Anexo 2.4. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Castellón Línea C+D…………………………………………………………………………. 103 Anexo 2.5. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Carraixet Línea A+B………………………………………………………………………….. 104 Anexo 2.6. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las bacterias que presentaban señal positiva de hibridación para las sondas HHY y SAP-309 y su desviación estándar (SD). EDAR Carraixet Línea C+D………………………………………………………………………….. 105 Anexo 3.1. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada……………………………………………………………………….. 106 Anexo 3.2. Prueba de homogeneidad de varianzas para SAP-309…………………………………….. 106
  7. 7. Ferrer-Roglán., 2014. v Anexo 3.3. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada depuradora estudiada…………………………………………………………………………………………………………………………. 106 Anexo 3.4. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………………… 107 Anexo 3.5. Media, desviación típica, error típico e intervalo de confianza para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………. 108 Anexo 3.6. Prueba de homogeneidad de varianzas para HHY…………………………………………… 108 Anexo 3.7. Análisis de la varianza (ANOVA) para el promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada…… 108 Anexo 3.8. Comparaciones múltiples (Bonferroni) del promedio del área % ó concentración (mg SSVLM/L) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada ……………………………………………………………………………………………………………….. 109 Anexo.4.1 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda-309. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………………… 110 Anexo 4.2 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda-309. Varianza total explicada……………………………………………………… 110 Anexo 4.3. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda-309. Matriz de componentes rotados………………………………………… 110 Anexo.4.4 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………… 111 Anexo 4.5 ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 111 Anexo 4.6. ACP variables físico-químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 111
  8. 8. Ferrer-Roglán., 2014. vi Anexo.4.7 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 112 Anexo 4.8 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 112 Anexo 4.9 ACP variables físico-químicas del afluente y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 112 Anexo.4.10 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………. 113 Anexo 4.11 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………. 113 Anexo 4.12 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………….. 113 Anexo.4.13 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………….. 114 Anexo 4.14 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………… 114 Anexo 4.15 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………… 114 Anexo.4.16 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett…………………………………………….. 115 Anexo 4.17 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada………………………………………………… 115 Anexo 4.18 ACP variables físico-químicas del licor mezcla y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados…………………………………… 115 Anexo 4.19. ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. KMO y prueba de Bartlett……………………………………………………………………. 116
  9. 9. Ferrer-Roglán., 2014. vii Anexo 4.20 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. Varianza total explicada………………………………………………………………………. 116 Anexo 4.21 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309. Matriz de componentes rotados………………………………………………………….. 116 Anexo.4.22 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………………… 117 Anexo 4.23 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Varianza total explicada……………………………………………………………………………… 117 Anexo 4.24 ACP variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda HHY. Matriz de componentes rotados………………………………………………………………… 117 Anexo.4.25 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. KMO y prueba de Bartlett………………………………………………………………… 118 Anexo 4.26 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Varianza total explicada…………………………………………………………………… 118 Anexo 4.27 ACP variables operacionales y la cantidad de bacterias H.hydrossis cuantificados con IE. Matriz de componentes rotados……………………………………………………… 118 Anexo 5.1. Parámetros de crecimiento y operacionales de Haliscomenobacter hydrossis.. 119
  10. 10. Ferrer-Roglán., 2014. viii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes”……………………………………………………….….6 Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia”………………………………………………………………………7 Figura 3. . Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x……………….8 Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias del gen 16S rRNA………………………………………………………………………………………………………………………9 Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB)………………………………………………………………….…..21 Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB………………………………………………………22 Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)………………………………………………………….....22 Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX………………………………………………………23 Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE)…………………………………………………24 Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE………………………………………………….…24 Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS)……………………………………………………………25 Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS…………………………………………………….25 Figura 13. Fijación de las muestras………………………………………………………………………………………….30 Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos……………………………………………….36 Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias………………………………..……………38 Figura 16. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP……………………………….44 Figura 17. Ejemplos de muestras de fango activo hibridadas con la sonda HHY mediante FISH (600x)……………………………………………………………………………………………………………………………………..49 Figura 18. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Quart según FISH para la sonda HHY………………………………………………………………………………………………………………………………50 Figura 19. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para la EDAR Denia-Ondara- Pedreguer según FISH para la sonda HHY……………………………………………………………………………….50 Figura 20. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de la EDAR Castellón según FISH para la sonda HHY…………………………………………………………………….51
  11. 11. Ferrer-Roglán., 2014. ix Figura 21. Valores de IF de Haliscomenobacter hydrossis para las dos líneas de tratamiento de la EDAR Carraixet según FISH para la sonda HHY………………………………………………………….…………51 Figura 22. Campo de la muestra 07/01/09 de la depuradora Carraixet línea A+B hibridada con la sonda HHY mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad bacteriana (sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………..…………….53 Figura 23. Campo de la muestra 11/02/09 de la depuradora Quart hibridada con la sonda SAP- 309 mediante la técnica FISH (en rojo) y otra correspondiente a toda la comunidad bacteriana (sonda EUBmix) (en verde)……………………………………………………………………………………………………..53 Figura 24. Hoja de cálculo generada por el programa de cuantificación de señal……………………54 Figura 25. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY mediante la técnica FISH en la EDAR Quart Benáger. ………………………………………………………….…55 Figura 26. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY mediante la técnica FISH para la EDAR de Denia…………………………………………………………………….56 Figura 27. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de Castellón…………………………………………………………………………………………………………………………………57 Figura 28. Evolución del porcentaje de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 y HHY mediante la técnica FISH para las dos líneas de tratamiento A+B y C+D de la EDAR de Carraixet………………………………………………………………………………………………………………………………...58 Figura 29. Representación gráfica de diagramas de caja y bigotes del promedio del área % (SAP) ó concentración (mg SSVLM/L) (SAPCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda SAP- 309 para cada EDAR estudiada…………………………………………………………………………………………….…60 Figura 30. Representación gráfica de diagramas de caja y bigotes del promedio del área % (HHY) ó concentración (mg SSVLM/L) (HHYCONC) de las bacterias hibridadas con la sonda HHY para cada EDAR estudiada………………………………………………………………………………………………………62 Figura 31. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico- químicas del afluente y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………………74 Figura 32. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables físico- químicas del licor mezcla y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H. hydrossis cuantificadas con el IE (c)……………………………………………………………………76 Figura 33. Gráficos de las saturaciones factoriales (estructura rotada) de las variables operacionales y la concentración de bacterias hibridadas con la sonda SAP-309 (a), HHY (b) y H.hydrossis cuantificadas con el IE (c)………………………………………………………………………………….…78
  12. 12. Ferrer-Roglán., 2014. x ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual…………………………………………………………..1 Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos……………….3 Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis……………………………………………………9 Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis…………………………………….11 Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen…………17 Tabla 6. Número de muestras por depuradora……………………………………………………………….………26 Tabla 7. Relación de muestras estudiadas………………………………………………………………………………27 Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla…………………………………….28 Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor y en efluente del decantador secundario……………………………………………………………………………………………………..……28 Tabla 10. Variables operacionales………………………………………………………………………………………..…28 Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas……………………………34 Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida…………………………………………34 Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida……………………………………………….35 Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos…………………………………………………...36 Tabla 15. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables físico-químicas……………………….46 Tabla 16. Nomenclatura utilizada en el ACP para los parámetros operacionales…………………….47 Tabla 17. Nomenclatura utilizada en el ACP para las variables biológicas……………………………….47 Tabla 18. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros físico- químicos…………………………………………………………………………………………………………………………………64 Tabla 19. Valor medio, mínimo, máximo y desviación típica de los parámetros operacionales..............................................................................................................................65 Tabla 20. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del afluente……………………………………..67 Tabla 21. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables físico-químicas del licor mezcla………………………………..68 Tabla 22. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables operacionales del proceso……………………………………….70
  13. 13. Ferrer-Roglán., 2014. xi Tabla 23. Correlaciones de Pearson y de Spearman entre las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y HHY con las variables biológicas del proceso………………………………………………71
  14. 14. Ferrer-Roglán., 2014. xii ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS ACP: Análisis de Componentes Principales AGV: Ácidos grasos volátiles ANOVA: Análisis de varianza de un factor CCARBO: Carga de carbohidratos CCD: Charge Coupled Device CLSM: Microscopio Láser Confocal CM: Carga Másica CMdbo3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como DBO5 CMdqos3: Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo de LM expresada como DQOs CS: Castellón de la Plana CX: Cuenca del Carraixet DBO5: Demando Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días DBO5NKT: DBO5/NKT DBOPT: DBO5/PT DE: Denia-Ondara-Pedreguer DQO: Demanda Química de Oxígeno DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) Dynafilm: Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial water systems EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales EF: Edad de Fango EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana Esp: Espumas F: Formamida
  15. 15. Ferrer-Roglán., 2014. xiii FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes he: habitantes equivalentes H. hydrossis: Haliscomenobacter hydrossis HHY: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y EUBmix I, II, II HHYCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas HHY y EUBmix I, II, II IEHHY: cantidad de H. hydrossis cuantificada por el índice de Eikelboom IIAMA: Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente IF: Índice de Filamentos IVF: Índice Volumétrico de Fango Ks: constante de afinidad del substrato µmax: velocidad específica máxima de crecimiento QB: Quart Benáger LM: Licor Mezcla NH4af: Nitrógeno amoniacal afluente NTaf: Nitrógeno total afluente NTSSVLM: Nitrógeno Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM) Oalt: Oxígeno en el reactor biológico >2 ppm Obajo: Oxígeno en el reactor biológico <0.8 ppm OD: Oxígeno disuelto Omed: Oxígeno en el reactor biológico 0.8-2 ppm PBS: tampón salino fosfato PFA: paraformaldehido Phlm: pH del licor mezcla PO4: Fósforo relativo al ortofosfato PO4af: Fósforo relativo al ortofosfato del afluente Prote: Proteínas
  16. 16. Ferrer-Roglán., 2014. xiv PT: Fósforo Total PTaf: Fósforo total afluente PTSSVLM: Fósforo Total del Licor Mezcla (mg/gSSVLM) R1: reactor 1 R2: reactor 2 SAP: Promedio del área % de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y EUBmix I, II, II SAPCONC: concentración (mgSSVLM/l) de las bacterias hibridadas con las sondas SAP-309 y EUBmix I, II, II SPE: Sustancias Poliméricas Extracelulares SS: sólidos suspendidos SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla SSVLM: Sólidos en Suspensión Volátiles del Licor Mezcla T: Temperatura del reactor biológico TRH: Tiempo de Retención Hidráulico en el reactor biológico
  17. 17. 1. INTRODUCCIÓN
  18. 18. Ferrer-Roglán., 2014. 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La depuración de aguas residuales urbanas La generación de aguas residuales es una consecuencia inevitable de las actividades humanas. El agua residual se define como aquella constituida por cualquier combinación de aguas descargadas de actividades domésticas, y de establecimientos industriales o comerciales, aguas de escorrentía superficial y, accidentalmente, de cualquier agua de infiltración de alcantarillados (UNE-EN 1085:2007). La calidad del agua está caracterizada por su composición físico-química y biológica. Siendo la composición, sin duda, el factor que más influye en el proceso de depuración del agua residual. A continuación, en la Tabla 1 se describen los principales contaminantes que se pueden encontrar en el tratamiento de un agua residual y la razón de su importancia. Tabla 1. Principales contaminantes de un agua residual (Metcalf y Eddy, 1998) Contaminante Razón de importancia Sólidos en suspensión Desarrollo de depósitos de fango y condiciones anaerobias en el medio acuático Materia orgánica biodegradable Agotamiento de los recursos naturales de oxígeno y desarrollo de condiciones sépticas Patógenos Posibilidad de transmisión de enfermedades contagiosas Nutrientes Crecimiento anormal de algas y bacterias (aumento de la turbidez del agua) Eutrofización del agua Materia orgánica refractaria (agentes tensoactivos, fenoles, pesticidas agrícolas, etc) Resistencia a la biodegradación y toxicidad Contaminantes emergentes (productos farmacéuticos y de higiene personal) Interactuación con el sistema hormonal y endocrino de los organismos de los ecosistemas. Metales pesados Ecotoxicidad Sólidos inorgánicos disueltos Reacciones con sustancias disueltas en el agua pasando a formar compuestos peligrosos Contaminación térmica por descarga de aguas de refrigeración Modificación de la solubilidad del oxígeno en el agua. Aceleración del metabolismo de la flora y faunas acuáticas (Eutrofización) Alteración de ecosistemas acuáticos Con el objetivo de prevenir el deterioro de la calidad de los medios receptores de aguas residuales, así como eliminar, o al menos reducir, los niveles de los contaminantes presentes en estas aguas, se emplean Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR). Generalmente las EDAR están compuestas por un tratamiento primario (eliminación de sólidos), secundario (biológicos) y terciario (desinfección) (Catalán, 1997).
  19. 19. Ferrer-Roglán., 2014. 2 1.2. Tratamientos biológicos de aguas residuales. Fangos activos Los tratamientos biológicos son especialmente utilizados para conseguir una eliminación eficaz de la materia orgánica, los nutrientes (nitrógeno y fósforo) y los microorganismos patógenos, utilizando reacciones asociadas a los organismos vivos. Los microorganismos crecen utilizando los contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de energía, convirtiéndolos en nuevos microorganismos (biomasa), dióxido de carbono y otros compuestos inocuos (Ferrer y Seco, 2007). El proceso de fangos activos es el sistema de tratamiento biológico más extendido en la depuración de aguas residuales urbanas. Se trata de un tratamiento biológico de cultivo en suspensión donde una masa activa de microorganismos se encarga de estabilizar un residuo orgánico por vía aerobia. La matera orgánica se oxida hasta CO2, NH3 y H2O y nueva biomasa celular. El aire es aportado por medio de difusores o aireación mecánica. La biomasa celular obtenida forma flóculos que sedimentan en el tanque de clarificación o sedimentación (Bitton et al. 1999). Una parte de la biomasa decantada se recircula al reactor para mantener una concentración de microorganismos adecuada, mientras que el resto del fango se extrae del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el tiempo de retención celular (Knobelsdorf et al. 2005). 1.2.1. El flóculo Un requerimiento esencial para el correcto funcionamiento del proceso de fangos activos es la formación de un flóculo adecuado de microorganismos en el tanque de aireación, con el tamaño adecuado para soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar posteriormente, produciendo un sobrenadante fluido y claro. El flóculo, como unidad fundamental estructural y funcional del fango activo, está compuesto por la agregación de partículas orgánicas e inorgánicas del agua afluente junto con microorganismos (bacterias formadoras de flóculo y bacterias filamentosas), todo ello en un proceso facilitado por la excreción de sustancias poliméricas extracelulares (SPE) de origen microbiano (Jenkins et al. 2004). Junto al flóculo aparecen asociadas unas comunidades de organismos superiores (protozoos y metazoos), que desempeñan un papel fundamental en la depuración.
  20. 20. Ferrer-Roglán., 2014. 3 En el flóculo se distinguen dos niveles estructurales: la microestructura y la macroestructura (Sezgin et al. 1978). La microestructura la confieren los procesos de agregación y biofloculación, dando lugar a la formación de flóculos pequeños, esféricos, compactos y débiles. La macroestructura del flóculo está originada por las bacterias filamentosas, estos organismos forman una “espina dorsal” dentro del flóculo donde las bacterias formadoras de flóculo (microestructura) se adhieren. Por tanto, generan la consistencia suficiente para que puedan formarse flóculos más fuertes, grandes y resistentes a la agitación del reactor biológico. Cuando la proporción de bacterias filamentosas y formadoras del flóculo crecen en equilibrio se forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y sedimenta bien, permitiendo obtener un sobrenadante claro y un fango concentrado. En caso contrario, aparecen problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la naturaleza del flóculo. 1.2.2. Problemas en los sistemas de fangos activos producidos por microorganismos Existen algunos tipos de problemas en la separación de sólidos en los sistemas de fangos activos en los que se ven implicados los microorganismos presentes en el reactor y en el decantador secundario. A continuación se describen brevemente los principales problemas detectados y sus posibles causas y efectos (Tabla 2). Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos (Jenkins et al. 2003; Ferrer y Seco, 2007) Problema Causa Efecto Crecimiento disperso Los microorganismos no forman flóculos, están dispersos, formando pequeños grupos o células aisladas. Efluente turbio. Bulking viscoso o no filamentoso Fallo de la microestructura por exceso de polímeros extracelulares. Fango viscoso con problemas de sedimentación y compactación. Flóculo punta de alfiler, “Pin- floc” o “Pinpointfloc” Fallo de la macroestructura del flóculo debido a la ausencia a una proporción excesivamente baja de bacterias filamentosas. Flóculos de pequeño tamaño y de consistencia débil que no sedimentan bien, produciendo un sobrenadante turbio con muchos sólidos en suspensión. Índice volumétrico del Fango (IVF) bajo. Esponjamiento o “Bulking” Fallo de la macroestructura por un exceso de organismos filamentosos. Sedimentación y compactación muy deficientes. En casos severos hay pérdidas de fango con el efluente. IVF alto y sobrenadante muy claro.
  21. 21. Ferrer-Roglán., 2014. 4 Tabla 2. Problemas de separación en el proceso de fangos activos: causas y efectos Formación de espumas y/o natas o “Foaming” Asociado a determinadas tipos de bacterias filamentosas (Nocardia spp y Microthrix parvicella). Y sobrenadantes no degradables. Grandes cantidades de sólidos del fango activo flotan formando espuma en la superficie de los elementos de tratamiento, pudiendo salir con el efluente. Manto ascendente o flotación de fangos La desnitrificación en el clarificador secundario libra N2 gaseoso poco soluble que se adhiere a los flóculos de fango activo arrastrándolos a la superficie del clarificador. Se forma una espuma de fango activo en la superficie del clarificador secundario. 1.2.3. Composición de la microbiota El papel de los microorganismos es fundamental en el proceso de depuración de aguas residuales. La biomasa del fango activo está constituida por bacterias, protozoos, hongos, rotíferos, algas y nematodos. En el fango activo, los microorganismos más abundantes son las bacterias, constituyendo el 95% de la biomasa. Intervienen principalmente en la eliminación de materia orgánica por distintas vías y en la eliminación de nutrientes. Sin las bacterias formadoras de flóculo y las bacterias filamentosas sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente clarificado y de calidad. El segundo grupo más importante y numeroso son los protozoos, constituyendo el 5% de la biomasa (Fernández-Galiano et al. 1996; Serrano et al. 2008). Las funciones principales del grupo protista son eliminación de patógenos y coliformes, clarificado del efluente y biofloculación. Los hongos no son considerados de importancia en el proceso de depuración, debido a que bajo determinadas condiciones pueden proliferar pero rara vez compiten con las bacterias en la utilización de la materia orgánica disuelta. El papel principal de las algas en los sistemas de depuración es el de proporcionar oxígeno a las bacterias para que éstas puedan participar activamente en la eliminación de materia orgánica del agua residual (Ferrer, 2007). Por el contrario, la excesiva proliferación de algas puede dar lugar a graves problemas como atascos en las conducciones. El último grupo en los sistemas de fangos activos son los rotíferos junto con los nematodos que constituyen la cima de la cadena trófica. La principal función es la depredación de organismos inferiores, sin embargo los rotíferos además eliminan bacterias dispersas y
  22. 22. Ferrer-Roglán., 2014. 5 contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de mucus. Son indicadores de un buen funcionamiento del proceso de depuración. La presencia de elevadas cantidades de rotíferos y nematodos indica una edad del fango alta y por lo tanto cambios en la capacidad de depuración del fango activo. 1.3. La importancia de las bacterias filamentosas En todos los tipos de Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales con procesos de fangos activos aparecen las bacterias filamentosas, siendo responsables de la mayoría de los problemas de bulking y foaming (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen, 2010). La excesiva abundancia de estas bacterias puede ser problemática para la operación de la planta y no existe una estrategia universal para limitar o prevenir este comportamiento problemático (Eikelboom, 2000; Jenkins et al. 2004). Más de 30 morfotipos filamentosos han sido identificados en plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000), siendo este número mayor en plantas que reciben agua de origen industrial (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006). Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la comunidad biológica de los fangos activos, ya que están involucradas en la degradación de la materia orgánica. 1.3.1 Phylum Bacteroidetes El phylum Bacteroidetes está compuesto por cuatro grupos filogenéticos: “Bacteroidia”, “Flavobacteria”, “Sphingobacteria”, y “Cytophagia” según el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Bergey’s, 2011); representando 15 familias y alrededor de 7.000 especies diferentes (NCBI, 2010). Además, dos grupos están relacionados con el phylum pero no están realmente asignados a ninguna de las 4 clases existentes. Sin embargo, mientras no exista nueva información que evidencie a qué clase pertenecen, estos organismos se clasifican como “Incertae sedis” de la clase “Cytophaga” a día de hoy (Figura 1).
  23. 23. Ferrer-Roglán., 2014. 6 Figura 1. Árbol filogenético del Phylum “Bacteroidetes” (Bergey’s, 2011) Bacterias filamentosas del phylum Bacteroidetes han sido identificadas en diferentes ambientes como sistemas marinos (Kämpfer, 1995), marismas (Lydell et al. 2004) y en sistemas de fango activo (Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Kämpfer, 1995; Wagner et al. 1994). Dentro de la clase “Sphingobacteriia”, está la familia “Saprospiraceae”, donde se encuentra la especie Haliscomenobacter hydrossis objeto de estudio del presente trabajo (Figura 2). El genoma de H. hydrossis es la primera secuencia completa de genoma publicada de un miembro de la familia “Saprospiraceae” (Daligault et al. 2011). En sistemas de fango activo, Haliscomenobacter hydrossis es la única especie que se ha aislado dentro de este phylum (Eikelboom, 1975; Kämpfer, 1995; van Veen et al. 1973; Williams y Unz, 1985).
  24. 24. Ferrer-Roglán., 2014. 7 Figura 2. Géneros de la clase “Sphingobacteriia” (Bergey’s, 2011) 1.3.1.1 Haliscomenobacter hydrossis Haliscomenobacetr hydrossis es una bacteria filamentosa que ha sido detectada en distintas muestras de fangos activos por todo el mundo (Eikelboom, 2006; Van Veen et al. 1973). H. hydrossis ha sido identificada en diversas muestras de agua con foaming y bulking de EDAR de EEUU, diversos países europeos, Sudáfrica y Australia, en función de sus características morfológicas (Jenkins et al. 2004; Seviour y Nielsen 2010). Se caracterizan morfológicamente por presentar filamentos cortos y rectos (con apariencia de agujas) o largos y un poco torcidos, normalmente salientes de los flóculos (Figura 3); Pueden encontrarse en el fóculo o libres en suspensión, presentando una longitud entre 10 y 200 µm. Ocasionalmente se presentan filamentos largos unidos, no ramificados (observándose raramente falsas ramificaciones), no móviles, de longitud variable, con un diámetro de célula en torno a 0,4 µm. Las células están rodeadas por una vaina, pudiendo existir adherencia, no observándose septos (aunque pueden aparecer espacios vacíos en las células de los filamentos). Además no presentan almacenamiento de sulfuro, ni oxidación de sulfuro, son Gram negativas y Neisser negativas (Eikelboom, 2006; Jenkins, 2003).
  25. 25. Ferrer-Roglán., 2014. 8 Figura 3. Filamentos de H. hydrossis con microscopía de contraste de fases, 1500x (Eikelboom, 2008) Existen diferentes morfotipos que tienen en común que presentan filamentos finos, rectos o torcidos como H. hydrossis, y células sin septo visible, sin embargo no hibridan con las sondas de H. hydrossis o con las sondas específicas de este grupo (Eikelboom, 2008):  Tipo IF-33: muchos filamentos cortos, principalmente se presentan dentro de los flóculos.  Tipo IF-45: Neisser positivo (gránulos pequeños).  Tipo IF-46: Gram and Neisser positivo (gránulos pequeños).  Tipo IF-47: filamentos torcidos libres en la fase acuosa.  Tipo IF-53: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robustos, ocasionalmente enmarañados.  Tipo 0092: comparada con H. hydrossis presenta filamentos más robusto, y tinción gris-violeta con Neisser. 1.3.1.2. Identificación de Haliscomenobacter con la técnica FISH La identificación de bacterias filamentosas a partir de diferencias morfológicas y tamaños de las células y filamentos, puede ser ambigua, por ello es conveniente utilizar métodos moleculares como la técnica FISH para una identificación más precisa. Las sondas que se utilizan en la actualidad para la identificación y cuantificación de H. hydrossis son las que aparecen descritas en la Tabla 3. En la Figura 4 se muestra el árbol filogenético basado en el análisis comparativo de las secuencias del gen 16S rRNA de los principales morfotipos de la
  26. 26. Ferrer-Roglán., 2014. 9 bacteria filamentosa H. hydrossis. Los corchetes indican la cobertura de las sondas descritas en la Tabla 3. Tabla 3. Sondas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis Sonda Diana Comentarios Referencias SAP-309 Mayoría de miembros de la Saprospiraceae Filamentos y células aisladas Schauer y Hahn (2005) HHY-654 H. hydrossis y Aislado 10B Filamentos Kragelund et al. (2008) HHY H. hydrossis Filamentos Wagner et al. (1994) Figura 4. Árbol filogenético del morfotipo filamentoso H. hydrossis basado en las secuencias del gen 16S rRNA (Nielsen et al. 2009). El proyecto Dynafilm1 de la UE estudió la comunidad de microorganismos filamentosos en aguas industriales. Wagner et al. (1994) participó en el proyecto y utilizó la sonda HHY en muestras del licor mezcla de 10 EDAR alemanas. La sonda está basada en la secuencia de nucleótidos de una cepa de H. hydrossis de la colección de DSMZ2 . Se encontró H. hydrossis en 1 Dynamics and composition of filamentous microorganism communities in industrial water systems 2 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares).
  27. 27. Ferrer-Roglán., 2014. 10 6 de las 10 depuradoras. Se visualizó en gran medida como filamentos finos teñidos. Éstos, normalmente se localizaban dentro de los flóculos del fango, tal y como describe van Veen et al. (1973). Por ello, la cuantificación de Haliscomenobacter ssp. con microscopía convencional suele estar infravalorada, ya los que finos filamentos son casi indetectables en los flóculos gruesos de fango activo. Van der Waarde et al. (2002) realizó un exhaustivo estudio con la sonda HHY en 70 EDAR de 11 tipos de tratamientos industriales en 4 países (Países Bajos, Dinamarca, Alemania e Italia): industrias de patata, leche, alimentarias, papel, carne, químicas, cerveza, azúcar, textil, curtiduría y otras. H. hydrossis fue frecuentemente observada (58% de las muestras), sin embargo su abundancia en estas muestras no fue estudiada. Posteriormente, se diseñaron nuevas sondas para detectar filamentos con forma de aguja de apariencia similar a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008):  sonda HHY-654: esta nueva sonda hibrida otro aislado de H. hydrossis aparte de la cepa tipo DSMZ. El nuevo aislado presenta una semejanza de 97,5% con la secuencia de la cepa DSMZ  sonda HHY-T5-654: esta sonda se basó en un producto de RT-PCR (filamentos obtenidos mediante micromanipulación) y comparte un 87.8% de semejanza con la secuencia del gen 16S rRNA respecto a H. hydrossis (cepa DSMZ). Kragelund et al. (2008) estudiaron la abundancia de H. hydrossis y de filamentos similares a H. hydrossis en 126 muestras de EDAR diferentes industrias y 5 muestras de EDAR municipales de Dinamarca, Italia, Polonia, Alemania y los Países Bajos. Para ello utilizó las sondas HHY, HHY- 654, HHY-T5-654 y SAP (309), esta última porque cubre la mayoría de las secuencias de la familia Saprospiraceae y el género Haliscomenobacter. Pequeñas poblaciones de H. hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis fueron observados en la mayoría de EDAR (68%), sin embargo sólo en un 13% de las EDAR estudiadas tenían grandes poblaciones de Bacteroidetes potencialmente responsables de “bulking”. La gran variedad de industrias en las que aparece demuestra que no es posible relacionar las diferentes cepas de "H. hydrossis" con un agua residual específica. Sin embargo, alrededor del 40% de las muestras, donde una gran población de filamentos semejantes a H. hydrossis fueron observados por microscopía convencional de contraste de fases, presentaron ninguna o casi ninguna señal de hibridación con FISH para las sondas empleadas. Es por tanto evidente que el morfotipo de H. hydrossis incluye por lo menos 4
  28. 28. Ferrer-Roglán., 2014. 11 especies y son necesarias más sondas para una completa identificación de este morfotipo con la técnica FISH. 1.3.1.3. Ecofisiología Un buen conocimiento de la ecología y fisiología de las bacterias filamentosas, junto con las condiciones del proceso de depuración, proporciona el desarrollo de mejores y más eficientes estrategias de control (Kragelund et al. 2008). En la siguiente Tabla 4 se muestran los rangos óptimos de los parámetros de crecimiento para H. hydrossis (Mulder y Deinema, 2006; van Veen et al. 1973). Tabla 4. Parámetros de crecimiento de Haliscomenobacter hydrossis Parámetro Descripción Categoría nutricional Quimiorganotrofo Desnitrificación Nitrato reducido a nitrito Medio de cultivo Requieren: Glucosa y sacarosa y fuentes inorgánicas y orgánicas de N como glutamato, aspartato y casaminoácidos. tiamina y vitamina B12. pH 7,0-8,0 Tª 8-30 (óptimo 26) Requerimientos Oxígeno Disuelto (OD) Aerobio µmax 1.2-2.2 d -1 Ks mgl -1 5 mgl -1 para glucosa En general, todos los filamentos de Haliscomenobacter hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis utilizan glucosa y propionico, pero nunca acetato. Parece que estén relativamente especializados en la degradación aerobia de azucares, debido a su capacidad de tomar glucosa y N-acetilglucosamina (Kragelund et al. 2008). Sin embargo, presenta una estricta dependencia ante la presencia de calcio, magnesio y fosfato; altas concentraciones de amonio (>2 g/l) inhiben el crecimiento de Haliscomenobacter y además prefiere un rango de concentración de fósforo (0.05-0.2 g/l) y una baja concentración de extracto de levadura y peptona (Kämpfer et al. 1995b) Unidades de N-acetilglucosamina se encuentran en lipopolisacáridos y peptoglicanos de la pared celular, los cuales son componentes liberados por las células en descomposición (Barker and Stuckey, 1999). Cuando se produce la degradación continua de las células en EDAR, unidades de N-acetilglucosamina pueden proporcionar el crecimiento de las bacterias filamentosas del phylum Bacteroidetes y por tanto explicar su presencia en muchas EDAR. La toma de N-acetilglucosamina y mezcla de aminoácidos por finos filamentos Bacteroidetes también ha sido observada en biofiltros de una EDAR municipal y cultivados en un reactor en laboratorio (Kindachi et al. 2004).
  29. 29. Ferrer-Roglán., 2014. 12 Kragelund et al. (2008) observaron diferentes exo-enzimas excretados por filamentos similares a H. hydrossis, como glucuronidasas, esterasas y quitinasas, que servirían para la ruptura de los polisacáridos. La hidrólisis con exo-enzimas de peptoglicanos y lipopolisacáridos en unidades de N-acetilglucosamina, puede contribuir como continuo aporte de substrato para las bacterias y promover un nicho altamente especializado en EDAR. Esta especialización en polisacáridos ha sido confirmada en estudios de cultivo puro en H. hydrossis ((Kämpfer, 1995; Krul, 1977; Mulder y Deinema, 1992; van Veen et al. 1973, 1982). 1.3.1.4. Operaciones de control Finos filamentos de Bacteroidetes están presentes en muchas EDAR, tanto municipales como industriales, pero raramente están involucrados en incidencias de bulking y foaming, sin embargo contribuyen en el índice global filamentoso de la muestra. Normalmente, no tiene una gran importancia realizar acciones preventivas para eliminar estos filamentos de las EDAR. Sin embargo, en raros casos donde causan problemas, el control es necesario (Kraegelund et al. 2008; Seviour y Nielsen 2010). Para resolver un problema de bulking se suelen realizar las siguientes operaciones de control (Eikelboom, 2002; Jenkins et al. 2004; Tandoi et al. 2005):  Buen mantenimiento.  Eliminar deficiencias de oxígeno: O2 > 2 mg / l y DBO: N:P= 100:5:1.  Configuración en dos etapas (aeróbico/ aeróbico o anaeróbio/aerobio), para eliminar la mayoría de la fracción fácilmente biodegradable antes de que entre al tanque de aireación.  Selector aerobio.  Zona anóxica si hay suficiente nitrito/nitrato disponible para eliminar la fracción disuelta del influente por medio de desnitrificación.  Zona anaerobia con combinación de proceso Bio-P.  Control de síntomas, por ejemplo, aplicando métodos físicos o químicos encaminados a destruir filamentos o a mejorar la velocidad de sedimentación de los flóculos por aumentar su peso. Diferentes autores han propuesto las siguientes condiciones operacionales en las EDAR que favorecen el crecimiento de H. hydrossis:  Bajos niveles de oxígeno disuelto, aunque valores exactos de estos niveles no son conocidos (Eikelboom y van Buisen 1983; Jenkins et al. 2004).
  30. 30. Ferrer-Roglán., 2014. 13  Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia celular.  Baja Carga másica (CM). Elevadas edades de fango o altos tiempos de residencia celular. Valores de CM mayores a 0,15 Kg DBO5 /Kg MLSS d (Lemmer y Lind, 2000), en un rango bastante amplio de CM de 0,1 a 0,75 Kg DBO5 /Kg MLSS d según Richard (1989) y Eikelboom (2000).  Deficiencia de nitrógeno o fósforo en los licores mezcla.  Sustratos solubles fácilmente biodegradables. Se ha sugerido como control potencial de muchas bacterias filamentosas la selección metabólica, con cambios de condiciones aerobias a anóxicas o anaerobias estrictas donde las bacterias no son capaces de crecer (Wanner, 1994). Sin embargo, no parece ser suficiente para eliminar completamente la presencia de los finos filamentos de Bacteroidetes. De hecho, en muchas EDAR estudiadas, con diferente configuración de procesos (nitrificación/desnitrificación y eliminación biológica del fósforo) se encontraban todavía poblaciones de H. hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis (Kragelund et al. 2008). Esto puede ser debido su alta resistencia al estrés por falta de nutrientes (Chiesa y Irvine, 1985), y su capacidad en utilizar N-acetilglucosamina y compuestos similares, que comparten con unas pocas bacterias como las del phylumChloroflexi (Kindachi et al. 2004). No existe un protocolo de control específico de H. hydrossis y filamentos similares a H. hydrossis, por su especialización en la degradación de azúcares procedentes de la descomposición celular de la pared bacteria, que hace imposible eliminar el contenido de estos sustratos para reducir su abundancia en las aguas de las EDAR (Kragelound et al. 2008). Se está investigando en nuevas técnicas de control basadas en la utilización de bacteriófagos específicos. Recientemente, Kotay et al. (2011) realizaron un estudio donde se controlaba la biomasa de H. hydrossis mediante la aplicación de un bacteriófago lítico (virus). 1.4. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos 1.4.1 Técnicas convencionales Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para determinar las características morfológicas, tamaño de la célula y del filamento, y respuesta a la tinción Gram y Neisser. Eikelboom en 1975 publicó el sistema de identificación convencional para las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos activos. Posteriormente Eikelboom y van Buijsen (1983) y Jenkins et al. (1993),
  31. 31. Ferrer-Roglán., 2014. 14 desarrollaron unas claves de identificación dicotómicas en función de una serie de características morfológicas y una reactiva a las tinciones diferenciales clásicas. Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y de Jenkins et al. (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), color, ubicación respecto al flóculo, existencia de crecimiento epífitico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares, dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios. Las versiones más actualizadas, Eikelboom (2000, 2006) y Jenkins et al. (2004), son una modificación de las claves de identificación de Eikelboom y van Buijsen (1983) donde se recogen las bacterias filamentosas más frecuentes en fangos activos. Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos en EDAR de aguas residuales, sin embargo no dan información fiable sobre la identidad exacta de los filamentos observados, por ello, los filamentos son designados con los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de especie. La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar dificultosa por una serie de razones:  Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y de la experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.  Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer iguales.  Algunos filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de identificar y cuantificar.  Estructura abierta de los flóculos.  Elevada población de filamentos. Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una herramienta indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel microbiológico realmente
  32. 32. Ferrer-Roglán., 2014. 15 solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características morfológicas, por ello actualmente se sabe que la identificación de las bacterias del fango activo no puede llevarse a cabo utilizando sólo el método convencional (Nielsen et al. 2009b). 1.4.2. Técnica FISH Para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos, se emplean los métodos moleculares (Blackall, 1994; Bradford et al. 1996; Erhart et al. 1997; Kanagawa et al. 2000; Wagner et al. 1994), en particular la técnica de hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA marcadas con fluoróforos (FISH) ha sido particularmente productiva a la hora de llevar a cabo dicho objetivo (Nielsen et al. 2009b). Esta técnica es común para la detección e identificación de microorganismos en diferentes ambientes microbianos, en los que se incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de depuración con fangos activos (Amann et al. 1995). La técnica FISH se basa en la hibridación directa de la bacteria a identificar con una sonda complementaria de una región del gen 16S o 23S ARN ribosómico, que previamente se ha diseñado para que sea específica de la bacteria que se va identificar. La sonda está marcada con una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. . La especificad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos como son dominio, phylum, clase, familia, género o especie para la identificación de las bacterias presentes en el fango activo. Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos parámetros determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón de hibridación (Alonso et al. 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72ºC por cada 1% de formamida utilizada y permite realizar la hibridación a 46ºC (Alonso et al. 2009). El paso final de la hibridación in situ es la detección de la sonda marcada que hibridó con las células. Para ello se requiere de un microscopio de epifluorescencia equipado con diferentes filtros para los diversos espectros de color, en este caso se debe tener en cuenta el tipo de fluorocromo con el que fue marcada la sonda y de esta manera emplear la longitud de onda adecuada que excitará el fluorocromo y emitirá la fluorescencia.
  33. 33. Ferrer-Roglán., 2014. 16 La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta una serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación:  Permite detectar varias especies o géneros en una misma muestra, utilizando una sonda para cada especie, género o grupo, marcada con fluoróforos distintos.  No se han detectado sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de hibridación.  Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados.  No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos (Nielsen et al. 2009b).  Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).  Se mantiene la morfología de la célula y el flóculo (Nielsen et al. 2009b).  Puede utilizarse junto a la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están vivas o no, siendo muy útil para la monitorización de estado de la microbiota durante la adicción de tóxicos para el control de “bulking” y “foaming”. Sin embargo se aprecian ciertas limitaciones:  La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está disponible.  Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes, pero aún no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.  Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas.  Las bacterias filamentosas con bajo contenido ribosomal no dan una señal fluorescente clara con la sonda.  Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal fluorescente con otras especies, si sus composiciones de rRNA son muy parecidas. Tales resultados positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación de sondas competidoras.  No entrega información sobre características importantes de fango, tales como la población de protozoos o las características del flóculo.
  34. 34. Ferrer-Roglán., 2014. 17 1.4.3. Análisis de imagen La tecnología de procesamiento digital de imágenes mejora la detección de la señal mediante la aplicación de técnicas sobre la imagen con el fin de hacerla más adecuada para una determinada aplicación o procesamiento posterior. Diversas aplicaciones informáticas han sido desarrolladas en el estudio del monitoreo microbiano en EDAR utilizando técnicas de análisis cuantitativo de imagen tal y como se recoge en la Tabla 3 (Costa et al. 2013). Tabla 5. Estudios sobre las técnicas y procesado de cuantificación y análisis de imagen Microscopio Aumentos Iluminación Adquisición de imágenes Software Referencias Stereo X50 Campo oscuro CCD cámara (±10) Microsoft Visual C++ Grijspeerdt and Verstraete (1997) Luz óptica X400 Contraste de fases CCD cámara Visilog 5.1 Amaral et al. (1999) Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara (70) Visilog TM 5 da Motta et al. (2001b) Luz óptica X100 Contraste de fases CCD cámara (50) Matlab Image Processing Toolbox Jenné et al. (2002) Luz óptica X1000 Contraste de fases CCD cámara (±12) Global Lab Image 2.10 Contreras et al. (2004) Luz óptica (filamentos) y stereo (agregados) X100 (filamentos), x100 (microagregados), x40 (macroagregados) Contraste de fases (filamentos) y campo claro (agregados) CCD cámara (±100) Matlab Araya-Kroff et al. (2004) Luz óptica X100 Campo claro Vídeo cámara (70) Visilog TM5 Pandolfi and Pons (2004) Micro lens - Iluminador halógeno CCD cámara (40) NI Vision Assitant Yu et al. (2009) Luz óptica y epifluorescencia X100, x200 Campo claro CCD cámara (150+100) Matlab Mesquita et al. (2011a, b) El análisis de imagen combinado con FISH es un sistema que se está expandiendo como técnica biológicas de análisis en EDAR. Esta técnica permite una rápida cuantificación de microorganismos (Hug et al. 2005) y una precisa caracterización de los agregados microbianos (Liu et al. 2010).
  35. 35. Ferrer-Roglán., 2014. 18 El sistema más sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la cámara CCD (Charge Coupled Device), la cual detecta fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio espectro de longitud de onda y que además, mediante un paquete informático apropiado para el análisis de imágenes, permite la digitalización y manipulación de las mismas. Otro equipo usado para FISH es el microscopio láser confocal (CLSM). Al restringir la señal a una sección fina de la muestra que se investiga, la fluorescencia desenfocada es removida, lo cual genera imágenes más definidas. El sistema es usado para muestras densas como fangos activos, biopelículas o cortes de tejidos. Así mismo, el CLSM ha permitido el recuento de microorganismos presentes en la muestra (Stoecker et al. 2010; Trujillo et al. 2010). Daims et al. (2001) desarrolló un protocolo para determinar la concentración de bacterias en muestras ambientales con la combinación de FISH, CLSM y análisis digital de imagen, demostrando la utilidad de esta técnica para células no distribuidas homogéneamente. Otros estudios se han realizado utilizando empleando FISH y análisis de imagen para conocer cómo la combinación del contenido y densidad de filamentos afecta a la decantación de la biomasa en sistemas de fango activo. En este caso se empleó el software ImageJ V1.37 (Jassby et al. 2014). 1.5. Parámetros operacionales del proceso de depuración. Los parámetros operacionales básicos de diseño más utilizados en el control y seguimiento de las EDAR son la carga másica (CM) y la edad del fango (EF) (Zornoza et al. 2012). La carga másica representa la relación existente entre la carga orgánica alimentada al reactor y los microorganismos presentes en él. Suele definirse como la demanda bioquímica de oxígeno en 5 días (DBO5) que llega diariamente al tratamiento biológico en relación con la masa de fangos en el reactor, los sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla (SSVLM) diarios en el reactor, o incluso puede definirse relacionando dicha DBO con los sólidos suspendidos totales del licor mezcla (SSLM), por ello es muy importante al hablar de carga másica establecer a qué concentración de sólidos está referida (Ferrer, 2007). La EF representa la relación expresada en días entre la masa de fango en el reactor y la masa de fangos eliminada diariamente de la instalación. Dicho parámetro da una idea acerca del tiempo de retención de los microorganismos en la EDAR, ya que estos siguen un ciclo desde
  36. 36. Ferrer-Roglán., 2014. 19 que son decantados y recirculados al reactor, hasta que salen por la corriente de purga de fangos en exceso. Las variables CM y EF conceptualmente guardan entre sí una relación inversa. Recientemente se ha demostrado que esta relación no siempre tiene lugar en una escala real. El sustrato puede variar en un espacio corto (días) o largo de tiempo (meses) y la temperatura puede fluctuar en mayor o menor grado en función de la estacionalidad y de la situación geográfica de las EDAR (Zornoza et al. 2012). Otro parámetro operacional es el Tiempo de Retención Hidráulico (TRH). El TRH se define como el tiempo medio de permanencia del agua o del fango en los reactores de la planta de eliminación de materia orgánica y nutrientes. Se obtiene a partir del volumen del reactor y del caudal de alimentación. El TRH de la mezcla de fango activo y afluente es un parámetro operacional del cual aparecen escasas referencias en los manuales de Eikelboom (2006) y Jenkins et al. (2004). Este es un parámetro hidráulico está relacionado indirectamente con la CM.
  37. 37. 2. OBJETIVOS
  38. 38. Ferrer-Roglán., 2014. 20 2. OBJETIVOS  El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal la identificación y cuantificación de la población de bacterias filamentosas del morfotipo Haliscomenobacter hydrossis en 4 EDAR (Quart Benáger, Castellón, Denia y Carraixet) de la Comunidad Valenciana, durante un período de un año.  Se estudiará la dinámica poblacional de Haliscomenobacter hydrossis y las relaciones entre las variables operacionales y físico-químicas, que pueden afectar a su actividad y crecimiento.  Como último objetivo se comparará el índice de Eikelboom con la técnica de FISH combinada con el análisis de imagen para la cuantificación de bacterias filamentosas. De esta forma se tratará de optimizar la metodología de cuantificación de bacterias filamentosas en muestras de agua de EDAR mediante la técnica de FISH combinada con el análisis de imagen.
  39. 39. 3. MATERIAL Y MÉTODOS
  40. 40. Ferrer-Roglán., 2014. 21 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Toma de muestras En el presente estudio se tomaron muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad Valenciana con una frecuencia quincenal durante un año. Las muestras analizadas en este proyecto son proporcionadas por el Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente (IIAMA). A continuación se presentan algunas de las características de estas depuradoras, así como sus esquemas de funcionamiento. 3.1.1. EDAR Quart Benàger (QB) La depuradora de Quart-Benàger (Figura 5) se ubica en la comarca valenciana de L´Horta Oest, dando servicio a los municipios de Alacuás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet, Valencia y Xirivella. Figura 5. Vista aérea EDAR Quart Benàger (QB) Según datos del 2013, trata un caudal de agua residual y urbana de 33.785 m3 /día, abasteciendo a una población de 154.421 habitantes equivalentes y presenta unos rendimientos de eliminación para sólidos suspendidos y DBO5 del 98% y del 95% para DQO. El tratamiento biológico se desarrolla en cuatro reactores paralelos anóxico-anaerobio de geometría rectangular (Figura 6).
  41. 41. Ferrer-Roglán., 2014. 22 Figura 6. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR QB 3.1.2. EDAR Cuenca del Carraixet (CX) La EDAR Cuenca del Carraixet (Figura 7) está ubicada en la comarca valenciana de L´Horta Nord, en el municipio de Alboraya. Trata un caudal de agua de 36.843 m3 /día, procedente de 13 municipios colindantes (177.666 he) según datos publicados del 2013 de la EPSAR. Para este mismo año, los rendimientos de eliminación obtenidos fueron para los sólidos suspendidos del 98%, para DBO5 del 97% y para DQO del 96%. Figura 7. Vista aérea EDAR Cuenca del Carraixet (CX)
  42. 42. Ferrer-Roglán., 2014. 23 La depuradora consta de cuatro líneas de agua residual compuestas de pretratamiento, tratamiento primario y tratamiento de biológico por el sistema convencional de fangos activados y desinfección. En cuanto al tratamiento de la línea de fangos primarios y en exceso, se realiza en cuatro líneas con espesamiento, digestión anaerobia, acondicionamiento químico y secado mecánico. Para el tratamiento biológico, cuenta con dos líneas aerobias: línea A+B y línea C+D, ambas con una zona anaerobia (Figura 8). Figura 8. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CX 3.1.3. EDAR Dénia - Ondara - (DE) La EDAR Dénia - Ondara – Pedreguer (Figura 9) se ubica en la provincia de Alicante, en la comarca de La Marina Alta y da servicio a los tres municipios que su nombre indica.
  43. 43. Ferrer-Roglán., 2014. 24 Figura 9. Vista aérea EDAR Dénia – Ondara – Pedreguer (DE) Trata un caudal de 17.086 m3 /día con una población servida de 66.414 he (datos EPSAR 2013). El tratamiento consta de una sola línea con proceso de oxidación total y tiene un rendimiento de eliminación del 97% para sólidos suspendidos, 97% de DBO5 y 95% de DQO (Figura 10). Figura 10. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR DE 3.1.4. EDAR Castellón de la Plana (CS) La EDAR de Castellón de la Plana (Figura 11) se encuentra localizada en la comarca de la Plana Alta en la provincia de Castellón, abasteciendo únicamente a dicha población.
  44. 44. Ferrer-Roglán., 2014. 25 Figura 11. Vista aérea EDAR Castellón de la Plana (CS) Para el año 2013, la EPSAR da como datos de funcionamiento un caudal tratado de 39.126 m3 /d, prestando servicio a 205.650 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de eliminación son los siguientes: 95% para SS, 96%para DBO5 y 93% para DQO (Figura 12). Figura 12. Diagrama de bloques de proceso de la EDAR CS 3.2. Muestreo La campaña de muestreos se realizó quincenalmente desde diciembre de 2008 a diciembre de 2009. Las muestras fueron simples realizadas de forma puntual. El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor biológico. Se tomaron 1.500 ml de licor mezcla con un recipiente de plástico, a partir de estas muestras se tomaron alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24 horas.
  45. 45. Ferrer-Roglán., 2014. 26 El transporte y conservación de las muestras en los botes fue en condiciones aerobias, dejando en los mismos una cámara de aire sobre el licor mezcla. En el caso que la planta presentaba problemas de espumas se tomaron muestras tanto del licor mezcla como de las espumas de forma independiente. Sólo se encontraron problemas de espumas en el periodo muestreado en la EDAR del Carraixet (CX). Todas las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque las plantas de tratamiento de Quart Benàger y Carraixet reciben además aguas industriales. En la Tabla 6 se muestra el número de líneas de tratamiento independientes de cada EDAR y el número de muestreos realizados en cada punto. El cómputo total de muestras fue de 148. Tabla 6. Número de muestras por depuradora EDAR Número de muestras Abreviatura Nº líneas Reactor Espumas QB 1 24 - DE 1 24 - CX 2 (A+B y C+D) 46 8 CS 2 (R1 y R2) 46 - A continuación se muestra por cada depuradora sus respectivas fechas de muestreos (Tabla 7):
  46. 46. Ferrer-Roglán., 2014. 27 Tabla 7. Relación de muestras estudiadas QB DE CS CX 04/12/08 R 10/12/08 R 03/12/08 R.1 03/06/09 R.2 10/12/08 R.(A+B) 22/07/09 R.(A+B) 17/12/08 R 22/12/08 R 03/12/08 R.2 17/06/09 R.1 10/12/08 R.(C+D) 22/07/09 R.(C+D) 14/01/09 R 08/01/09 R 17/12/08 R.1 17/06/09 R.2 23/12/08 R.(A+B) 16/09/09 R.(A+B) 28/01/09 R 21/01/09 R 17/12/08 R.2 01/07/09 R.1 23/12/08 R.(C+D) 16/09/09 R.(C+D) 11/02/09 R 04/02/09 R 15/01/09 R.1 01/07/09 R.2 07/01/09 R.(A+B) 30/09/09 R.(A+B) 25/02/09 R 18/02/09 R 15/01/09 R.2 15/07/09 R.1 07/01/09 R.(C+D) 30/09/09 R.(C+D) 11/03/09 R 04/03/09 R 28/01/09 R.1 15/07/09 R.2 21/01/09 R.(A+B) 14/10/09 R.(A+B) 25/03/09 R 16/03/09 R 28/01/09 R.2 09/09/09 R.1 21/01/09 R.(C+D) 14/10/09 R.(C+D) 07/04/09 R 01/04/09 R 11/02/09 R.1 09/09/09 R.2 04/02/09 R.(A+B) 14/10/09 Esp(A+B) 22/04/09 R 29/04/09 R 11/02/09 R.2 23/09/09 R.1 04/02/09 R.(C+D) 14/10/09 Esp(C+D) 06/05/09 R 13/05/09 R 25/02/09 R.1 23/09/09 R.2 18/02/09 R.(A+B) 27/10/09 R.(A+B) 20/05/09 R 27/05/09 R 25/02/09 R.2 07/10/09 R.1 18/02/09 R.(C+D) 27/10/09 R.(C+D) 03/06/09 R 10/06/09 R 11/03/09 R.1 07/10/09 R.2 04/03/09 R.(A+B) 27/10/09 Esp(A+B) 17/06/09 R 24/06/09 R 11/03/09 R.2 21/10/09 R.1 04/03/09 R.(C+D) 27/10/09 Esp(C+D) 01/07/09 R 08/07/09 R 25/03/09 R.1 21/10/09 R.2 01/04/09 R.(A+B) 11/11/09 R.(A+B) 15/07/09 R 22/07/09 R 25/03/09 R.2 04/11/09 R.1 01/04/09 R.(C+D) 11/11/09 R.(C+D) 09/09/09 R 16/09/09 R 22/04/09 R.1 04/11/09 R.2 29/04/09 R.(A+B) 11/11/09 Esp(C+D) 23/09/09 R 30/09/09 R 22/04/09 R.2 18/11/09 R.1 29/04/09 R.(C+D) 25/11/09 R.(A+B) 07/10/09 R 14/10/09 R 06/05/09 R.1 18/11/09 R.2 13/05/09 R.(A+B) 25/11/09 R.(C+D) 21/10/09 R 11/11/09 R 06/05/09 R.2 16/12/09 R.1 13/05/09 R.(C+D) 25/11/09 Esp(A+B) 04/11/09 R 11/11/09 Esp. 20/05/09 R.1 16/12/09 R.2 27/05/09 R.(A+B) 09/12/09 R.(A+B) 18/11/09 R 25/11/09 R 20/05/09 R.2 29/12/09 R.1 27/05/09 R.(C+D) 09/12/09 R.(C+D) 16/12/09 R 15/12/09 R 03/06/09 R.1 29/12/09 R.2 10/06/09 R.(A+B) 09/12/09 Esp.(A+B) 29/12/09 R 21/12/09 R 10/06/09 R.(C+D) 21/12/09 R.(A+B) 24/06/09 R.(A+B) 21/12/09 R.(C+D) 24/06/09 R.(C+D) 21/12/09 Esp(A+B) 08/07/09 R.(A+B) 08/07/09 R.(C+D) R: reactor Esp: Espumas A, B, C, D, R.1, R.2: diferentes líneas 3.3. Parámetros físico-químicos y variables operacionales 3.3.1 Parámetros físico-químicos Los parámetros físico-químicos se determinaron siguiendo los procedimientos normalizados (APHA, 2005). La fracción filtrada se ha obtenido a través de un filtro de lana de vidrio (Whatman GF/C), con un tamaño nominal de poro de 1.2 μm, y la fracción soluble se obtuvo a través de un filtro de 0.45 μm (Grady, 1989). Las tablas 8 y 9 muestran los parámetros medidos en el licor mezcla y en el afluente al reactor de las distintas EDAR. El índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento descrito por Jenkins et al. (2004), el cual se define como el volumen en ml ocupado por 1 g de fango seco después de decantar media hora.
  47. 47. Ferrer-Roglán., 2014. 28 Tabla 8. Parámetros físico-químicos determinados en el licor mezcla Parámetro Abreviatura Unidades pH Phlm Ud Sólidos suspendidos en el licor mezcla SSLM mg/l Sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla SSVLM mg/l Índice Volumétrico del fango IVF ml/g Nitrógeno total del licor mezcla NTSSVLM mg/g SSVLM Fósforo total del licor mezcla PTSSVLM mg/g SSVLM Temperatura T ºC Tabla 9. Parámetros físico-químicos determinados en el afluente al reactor Parámetro Abreviatura Unidades Nitrógeno Total NT mg/l Nitrógeno Amoniacal N-NH4 mg/l Fósforo Total PT mg/l Fósforo del ortofosfato PO4 mg/l DBO5/NKT DBO5NKT ud DBO5/PT DBOPT ud Carga de carbohidratos CCARBO Kg/d Proteínas Prote mg/l Ácidos grasos volátiles AGV mg/l 3.3.2 Parámetros operacionales Las variables operacionales determinadas durante la campaña de muestreo se muestran en la Tabla 10. Los valores de carga másica (CM) y tiempo de retención hidráulico en el reactor (TRHr) se determinaron calculando el promedio de los tres días anteriores al muestreo del licor mezcla. Los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos: <0,8, 0,8-2 y <2 ppm, expresados en porcentaje de tiempo (%), y por tanto representando indirectamente la variabilidad de oxígeno a lo largo del periodo de muestreo. La edad del fango (EF) determinada para cada depuradora fue aquella en la que el proceso se encontraba más estable. Tabla 10. Variables operacionales Parámetro Abreviatura Unidades Tiempo de retención hidráulico en reactor TRH3 Horas (h) Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo expresada en DBO5 CMdbo3 kgDBO5/kgSSVLM.d Carga másica promedio de los 3 días anteriores al muestreo expresada en DQOs CMdqo3 kgDQOs/kgSSVLM.d Edad de fango EF 7 Días Oxígeno disuelto en reactor Obajo, Omed, Oalt %
  48. 48. Ferrer-Roglán., 2014. 29 3.4. Fijación y permeabilización de las muestras El primer paso para realizar la técnica FISH es la fijación de las bacterias, para que su estructura celular se mantenga rígida y estática y se conserve su morfología, favoreciendo la penetración de las sondas. Para la permeabilización de las células se utilizan detergentes como el SDS (sodio dodecil sulfato). Los reactivos utilizados para la fijación de las muestras son diferentes según la pared celular de la bacteria (Gram positiva y Gram negativa). En el presente estudio, puesto que las bacterias analizadas fueron Gram negativas la fijación se realizó con paraformaldehido (PFA). Una vez fijadas las muestras, se conservan a -20ºC. Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a continuación: - Para bacterias Gram negativas:  Lavar 1ml de flóculo con 500μl de tampón salino fosfato (PBS) 1X (7000 r.p.m durante 3 minutos).  Añadir 3 vols de PFA (750 μl) a 1 vol (250 μl) de muestra y mantener a 4ºC durante 1-3h (mínimo 1h-máximo 18h).  Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y eliminar fijador.  Lavar las células con PBS 1X (500 μl).  Resuspender las células en PBS 1X (500 μl) y añadir etanol absoluto frío (4ºC) (500 μl) .  Guardar a -20ºC. La Figura 13 describe los pasos a realizar para las bacterias Gram -.
  49. 49. Ferrer-Roglán., 2014. 30 Gram - 1 ml de muestra Centrifugar 3 min 7000 rpm Lavar 1000 µl PBS 1X Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 250 µl PBS 1X + 750 µl PFA durante 3h a 4ºC Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 500 µl PBS 1X Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 500 µl PBS 1X + 500 µl EtOH abs Figura 13. Fijación de las muestras 3.5. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluorófors (FISH) 3.5.1. Preparación de reactivos para FISH En primer lugar se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en los procesos de fijación, lavado e hibridación. Paraformaldehido (Fijación) Los pasos a seguir para preparara este reactivo son los siguientes, debiéndose realizar en campana de extracción de humos:  Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC.  Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA).  Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta que la solución se haya clarificado.  Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X.  Ajustar el pH a 7,2 con HCl.  Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2 µm.  Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura.
  50. 50. Ferrer-Roglán., 2014. 31 Tampón fosfato salino (para fijación)  Concentración PBS 1X - NaCl.............…..…..7,60 g - NaH2PO4∙H2O....... 1,38 g - NaH2PO4∙H2O....... 1,78 g - Agua destilada.......1000 mL - pH 7,2  Concentración PBS 3X - NaCl.................... 22,8 g - NaH2PO4∙H2O.... 4,1 g - Na2HPO4∙H2O..... 5,3 g - Agua destilada.... 1000 ml - pH 7,2 - Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico. - Esterilizar por filtración 0,45 µm ó 0,2 µm y conservar a 4ºC. Solución de gelatina (preparación de portaobjetos) - Gelatina.................................... 0,1% - Sulfato potasico cromato ........ 0,01% (Sigma ref. C-5926, 12H20) - Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC en un baño. - Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10 mg sal de cromato 0,01%) en 100 ml de agua destilada en un vaso de precipitados, homogenizando la muestra agitando con una varilla. - Enfriar a 50ºC para sumergir los portas. Solución de limpieza de portaobjetos (preparación de portaobjetos) Etanol con 10% KOH (reactivo de limpieza). Etanol (para deshidratación) - 50% - 80% - 100%
  51. 51. Ferrer-Roglán., 2014. 32 Cloruro sódico 5M (tampón de hibridación y tampón de lavado) - Cloruro sódico.......... 292.2 g - Agua destilada.......... 1000 ml - Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta 1 litro. - Distribuir en alícuota. - Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración. EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a 20%) - EDTA 2H2O.....................186,1 g - Agua destilada................ hasta 1000 mL - Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con NaOH (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0). Completar hasta 1000 mL con agua destilada. - Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración. Tris-HCl pH 8.0 (tampón de hibridación y tampón de lavado) - Tris Base ........................ 121,1 g - H-Cl.................................. 42 ml de HCl concentrado - Agua destilada................ hasta 1000 ml - Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42 ml de HCl concentrado y completar hasta 1000 ml con agua destilada. - Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración. SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado) - SDS ........................ 10 g - Agua destilada....... Hasta 100 ml - Esterilizar por filtración. Agua Milli-Q Reactivo de montaje para evitar la pérdida de fluorescencia Vectashield® (Vector Laboratories, USA).
  52. 52. Ferrer-Roglán., 2014. 33 3.5.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar. Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de sulfato de potasio y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A continuación se detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos:  Lavar con solución de limpieza.  Enjuagar con agua destilada dos veces  Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental cubriendo los portas con papel aluminio).  Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0,1% con cromato sulfato potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC).  Secar al aire. 3.5.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos La aplicación de las muestras a los portaobjetos se realiza de la siguiente forma:  Poner un volumen entre 3 y 5 μl de muestra fijada al portaobjetos FISH. En este caso se ha puesto un volumen de 4 μl en cada pocillo del portaobjetos.  Secar al aire.  Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión.  Deshidratar en etanol 80% durante 3 minutos por inmersión.  Deshidratar en etanol 100% durante 3 minutos por inmersión.  Secar al aire. 3.5.4. Sondas utilizadas Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones se muestran en la Tabla 11. Asimismo, se especifica la secuencia de nucleótidos del extremo 5´al 3´ de las sondas y el porcentaje de formamida óptimo a utilizar (%F).
  53. 53. Ferrer-Roglán., 2014. 34 Tabla 11. Sondas empleadas en la identificación de bacterias filamentosas Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad %F Comentarios Referencia HHY GCCTACCTCAACCTGATT Haliscomenobacter hydrossis 20-25 Wagner et al. (1994) SAP-309 TCTCAGTACCCGTGTGGG Mayoría de miembros de Saprospiraceae 25 Tanto filamentos como células simples Schauer and Hahnn (2005) EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 0-50 Amann (1990) EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 0-50 Daims et al (1999) EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrumicrobiales 0-50 Daims et al (1999) Las sondas HHY y SAP-309 fueron marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud de onda de absorción es de 565nm y de emisión de 580nm, rojo). 3.5.5. Hibridación “in situ” Los pasos a seguir y reactivos utilizados del proceso de hibridación se describen en detalle a continuación:  Preparar la solución de hibridación con formamida en un microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (Tabla 12). Tabla 12. Tampón de hibridación según porcentaje de formamida Reactivo % DE FORMAMIDA 10% 20% 25% 30% 35% 40% 45% NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl HCl-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 998 µl 898 µl 798 µl 698 µl SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl  Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1µl de sonda en cada pocillo y repartir homogéneamente por todo el campo para HHY. En caso de que junto con la sonda se tengan que añadir sondas competidoras y/o facilitadoras se deberá hacer una combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad de 1 µl. A partir de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con la luz para evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo.  Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Falcon de 50 ml y echar sobre el papel la solución de hibridación sin sonda que sobra, para crear una atmósfera húmeda.  Introducir el portaobjetos dentro del tubo Falcon de 50 ml en posición horizontal.  Incubar a 46ºC durante al menos 1h 30 min.
  54. 54. Ferrer-Roglán., 2014. 35  Preparar 50 ml de solución de lavado (precalentar a 48ºC) para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los portaobjetos (Tabla 13). Tabla 13. Solución de lavado según porcentaje de formamida Reactivo % DE FORMAMIDA 10% 20% 25% 30% 35% 40% 45% NaCl 5M 4500µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl EDTA 0,5M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl HCl-Tris 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl H2O MiliQ 44,45ml 46,3ml 47,94ml 47,43 µl 47,75ml 47,06 µl 48,15ml SDS 10% 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml  Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro del tubo con la solución de lavado. Para proteger los tubos de la luz, se forran con papel de aluminio.  Incubar en un baño a 48ºC durante 15-20 minutos.  Lavar con agua MilliQ.  Secar al aire en la oscuridad.  Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC. 3.6. Observación al microscopio de epifluorescencia Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la observación con el microscopio y a la toma de imágenes. Para observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa utilizar un líquido de montaje (Vectashield) que evita el deterioro y la pérdida de fluorescencia. Se vierten unas gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos, con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre éste para que el líquido de montaje se extienda de forma uniforme por toda la muestra. A continuación se observa el pocillo a 600X con aceite de inmersión. El microscopio utilizado para la observación de las muestras ha sido un Olimpus BX 50 equipado con condensador de campo claro, contraste de fases e interferencial de Nomarsky y sistema de iluminación por epifluorescencia. Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olimpus DP 12 acoplada al microscopio con los filtros U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA).
  55. 55. Ferrer-Roglán., 2014. 36 3.7. Identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos La cuantificación de la población de filamentos se realizará de dos formas: siguiendo el criterio subjetivo de Eikelboom y por medio del análisis de imagen con el programa Matlab 7.1. 3.7.1. Criterio subjetivo de Eikelboom (2000,2006) Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los pocillos del portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia, una vez realizado el proceso de hibridación in situ. La densidad de organismos fue estimada según el criterio subjetivo propuesto por Eikelboom (2000, 2006), que establece el índice de filamentos (IF) dentro de una escala ordinal del 0-5 (Tabla 14). Tabla 14. Escala de valoración de organismos filamentosos IF Abundancia Descripción 0 “Ninguno” Ningún filamento presente 1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo 2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos 3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculo) 4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media (5-20/ flóculo) 5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculo) En la Figura 14 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de bacterias filamentosas. Figura 14. Criterio de valoración de abundancia de filamentos Este índice se utilizó para cuantificar la abundancia de Haliscomenobacter Hydrossis utilizando la sonda HHY en las 148 muestras correspondientes a las 4 depuradoras estudiadas.
  56. 56. Ferrer-Roglán., 2014. 37 3.7.2. Análisis de imagen con el programa Matlab 7.1 Para la cuantificación de los microorganismos de las muestras hibridadas de las 4 depuradoras objeto de estudio con las sondas HHY y SAP-309, se observaron las muestras con microscopio de fluorescencia, se capturaron las imágenes correspondientes y posteriormente fueron procesadas por el software desarrolado por Borrás (2008). Se realizaron fotos a unos 20 - 25 campos de cada pocillo; por cada campo se adquirieron dos fotos: una correspondiente a las bacterias objeto de estudio (sonda específica) y otra de toda la comunidad bacteriana (sonda EUBmix), y en ocasiones una tercera con el filtro de doble banda que ayuda a diferenciar las falsas señales de la sonda de hibridación. En total se realizaron 11.120 fotos aproximadamente, correspondientes a los 296 pocillos de todas las muestras (148 pocillos por cada una de las dos sondas que dieron resultados positivos). La toma de fotos de cada pocillo duró aproximadamente 20 minutos lo que dio un total de 5.920 minutos, equivalentes a 99 horas empleadas en la toma de fotos. Tras la captura de imágenes, éstas fueron tratadas con el programa Photoshop CS2 9.0, para la eliminación de falsas señales de la sonda de hibridación, con el objeto de que la cuantificación posterior fuera lo más precisa posible. El análisis de imagen se realizó haciendo uso del software de cuantificación desarrollado por Borrás (2008). Este software desarrollado para Matlab 7.1 descompone las imágenes digitales tomadas en RBG a escala binaria para realizar el conteo de píxeles a partir del cual se calcularán los porcentajes de la población de bacterias. El algoritmo del programa permite con un simple ajuste eliminar las partes de la imagen que no son de interés o que son falsos positivos mediante los parámetros Low_in y Gamma_in. Con el primero se consigue eliminar la parte de la imagen que representa imagen de fondo (background) y establece un valor de 0 a 1, por debajo del cual es un falso positivo (Borrás, 2008). El parámetro Gamma_in representa la forma de la curva que describe la relación entre los valores de intensidad de la imagen original y la nueva imagen. Cuando Gamma_in es menor a 1 la nueva imagen tendrá una intensidad más alta, es decir que será más brillante, si por el contrario este parámetro es superior a 1 la nueva imagen será más oscura (Borrás, 2008).
  57. 57. Ferrer-Roglán., 2014. 38 Todas las imágenes capturadas de cada pocillo se introducen en el software de cuantificación desarrollado por Borras, 2008, generando un archivo en Excel con los porcentajes de las áreas ocupadas por las bacterias estudiadas, su desviación estándar, así como su error estándar de la medida. Este error (incertidumbre) es calculado dividiendo la desviación estándar por la raíz cuadrada de “n”, donde n es el número de campos examinados (Borrás, 2008). En la Figura 15 se muestra el flujo de procesos para la cuantificación en el software utilizado. Figura 15. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias 3.8. Análisis estadístico Para el análisis estadístico de las todas las variables medidas se utilizó el paquete informático SPSS versión 19.0.

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