Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
Identificación y cuantificación de bacterias
filamentosas del género Thiothrix con la técnica
FISH en EDAR de la Comunidad...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
3
Agradecimientos
Lo primero dar las gracias a mis tutores Gonzalo C...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
4
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
5
Índice
1. Introducción...............................................
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
6
3.5.2.3 Sondas utilizadas ...........................................
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
7
Índice de Figuras
Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento d...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
8
Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet................................
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
9
Índice de Tablas
Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales ...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
10
Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variable...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
11
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
%SSVLM: Porcentaje de Sólidos suspendido...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
12
DQOs/PTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Fósforo To...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
13
PT: Fósforo total
PTs: Fósforo Total Soluble
PTLM: Fósforo total ...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
14
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
15
Resumen
Las bacterias que pertenecen al género Thiothrix se carac...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
16
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 17
1. Introducción
1.1 Las aguas residuales ...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 18
Tabla 1: Ejemplo composición de aguas res...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 19
o Microorganismos: destacan como componen...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 20
o Los programas de aplicación de la Direc...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 21
de DBO5 (materia orgánica biodegradable)....
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 22
Figura 1: Esquema de las etapas de tratam...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 23
Además en las EDAR se han desarrollado es...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 24
1.2.3 Microbiología de los Fangos activos...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 25
mucus. Son indicadores del buen funcionam...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 26
1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos act...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 27
1.3 Importancia de las bacterias filament...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 28
Los miembros del género Thiothrix, suelen...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 29
Una de las cualidades para definir los ra...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 30
2000).Esta diferencia entre los grupos ta...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 31
Figura 5. Árbol filogenético del género T...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 32
1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothr...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 33
volátiles, gránulos sudanofílicos y los g...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 34
información fiable sobe la identidad exac...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 35
La técnica FISH ha sido una técnica común...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 36
rRNA y se produce un híbrido DNA: RNA. La...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 37
Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 38
darán una señal fluorescente clara con la...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
I N T R O D U C C I Ó N 39
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
O B J E T I V O S 40
2. Objetivos
El control efectivo de muchos de l...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
O B J E T I V O S 41
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 42
3. Material y Métodos
3.1 Tom...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 43
3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PL...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 44
3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER
La d...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 45
cómputo total de muestras fue...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 46
o Añadir 3 vol de PFA (750 µl...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 47
Guardar a –20ºC
Resuspender 5...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 48
3.5.2 Hibridación in situ con...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 49
Tabla 6: Sondas empleadas en ...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 50
presentes en la siguiente tab...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 51
La escala de valoración de lo...
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 52
3.6 Análisis estadístico
Para...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Co...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y estudio de sus relaciones con parámetros físico-químicos y operacionales

134 views

Published on

Romera, V. (2013) Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y estudio de sus relaciones con parámetros físico-químicos y operacionales. Trabajo final de Máster en Ingeniería Ambiental. Valencia: Universitat Politècnica de València.
www.abgc.es

Published in: Environment
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

2013 - Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y estudio de sus relaciones con parámetros físico-químicos y operacionales

  1. 1. Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix con la técnica FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y estudio de sus relaciones con parámetros físico-químicos y operacionales. TRABAJO FINAL DE MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL Realizado por: Verónica Romera Lozano Dirigido por: Dr. José Luis Alonso Molina Dr. Gonzalo Cuesta Amat VALENCIA, Septiembre 2013
  2. 2. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 3 Agradecimientos Lo primero dar las gracias a mis tutores Gonzalo Cuesta Amat y José Luis Alonso durante este periodo a pesar de las dificultades que hayan tenido, muchas gracias por vuestra dedicación, correcciones y apoyo. También destacar el ambiente de trabajo en el Instituto Universitario del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) donde he podido trabajar con Yolanda, Irene, Paula, Mariela, Andrés e Inma, además de numerosas personas que han pasado y han coincidido conmigo; como Marta, Alba, Paula y Laura entre otros, aportándome su experiencia, consejos y sus amenas charlas en ratos difíciles. A Andrés Zornoza por su ayuda y su disposición siempre que lo he necesitado, por su paciencia en los ratos de trabajo y su aportación. A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR) por facilitar los datos para la realización de este estudio. A mi familia por sus esfuerzos, sus ánimos y su incondicional ayuda sin la cual este trabajo no estaría terminado. También agradecer a Iván los momentos de apoyo mutuos, las largas charlas sobre este tema y todo lo relacionado con él, además de sus horas acompañándome.
  3. 3. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 4
  4. 4. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 5 Índice 1. Introducción........................................................................................................................ 17 1.1 Las aguas residuales y su composición ................................................................................. 17 1.2 Tratamiento de aguas residuales.......................................................................................... 21 1.2.1 Fases del tratamiento.................................................................................................... 21 1.2.1.1 Tratamiento biológico............................................................................................... 22 1.2.2 Fangos activos:.............................................................................................................. 23 1.2.3 Microbiología de los Fangos activos.............................................................................. 24 1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos .................................................................... 26 1.3 Importancia de las bacterias filamentosas............................................................................ 27 1.3.1 Género Thiothrix ........................................................................................................... 27 1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii. ................................................... 31 1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis...................................................... 32 1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii ........................................................... 32 1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans................................................ 32 1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea. ............................................................. 33 1.4 Identificación de morfotipos filamentosos ........................................................................... 33 1.4.1 Microscopía convencional............................................................................................. 33 1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas...................................... 34 2. Objetivos ............................................................................................................................. 40 3. Material y Métodos............................................................................................................. 42 3.1 Toma de muestras................................................................................................................. 42 3.1.1 EDAR CARRAIXET........................................................................................................... 42 3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA .................................................................................... 43 3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA................................................................................................... 43 3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER................................................................................................. 44 3.2 Muestreo............................................................................................................................... 44 3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales ......................................................... 45 3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas................................................ 45 3.5 Técnica FISH........................................................................................................................... 45 3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras................................................................. 45 3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH)........... 48 3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón ............................................ 48 3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos.......................................................... 48
  5. 5. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 6 3.5.2.3 Sondas utilizadas ....................................................................................................... 48 3.5.2.4 Hibridación “in situ” .................................................................................................. 49 3.5.2.5 Observación al microscopio....................................................................................... 50 3.6 Análisis estadístico................................................................................................................. 52 3.6.1 Coeficiente de correlación de Spearman. ..................................................................... 53 3.6.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 54 3.6.3 Tratamiento por ordenador .......................................................................................... 57 4. Resultados ...........................................................................................................................59 4.1 Características morfológicas y estructurales de las bacterias filamentosas del género Thiothrix............................................................................................................................................. 59 4.2 Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix................... 62 4.2.1 Microscopia convencional............................................................................................. 62 4.2.2 Técnica molecular FISH.................................................................................................. 63 4.3 Comparación microscopía convencional-FISH ...................................................................... 65 4.4 Análisis estadísticos entre las bacterias filamentosas del género Thiothrix y los parámetros operacionales y físico-químicos......................................................................................................... 72 4.4.1 Análisis Bivariante. Coeficiente de Spearman............................................................... 72 4.4.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 76 5. Discusión..............................................................................................................................82 5.1 Técnica convencional versus FISH ......................................................................................... 82 5.2 Correlaciones de Spearman................................................................................................... 82 5.3 Análisis componentes principales ......................................................................................... 85 5.3.1 Parámetros físico-químicos del afluente....................................................................... 85 5.3.2 Parámetros físico-químicos del Licor Mezcla ................................................................ 85 5.3.3 Parámetros físico-químicos del efluente....................................................................... 86 5.3.4 Parámetros operacionales............................................................................................. 86 6. Conclusiones........................................................................................................................88 7. Bibliografía...........................................................................................................................90 8. Anexos .................................................................................................................................96
  6. 6. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 7 Índice de Figuras Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos ....... 22 Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR).................................................................... 22 Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967) ........................................................................ 27 Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002)................................................. 29 Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009)............................................... 31 Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH ............................ 36 Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos............................................... 37 Figura 8: Depuradora de Carraixet........................................................................................................ 42 Figura 9: Depuradora de Castellón........................................................................................................ 43 Figura 10: Depuradora de Denia........................................................................................................... 43 Figura 11: Depuradora de Quart........................................................................................................... 44 Figura 12: Protocolo de Fijación............................................................................................................ 47 Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso.......................................................................................... 51 Figura 14: Ejemplo de matriz ................................................................................................................ 52 Figura 15: Matrices análisis de Componentes Principales.................................................................... 56 Figura 16 A, B: A) Vista convencional, B) Vista con FISH sonda G123T, 1000X..................................... 59 Figura 17 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda G2M, 1000X.............................................. 60 Figura 18 A, B y C: A) Vista convencional, B) Vista FISH y C) Superposición capas vistas a y b sonda TFR, 1000X............................................................................................................................................. 60 Figura 19 A, B: A) Vista Convencional, B) Vista FISH sonda TFR, 1000X................................................ 61 Figura 20 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda TNI, 1000X ................................................ 61 Figura 21 A y B: A) Vista Convencional G2M, y B) FISH sonda G2M (Quart), 1000X............................. 62 Figura 22 A y B: A) Vista Convencional, B) FISH sonda TFR (Denia), 1000X .......................................... 62 Figura 23 A y B: A) Vista Convencional Thiothrix Eikelboomii, B) FISH sonda G2M (Quart) ................. 63 Figura 24 A y B: A) Vista Convencional y B) FISH sonda TNI (Castellón), 1000X ................................... 63 Figura 25 A, B y C: A) Vista Convencional, B) FISH y C) superposición de imagen FISH y Convencional Sonda TFR. (Denia)................................................................................................................................ 64 Figura 26: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.......................................................................................... 66 Figura 27: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia.......................................................................................... 67 Figura 28: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1........................................................................ 67 Figura 29: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón; Línea 2....................................................................... 68 Figura 30: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1....................................................................... 68 Figura 31: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2....................................................................... 69 Figura 32: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.......................................................................................... 69 Figura 33: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia.......................................................................................... 70 Figura 34: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1........................................................................ 70 Figura 35: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 2........................................................................ 70 Figura 36: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1....................................................................... 71 Figura 37: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2....................................................................... 71 Figura 38: ACP de las variables físico-químicas del afluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 77 Figura 39: ACP de las variables físico-químicas del licor mezcla con las sondas G2M, TNI y TFR......... 78 Figura 40: ACP de las variables físico-químicas del efluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 79 Figura 41: ACP de las variables operacionales con las sondas G2M, TNI y TFR.................................... 80
  7. 7. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 8 Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet................................................................................................... 96 Figura 43: Vista aérea EDAR DENIA....................................................................................................... 96 Figura 44: Vista aérea EDAR QUART...................................................................................................... 97 Figura 45: Vista aérea EDAR CASTELLÓN............................................................................................... 97
  8. 8. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 9 Índice de Tablas Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO)............................................ 18 Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica ..................................................................... 18 Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012) ........................................................... 20 Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012).................................... 20 Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos.......................... 26 Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas.................................... 49 Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida ...................................................... 49 Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida.............................................................. 50 Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos.................................................................. 51 Tabla 10: Interpretación de Coeficiente de Spearman ......................................................................... 54 Tabla 11: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L1........................................................................................................................................................... 64 Tabla 12: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L2........................................................................................................................................................... 64 Tabla 13: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L1........................................................................................................................................................... 65 Tabla 14: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L2........................................................................................................................................................... 65 Tabla 15: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Denia. 65 Tabla 16: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Quart. 65 Tabla 17: Variables mínimos, máximos, media y desviación estándar de todas las sondas................. 65 Tabla 18: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente.... 73 Tabla 19: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente continuación.......................................................................................................................................... 73 Tabla 20: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Licor mezcla.... 74 Tabla 21: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Efluente .......... 75 Tabla 22: Correlaciones Spearman de las sondas con las Variables operacionales............................. 75 Tabla 23: Matriz de componentes rotados con porcentajes de las varianzas...................................... 76 Tabla 24: Matriz de componentes rotados con el porcentaje de la varianza, licor mezcla.................. 78 Tabla 25: Matriz de componentes rotados del efluente con el porcentaje de la varianza .................. 79 Tabla 26: Matriz de componentes rotados de las variables operacionales, con el porcentaje de la varianza ................................................................................................................................................. 80 Tabla 27: Relación de muestras estudiadas. L.1: Línea 1; L.2: Línea 2; L(A+B): Línea A+B; L(C+D): Línea (C+D)...................................................................................................................................................... 98 Tabla 28: Listado completo de los parámetros físico-químicos y las variables operacionales, nomenclatura y ubicación en el tratamiento........................................................................................ 99 Tabla 29: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del afluente por depuradora.......................................................................................................................................... 101 Tabla 30: Media, desviación estándar e intervalos del afluente continuación................................... 102 Tabla 31: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del licor mezcla por depuradora.......................................................................................................................................... 103 Tabla 32: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del efluente por depuradora.......................................................................................................................................... 104
  9. 9. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 10 Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variables operacionales por depuradora. 104
  10. 10. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 11 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS %SSVLM: Porcentaje de Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla AGV: Ácidos Grasos Volátiles CAGV: Carga Másica de Ácidos Grasos Volátiles CARBO: Carbohidratos CCARBO: Carga Másica de Carbohidratos CM: Carga Másica CMDBO: Carga Másica de la Demanda Biológica de Oxígeno CMDQOs: Carga Másica de la Demanda Química de Oxígeno soluble CNT: Carga Másica del Nitrógeno Total CNTs: Carga Másica del Nitrógeno Total soluble CN-NH4: Carga Másica del Nitrógeno Amoniacal Cond: Conductividad del licor mezcla CPT: Carga Másica del Fósforo Total CPTs: Carga Másica del Fósforo Total Soluble CP_PO4: Carga Másica del Fósforo como ortofosfato CPROT: Carga Másica de Proteínas CS: Carga Másica del sulfuro CSO4: Carga Másica de Sulfatos CTA: Carga Másica de Tensoactivos DBO5: Demanda Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días DBOT: Demanda Bioquímica de Oxigeno total del efluente DBOs: Demanda Bioquímica de Oxígeno soluble del efluente DBO5/NKT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Nitrógeno Kjeldahl DBO5/PT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Fósforo Total DQOt: Demanda química de Oxígeno total efluente DQOtLM: Demanda química de Oxígeno total Licor mezcla DQOs: Demanda química de oxígeno soluble efluente DQOs/NKTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Nitrógeno Kjeldahl soluble
  11. 11. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 12 DQOs/PTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Fósforo Total soluble DQOLM: Demandad química de oxígeno del Licor Mezcla EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales EF: Edad del fango EPS: Sustancias poliméricas extracelulares EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes H2S: Ácido sulfhídrico he: Habitantes equivalentes IF: Índice de filamentos IVF: Índice volumétrico de Fango LM: Licor Mezcla NKTs: Nitrógeno amoniacal Kjeldahl soluble N_orgs: Nitrógeno Orgánico Soluble N_orgp: Nitrógeno Orgánico Particulado N_org: Nitrógeno Orgánico Total NT: Nitrógeno Total NTs: Nitrógeno Total Soluble NTLM: Nitrógeno total del licor mezcla NT SSVLM: Nitrógeno total de los Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla ODb: Oxígeno disuelto en el reactor biológico bajo <0,8 ppm ODm: Oxígeno disuelto en el reactor biológico medio 0,8-2 ppm ODa: Oxígeno disuelto en el reactor biológico alto >2 ppm PDQOs: Porcentaje de la Demanda Química de Oxígeno soluble en el afluente PROT: Porteínas P_org: Fósforo Orgánico P_orgs: Fósforo Orgánico Soluble P_orgp: Fósforo Orgánico Particulado P_PO4: Fósforo relativo al ortofosfato
  12. 12. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 13 PT: Fósforo total PTs: Fósforo Total Soluble PTLM: Fósforo total del Licor Mezcla PT SSVLM: Fósforo total de los Sólidos suspendidos Volátiles del Licor Mezcla rDBOf: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno filtrada del efluente rDBOT: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno Total del efluente rDQOt: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Total del efluente rDQOs: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno soluble del efluente rSST: Rendimiento de eliminación de los Sólidos suspendidos totales SO2: Dióxido de azufre SO3 2- : Sulfito SO4 2- : Sulfato SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla SSTefl: Sólidos Suspendidos Totales del efluente SSVLM: Sólidos en suspensión volátiles del Licor Mezcla Sulfu: Sulfuros Tªr: Temperatura reactor biológico Tensan: Tensoactivos TRHr: Tiempo de retención hidráulico en el reactor biológico
  13. 13. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 14
  14. 14. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 15 Resumen Las bacterias que pertenecen al género Thiothrix se caracterizan por rasgos morfológicos distintivos, como el crecimiento filamentoso y la acumulación de gránulos de azufre cuando se incubaron en presencia de sulfuro o tiosulfato. Los morfotipos Thiothrix se producen en plantas depuradoras municipales e industriales con y sin eliminación de nutrientes. Tradicionalmente, los problemas de “Bulking” filamentoso han sido controlados por microscopía clásica, como la observación morfológica y tinción policromática. Pocos trabajos se han llevado a cabo para la detección de Thiothrix en muestras de EDAR con procedimientos moleculares, tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH). En este estudio, se investigó varias EDAR de la Comunidad Valenciana con la técnica de FISH para analizar la composición de las especies y sus relaciones del género Thiothrix con parámetros físico-químicos y operativos. Las muestras de lodos activos se obtuvieron de cuatro EDAR de la Comunidad Valenciana y se analizaron por microscopía óptica cuantitativa y FISH. En el análisis de FISH se utilizó un conjunto de 10 sondas FISH ácidos nucleicos rRNA específicos que cubren el género y la especie Thiothrix. La abundancia de bacterias filamentosas en las 139 muestras de lodos activados se midió de acuerdo con el método de puntuación subjetiva de Eikelboom (2000), donde las observaciones se calificaron en una escala de 0 (ninguna) a 5 (crecimiento extensivo). Los filamentos de Thiothrix estaban presentes en los cuatro EDAR analizadas. En 92 (66,2%) de las muestras, los filamentos de Thiothrix se observaron con la sonda G123T. Era evidente que las poblaciones mixtas de Thiothrix sp. estaban presentes en las muestras de lodos activos investigados, las diferencias observadas estaban en la abundancia relativa de los diversos grupos. Estos resultados fueron apoyados por los resultados obtenidos mediante microscopía convencional. T. eikelboomii, T. nivea y T. fructosivorans eran comunes (IF> 3) en dos de los cuatro EDAR analizadas. No se detectó señal de fluorescencia con las sondas G1B (T. disciformis), G3M (T. defluvii) y Meg1028 + Meg 983 (Meganema perideroedes). El análisis de correlación de Spearman y el análisis de componentes principales (ACP) sugirió un comportamiento diferente entre las especies dentro del género Thiothrix. Thiothrix eikelboomii mostró una relación positiva con la temperatura del reactor (Tªr). Por el contrario, T. fructosivorans se relacionó negativamente con la temperatura del reactor, (Tªr). Las bacterias filamentosas T. nivea y T. fructosivorans se asociaron con altos valores de edad del fango (EF) y valores bajos de tasa de carga másica (CM). T. nivea mostró una relación positiva con el tiempo de retención hidráulico (TRHr) y negativa con los carbohidratos y las proteínas del afluente. Thiothrix eikelboomii y T. nivea se asociaron con déficit de nitrógeno y fósforo (DBO5/NT/PT).
  15. 15. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO 16
  16. 16. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 17 1. Introducción 1.1 Las aguas residuales y su composición Las aguas residuales contienen materias sólidas o líquidas evacuadas como desechos tras un proceso industrial, es lo que comúnmente conocemos como residuos. Estos residuos son la consecuencia de los diversos usos del agua. o Residuo de uso doméstico: se producen estos en la utilización de baños, cocina y lavado, los cuales contienen detergentes, restos de alimentos y restos sintéticos. o Residuos por el uso humano y animal: consisten en desechos fecales y orina, los cuales pueden transportar organismos patógenos que afectan a la salud humana. o Residuos Industriales Líquidos (Riles): elementos que las industrias vierten en las redes de alcantarillado tales como; metales, productos químicos y elementos sólidos, todos con serios efectos nocivos. o Agua de lluvia: al derivar hacia los alcantarillados las aguas de lluvias, estás arrastran gran cantidad de arena, hojas y ramas de árboles, pasto y otros elementos que se combinan con los otros residuos líquidos. Según la composición de estas aguas residuales pueden estar formadas por: o Agua Potable: las aguas residuales se componen mayoritariamente de agua potable. Esto es, agua convenientemente tratada para el consumo humano. o Sólidos: en las aguas residuales se encuentran todo tipo de sólidos distinguiéndose entre ellos los orgánicos y los inorgánicos: o Los sólidos orgánicos son sustancias que contienen carbón, hidrógeno y oxígeno, pudiendo alguno de estos elementos combinarse con nitrógeno, azufre o fósforo. o Los sólidos inorgánicos son sustancias inertes y no susceptibles de ser degradados, designándoseles comúnmente como minerales. Dentro de estos se incluyen arenas, aceites y sales minerales disueltas en el agua potable y sin propiedades combustibles. o Gases disueltos: las aguas residuales contienen pequeñas y variadas concentraciones de gases disueltos como el oxígeno, el cual está presente en el agua en su estado original, así como también disuelto en el aire que está en contacto con la superficie del líquido, el anhídrido carbónico, resultante de la descomposición de materia orgánica, el nitrógeno disuelto de la atmósfera, y el sulfuro de hidrógeno de compuestos de azufre tanto orgánicos como inorgánicos.
  17. 17. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 18 Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO) Componentes Henze, 1982 Tamaka et al.; 1991 ** Narkis et al.; 1980* *** DQO Total (g/m 3 ) 530 259 394 (350-443) 813 (600-1180) DQO soluble 40 Carbohidratos 12 6 57 (50-70) 36 (33-38) Proteínas 8 12 9 (2-20) 6 (2-9) Lípidos 10 19 27 (18-36) 14 (7-22) Surfactantes 5 6 8 Ácidos Grasos 19 3 10 (7-10) 4 (3-5) Ácidos húmicos 2 (6-12) 14 (8-18) Otros orgánicos 46 49 *Cantidades y rangos de 3 ejemplo por cada tipo de agua ** Agua residual nueva (10-60 minutos), *** Agua residual antigua (6-12 horas) Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica Concentración (mg/l) Fuerte Media Débil Sólidos totales 1200 700 350 Sólidos disueltos totales 850 500 250 Fijos 525 300 145 Volátiles 325 200 105 Suspendidos totales 350 200 100 Fijos 75 50 30 Volátiles 275 150 70 Sólidos Sedimentables (ml/l) 20 10 5 Demanda Bioquímica de Oxígeno, 5 días 20ºC (DBO5, 20º) 400 220 110 Carbono Orgánico Total (CCT) 290 160 80 D.Q.O. (Demanda Química de Oxígeno) 1000 500 250 Nitrógeno total como N2 85 40 20 Nitrógeno Orgánico 35 15 8 Amoniaco Libre 50 25 12 Nitritos 0 0 0 Nitratos 0 0 0 Fósforo (total como P) 15 8 4 Orgánico 5 3 1 Inorgánico 10 5 3 Cianuros (*) 100 50 30 Alcalinidad (como CaCO3) (*) 200 100 50 Aceites y grasas 150 100 50 Detergentes 15 10 5
  18. 18. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 19 o Microorganismos: destacan como componentes biológicos, o Bacterias: pueden tener dos comportamientos totalmente distintos. Beneficiosas para el sistema porque participan en la depuración, o dañinas porque alteran los procesos de depuración y pueden ser patógenas. o Organismos microscópicos y macroscópicos: metazoos, protozoos; que juegan un papel en el control de la población de bacterias libres y unidas al flóculo. o Virus: patógenos para los humanos. Una EDAR es una Estación Depuradora de Aguas Residuales, que recoge el agua residual de una población o de una industria y, después de una serie de tratamientos y procesos la, devuelve a un cauce receptor (río, embalse, mar…). Se distinguen dos tipos de EDAR principales: las urbanas y las industriales. Las EDAR urbanas reciben aguas residuales mayoritariamente de una aglomeración humana. Mientras que las industriales reciben las aguas residuales de una o varias industrias. El agua residual urbana en la mayor parte de España está formada por la reunión de las aguas residuales procedentes del alcantarillado municipal, de las industrias asentadas en el casco urbano y en la mayor parte de los casos de las aguas de lluvia que son recogidas por el alcantarillado. La mezcla de las aguas fecales con las aguas de lluvia suelen producir problemas en una EDAR, sobre todo en caso de tormentas, por lo que en las actuaciones urbanas recientes se están separando las redes de aguas fecales de las redes de aguas de lluvia. Habitualmente las autoridades que tiene encomendadas competencias medioambientales definen primero los usos que van a tener los cauces para así establecer las necesidades o situaciones críticas de los vertidos. Debemos distinguir, por lo general, dos grandes líneas maestras para empezar (en España): o La Directiva 217/ 91/CEE de la Unión Europea que establece los plazo para construir depuradoras y los tamaños de la población de que deben contar con una. Así mismo establece mecanismos y frecuencias de muestreo y análisis de las aguas residuales. El control se basa en los siguientes parámetros: sólidos en suspensión, DBO5, DQO, fósforo y nitrógeno. La transposición de la Directiva 91/271/CEE al derecho español, está contenida en el Real Decreto-Ley 11/1995, de 28 de Diciembre (BOE núm. 312, de 30 de Diciembre), por el que se establecen las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas. Por su parte, el Real Decreto 509/1996, de 15 de Marzo (BOE núm. 77, de 29 de Marzo) desarrolló el contenido anteriormente citado, mediante la incorporación de los Anexos contenidos en la Directiva 91/271/CEE, que no había sido incorporado inicialmente.
  19. 19. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 20 o Los programas de aplicación de la Directiva 91/271/CEE, en España, se han introducido mediante la aprobación del Plan Nacional de Saneamiento y Depuración de Aguas Residuales (1995-2005) (resolución de 28 de Abril de 1995 de la Secretaría de Estado de Medio Ambiente y Vivienda, por la que se publica el Acuerdo de Consejo de Ministros de 17 de Febrero de 1995). Existe la trasposición a la legislación española de esta Directiva y un Plan Nacional de Saneamiento y Depuración de Aguas Residuales. La comisaría de Aguas correspondiente a la cuenca donde se vierte las aguas tras su depuración, emite una autorización de vertido en la que se puede reflejar valores límite de vertido. La depuración consiste en la eliminación de la contaminación e impurezas contenidas en el agua a tratar. Los procesos utilizables para depuración depende del tipo de afluente pudiéndose estructurar en tres grandes bloques atendiendo a la naturaleza: físicos, químicos y biológicos. Los tres se basan en la separación del agua residual en dos fases: una contiene el agua limpia ya tratada y otra los sólidos sedimentables. En la Comunidad Valenciana, se depuró en el año 2011 un volumen de 474 hm3 /año, que la sitúa entre las primeras regiones españolas en el cumplimiento de la Directiva Comunitaria 271/91 sobre depuración. Al igual que en otras regiones como Cataluña se ha implantado un Canon de Depuración (Ley 2/1992), que se factura junto al recibo del agua potable, y se ha permitido financiar parte de las actuaciones previstas en el Plan Director de Saneamiento (1992). El número de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) existen en la región ascendía en el año 2011 a 460 unidades, que ofrecían cobertura a más de 5.962.911 Habitantes Equivalente (he). Se ha incrementado la capacidad de reducción de la carga media contaminante tratada por las EDAR en 2011 lo que supone una reducción del 1,71% respecto a la tratada en 2010, superando la carga máxima semanal los 11.652.951 he, la cual aumenta en un 5,7 % respecto a los registrados en el año 2010. Se ha favorecido que en 2011 las depuradoras eliminasen del agua 120.000 Tm de sólidos en suspensión y 122.000 Tm Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012) Concentración Porcentajes de Reducción DBO5 25 mg/l de O2 70-90 % DQO 125 mg/l de O2 75 % Sólidos en suspensión 35 mg/l de O2 90 % Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012) Concentración Porcentajes de Reducción h-e<100.000 P total 2 mg/l 80 % N Total 15 mg/l 70-80 % h-e>100.000 P Total 1 mg/l 80 % N Total 10 mg/l 70-80 %
  20. 20. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 21 de DBO5 (materia orgánica biodegradable). Actualmente, la Comunidad Valenciana, es una de las más avanzadas en materia de infraestructuras de reutilización, disponiendo de 41 EDAR con tratamiento terciario o avanzado con una capacidad total de 330,9 hm3 /año. Desglosando por provincias Valencia sería la de mayor aprovechamiento de aguas depuradas con el 65% seguida de Alicante con 28% y Castellón con 7%. 1.2 Tratamiento de aguas residuales Una EDAR comprende varias etapas de tratamiento colocadas en serie. Paralelamente a este tratamiento, un laboratorio de análisis, se encarga de controlar la calidad del afluente y efluente de la EDAR, así como de los parámetros de funcionamiento del procedimiento. El grado de tratamiento requerido para un agua residual dependerá fundamentalmente de los límites de vertido para el efluente en un determinado lecho receptor. 1.2.1 Fases del tratamiento En general en la bibliografía los distintos tratamientos de aguas residuales se dividen en pretratamientos, primarios, secundarios y avanzados o terciarios (figura 1 y 2). En el pretratamiento se eliminan los sólidos de mayor tamaño que pueden atascar o dañar la instalación posterior así como las gravas y arenas. En el primario se elimina parte de los sólidos suspendidos y la materia orgánica asociada a ellos, normalmente mediante operaciones físicas como la sedimentación. El efluente del tratamiento primario frecuentemente contiene una DBO relativamente elevada. El tratamiento de este efluente para eliminar la materia orgánica residual y la materia suspendida se conoce como tratamiento secundario. Este tratamiento se realiza normalmente mediante procesos biológicos con utilización de microorganismos. El efluente del tratamiento secundario tiene, generalmente baja DBO5 y sólidos suspendidos y puede contener varios mg/l de O2 disuelto. Para la reutilización del agua o para el control de la eutrofización de las aguas receptoras es necesario el tratamiento terciario, con el fin de eliminar los sólidos suspendidos, materia orgánica y nutrientes que quedan después del tratamiento secundario. Actualmente la distinción entre tratamiento primario, secundario y terciario resulta bastante arbitraria dado que muchos métodos modernos de tratamiento incluyen procesos físicos, químicos y biológicos en la misma operación. Así mismo, cuando la eliminación de nutrientes se realiza por vía biológica, estos procesos se suelen incluir en el tratamiento secundario, realizándose simultáneamente la eliminación de materia orgánica y nutrientes. (Ferrer y Seco; 2010) En el apartado 1.2.1.1 hablaremos más detenidamente del tratamiento biológico.
  21. 21. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 22 Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR) 1.2.1.1 Tratamiento biológico En la etapa biológica de la depuración se ponen en contacto las aguas residuales con unos microorganismos (bacterias, protozoos y metazoos). Estos crecen utilizando los contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de energía, convirtiéndolos en nueva biomasa, dióxido de carbono y otros compuestos inertes (Ferrer y Seco, 2007) que eliminan de ellas la mayor parte de la materia orgánica que puedan contener. De la acción sobre los compuestos biodegradables los microorganismos obtienen la energía para sus procesos vitales, como ya se ha mencionado anteriormente y dejan como productos finales unos fangos fácilmente sedimentables en depósitos diseñados a tal efecto y un agua depurada limpia que puede verterse sin prejuicio para el medio ambiente.
  22. 22. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 23 Además en las EDAR se han desarrollado esquemas de procesos orientados a la nitrificación, desnitrificación y eliminación de fósforo, incluyendo el citado anteriormente; de eliminación de materia orgánica. 1.2.2 Fangos activos: Existen varios métodos para el tratamiento de aguas residuales sin embargo el proceso de fangos activos se utiliza desde hace más de medio siglo y es el más extendido en la actualidad; a partir de la observación de que cualquier agua residual, doméstica o industrial, aireada durante cierto tiempo, reducía su contenido en materia orgánica, al mismo tiempo que se formaba un fluido con flóculos de bacterias. La observación en el microscopio del fluido muestra que se encuentra formado por una población heterogénea de microorganismos, que cambia continuamente con el tiempo como respuesta a la variación de la composición del agua residual y a las condiciones ambientales (Soddell y Seviour, 1990) Es imprescindible, para el buen rendimiento del proceso, que en los tanques de aireación se produzca una buena agitación persiguiéndose dos fines. En primer lugar que se obtenga una buena homogenización entre el agua residual y el fango activado de tal forma que todos los microorganismos del fango obtengan alimento. En segundo lugar mantener unas concentraciones de oxígeno disuelto lo suficientemente altas, que permitan el metabolismo de los microorganismos que conforman el fango activado. Para conseguir ambos fines, las cubas de aireación están dotadas de sistemas de aireación y/o homogenización. Con este proceso conseguimos un tratamiento aerobio que oxida la materia orgánica hasta dióxido de carbono (CO2), amoniaco (NH3), agua (H2O) y nueva biomasa celular. La etapa biológica de un proceso por fangos activos podemos dividirla en tres fases: los tanques de aireación, los decantadores secundarios y la línea de recirculación. En los tanques de aireación se realiza la mezcla entre el agua a tratar y el cultivo de microrganismos o fango activo, por medio de difusores o aireación mecánica. Esta mezcla, que se obtiene tras un período de agitación y oxigenación, se envía a los decantadores secundarios en los que se produce una separación en dos fases: por un lado la biomasa celular obtenida forma flóculos o también llamados fangos activos, que sedimentan en el fondo de los decantadores, por el otro el agua limpia. Es un proceso utilizado a escala mundial como tratamiento biológico secundario para aguas residuales domésticas (Bitton et al., 1999). Una parte de los fangos activos que quedan en la parte baja de los decantadores son enviados de nuevo a los tanques de aireación mediante la línea de recirculación para mantener una concentración adecuada de microorganismos, el resto de fangos se extrae del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el tiempo de retención celular. (Knobelsdorf et al, 2005).
  23. 23. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 24 1.2.3 Microbiología de los Fangos activos El proceso de separación de los fangos activos del agua tratada es uno de los pasos más importantes en la depuración biológica del agua residual, es por ello que tiene especial importancia en la formación del flóculo. Éste debe tener un tamaño que le permita soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar posteriormente, para obtener un sobrenadante fluido y claro. Los microorganismos del flóculo se mantienen unidos gracias a una matriz extracelular de naturaleza variable, que contiene material polisacárido, altos niveles de proteínas, DNA y sustancias húmicas y fúlmicas (Kerley y Foster, 1995; Frölund et al; 1995), es lo que se suele llamar biofloculación. Estos polímeros extracelulares (EPS); son segregados por las denominadas bacterias formadoras de flóculos. Centrándonos en la estructura del flóculo, está formado por microorganismos (bacterias, hongos, protozoos y algún metazoo), materia inorgánica y orgánica (≈ 60- 90% de la misma es volátil) y su tamaño oscila entre 1 y 1000 µm. Los flóculos se unen para formar el fango y se depositan en el fondo del tanque por sedimentación (Soddell y Seviour, 1990). A continuación describiremos cada uno de los microorganismos que forman la estructura del flóculo. o En los fangos activos los microorganismos más abundantes son las bacterias que forman el 95% de la biomasa. Principalmente intervienen en la eliminación de materia orgánica por distintas vías y en la eliminación de nutrientes. Además, sin las bacterias formadoras de flóculo y las bacterias filamentosas sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente clarificado y de calidad. o El segundo grupo más numeroso son los protozoos, que componen el 5% de la biomasa. Eliminan microorganismos patógenos de las aguas tratadas, ayudando a clarificar el efluente y favoreciendo la biofloculación. o Además podemos encontrar en raras ocasiones, hongos que pueden proliferar pero que no suelen competir con las bacterias por la utilización de materia orgánica disuelta, por tanto no los consideraremos relevantes para el proceso de depuración. o En los sistemas de depuración se suele atribuir a las algas el papel principal de proporcionar oxígeno a las bacterias, para que éstas puedan participar activamente en la eliminación de materia orgánica del agua residual (Ferrer, y Seco 2007). Por el contrario su excesivo crecimiento puede provocar graves problemas de atascos en las conducciones, aunque no son frecuentes en los procesos de fangos activos. o El último grupo son los rotíferos, que junto con los nematodos constituyen la cima de la cadena trófica, en el sistema de fangos activos. Principalmente son depredadores de organismos inferiores. Además los rotíferos eliminan bacterias dispersas y contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de
  24. 24. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 25 mucus. Son indicadores del buen funcionamiento de la depuración de las aguas tratadas. Cuando existen elevadas cantidades de rotíferos y nematodos en nuestro sistema, será un indicador de altas edades de fango y por lo tanto de cambios en la capacidad de depuración del fango activo. Basándose en la observación visual y en algunas medidas físicas, se ha sugerido que existen dos niveles de estructura en los flóculos del fango activo (Sezgin et al., 1978): o Microestructura: la confieren procesos de agregación microbiana y biofloculación. o Macroestructura: la proporcionan microorganismos filamentosos. Estos organismos forman una red o una espina dorsal dentro del flóculo en la que las bacterias floculadoras se adhieren. Cuando las bacterias formadoras del flóculo y las filamentosas crecen en equilibrio se forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y que sedimenta bien, permitiendo obtener un sobrenadante claro. Si este equilibrio no se da, aparecen problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la naturaleza del flóculo; lo que se conoce comúnmente como hinchazón de fangos o “Bulking”. Un crecimiento masivo de filamentosas que impide el acercamiento de los flóculos y dificulta la compactación y sedimentación de los flóculos. Al contrario de lo que pasaría sí la proporción de filamentosas fuera baja, a lo que conllevaría la aparición de pequeños y débiles flóculos que pueden aparecer en el clarificado de las aguas “flóculo punta de alfiler”.
  25. 25. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 26 1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos El proceso de fangos activos lleva asociado una serie de fallos en la formación de la microestructura o de la macroestructura del flóculo (Ferrer y Seco, 2007). Estos problemas ejercen un efecto negativo sobre la calidad del efluente, que impide alcanzar los objetivos de calidad en muchas circunstancias. A continuación en la tabla 5 podemos ver algunos de los problemas que se suelen dar con más frecuencia en las EDAR: Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos PROBLEMA CAUSA EFECTO Crecimiento disperso. Los microorganismos no forman flóculos, sino que están dispersos, formando sólo pequeños grupos o en células aisladas. Efluente turbio. No hay zona de sedimentación del fango. Limo (Gelatina) “Bulking” viscoso (también se ha denominado “bulking” no filamentoso). Los microorganismos aparecen entre grandes cantidades de limo exocelular. En casos severos este limo confiere al fango activo una consistencia gelatinosa. Reducción de los porcentajes de sedimentación y compactación. En casos severos no hay separación de sólidos y se pierde fango con el efluente del clarificador secundario. En casos más leves suele aparecer una espuma viscosa. Flóculo-alfiler “Pin- floc” o “Pinpoint floc”. Se forman flóculos pequeños, compactos, tenues, toscamente esféricos. Los mayores decantan rápidamente. Los menores decantan lentamente. Índice volumétrico del Fango (I.V.F.) bajo, y efluente turbio. Esponjamiento “Bulking”. Organismos filamentosos se extienden fuera de los flóculos por la solución, interfiriendo en la compactación y decantación del fango activo. I.V.F. alto, sobrenadante muy claro. Concentración del Fango Activo Recirculado (F.A.R.) y del Fango Activo en Exceso (F.A.E) baja. En casos severos hay pérdidas de fango con el efluente. El proceso de manejo de los sólidos resulta sobrecargado hidráulicamente. Manto ascendente. La desnitrificación en el clarificador secundario libera N2 gaseoso poco soluble que se adhiere a los flóculos de fango activo subiéndolos a la superficie del clarificador. Se forma una espuma de fango activo en la superficie del clarificador secundario. Formación de espumas y/o natas. Causado por:  Sobrenadantes no degradables  Presencia de GALO y en ocasiones de Microthrix parvicella. Grandes cantidades de sólidos del fango activo flotan formando espuma en la superficie de los elementos del tratamiento. Las espumas de Gordonia y Microthrix son persistentes y difíciles de eliminar mecánicamente. Se acumulan y pueden pudrirse. Los sólidos pueden pasar al clarificador y al efluente o derramarse de las cubas de aireación.
  26. 26. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 27 1.3 Importancia de las bacterias filamentosas Las bacterias filamentosas aparecen en todos los tipos de EDAR con procesos de fangos activos, siendo responsables de la mayoría de los problemas de “bulking” y “foaming” (Jenkins et al., 2004). Más de 30 morfotipos filamentosos han sido identificados en plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000) y muchos más han sido detectados en plantas que reciben agua de origen industrial (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006). Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la comunidad biológica de los fangos activos que están involucradas en la degradación de la materia orgánica. 1.3.1 Género Thiothrix Este género pertenece a la familia Thiothrichaceae, clase Gammaproteobacteria, acomoda un grupo importante de bacterias filamentosas relacionadas con el ciclo del azufre (figura 3), (Eikelboom y van Buijsen, 1981; Jenkins et al., 1993; Seviour et al., 1999). Se encuentran a menudo como grupos de bacterias filamentosas dominantes en el fango activo, y su proliferación puede llevar a una sedimentabilidad pobre de los flóculos (bulking). Alimento animal Alimento vegetal Materiacoloidal Muerte Bacteria anaerobia Sulfatos SO4 2- S elemental Proteínas vegetales. S orgánico Urea So4 2- Sulfitos S02, So3 2- Sulfuro H2S Materia orgánica residual. S orgánico. Proteína animal S orgánico Descomposición bacteriana Anaerobia Bacteria aerobia Oxidaciónquímicaparcial Bacteriadelazufre BacteriaAnaerobia Oxígeno Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967)
  27. 27. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 28 Los miembros del género Thiothrix, suelen ser filamentos de 0,7 – 2,6 µm de diámetro y 0,7– 5,0 µm de longitud, son filamentos multicelulares. Producen gonidios deslizantes al final de los filamentos. Son Gram negativo o Gram variable. No presentan flagelos pero si pueden contener un mechón o penacho fímbrico al final de los gonidios, pueden formar rosetas y tienen la capacidad intracelular de almacenar gránulos de azufre (Larkin y Strohl, 1983, Williams et al., 1987). Son bacterias aeróbicas o microaerofílicas. El rango óptimo de temperatura es de 15 - 30º; llegando a un máximo de 32 o 37ºC; y un mínimo entre 4 - 10ºC, además presenta un rango de pH óptimo para crecimiento entre 6,0 - 8,5. Se han aislado especies autótrofas facultativas, mixotróficas y heterotróficas. Utilizan compuestos orgánicos simples como sustrato para el crecimiento tanto en especies autotróficas facultativas como mixotróficas. Algunas cepas pueden contener biopolímeros de azufre dentro de invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células están creciendo en presencia de compuestos de azufre inorgánico reducido (Williams et al., 1987) creciendo autotróficamente y pudiéndose comparar con las proporciones cinéticas en aquellos organismos con crecimiento heterotrófico. En condiciones aerobias oxidan el S2- a S0 . ⁄ Esta información, combinado con el hecho de que hay otros organismos que compiten por este sustrato, verifica que el “bulking” causado por Thiothrix, es muy común cuando el agua residual es de origen séptico. Algunas, pero no todas las especies necesitan este almacenamiento para después reducirlo a azufre. (Winogradsky 1888). Las distintas especies de Thiothrix han sido encontradas en innumerables hábitat, desde las aguas naturales que contienen sulfuros (Jones et al., 1982; McGlannan y Makemson, 1990; Brigmon et al., 1994), sistemas de irrigación (Ford y Tucker, 1975) hasta sistemas de fangos activos de plantas de tratamiento de aguas residuales, donde su presencia en gran número contribuye directamente al problema de “bulking” (Eikelboom, 1975; Williams y Unz, 1985; Williams y Unz, 1989; Brigmon et al 1994; Tandoi et al., 1994; Wagner et al., 1994;). La implicación del género Thiothrix podría ser la causa del “bulking” en el fango activo en las plantas de tratamiento de aguas residuales, esta característica ha dado lugar a distintos estudios de su fisiología (Richard et al., 1985; Williams y Unz, 1985 a, b; Tandoi et al., 1994), ultra estructura (Williams et al., 1987; Brigmon et al., 1994b), características de crecimiento (Unz y Williams, 1989; Williams y Unz, 1989) e interacciones con metales pesados (Shuttleworth y Unz, 1991, 1993). (Howarth et al.; 1999) Desde la primera descripción de Thiothrix por Winogradsky (1888), se han validado cinco especies (Skerman et al., 1980; Howarth et al., 1999); los miembros de cada taxón forman un grupo filogenético distinto (Howarth et al., 1999; Kanagawa et al., 2000).
  28. 28. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 29 Una de las cualidades para definir los rasgos del género Thiothrix es la capacidad de formar rosetas. Sin embargo, algunas bacterias filamentosas como Leucothrix murcor también pueden forman rosetas y gonidios (Williams y Unz, 1985a; Brock, 1992). Los géneros Thiothrix y Leucothrix se han agrupado alternativamente juntos en la familia Leucotrichaceae en base a su fisiología (Reichenbach y Dworkin, 1981; Howarth et al., 1999). Posteriormente, Aruga et al.; 2002, (figura 4); publicaron una nueva clasificación y corrección del árbol filogenético de Thiothrix propuesto anteriormente por Winogradsky y Howarth. Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002) En este estudio se encontraron diferencias filogenéticas entre el grupo T. nivea y el tipo 021N de Eikelboom. Todas las cepas tipo 021N utilizaron varios tipos de azucares, incluyendo glucosa, manosa, maltosa y trehalosa, mientras que los miembros del grupo de T. nivea utilizaron pocos o ningunos de estos azucares. Los filamentos de Eikelboom tipo 021N son muy largos (varios milímetros en longitud), mientras que los filamentos del grupo T. nivea son de menor longitud. (Eikelboom, 1975; Williams y Unz, 1985a; Kanagawa et al., 2000). Estas diferencias han dado lugar a la separación del tipo 021N y T. nivea. Además el grupo Eikelboom tipo 021N pude dividirse en tres distintos subgrupos (I al III) en base a los datos filogenéticos. Se observó que la secuencia de 16S era similar entre cepas del grupo III y otros dos grupos entre el 89,7 y el 91%. Las cepas del grupo III están claramente diferenciadas del grupo I y II por su gran longitud y la capacidad de oxidar compuestos de azufre (Kohno, 1988; Kanagawa et al.,
  29. 29. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 30 2000).Esta diferencia entre los grupos también se aprecia en la habilidad para utilizar glicerol y butirato que tienen las cepas del grupo III. A parte de todo lo anterior, el grupo III se ha separado de los grupos I y II; y se ha designado como una nueva especie del genero Thiothrix. Las cepas del grupo III son filogenéticamente más cercanas a T. defluvii Ben 57T , designándolas con el nombre de T. flexilis. Las diferencias en las secuencias del gen 16S entre el grupo I y II, sugiere que las cepas del I y las cepas del II no son miembros de la misma especie. Diferentes autores (Stackebrandt y Goebel, 1994; Hiraishi y Ueda, 1994; Kanagawa et al., 2000), encuentran diferencias en la utilización del lactato y el carácter del poli-β- hidroxibutarato y la actividad catalasa. Para esta diferenciación se propone el nombre de una nueva especie para el grupo I llamado T. disciformis. Cinco de las cepas del grupo II, incluida T. eikelboomii AP3T , poseen la capacidad de reducir nitrato y utilizar algunas fuentes de carbono diferentes. Las secuencias del gen 16 S rDNA mostraron similitudes del 98,5 – 98,7% entre T. eikelboomii AP3T y las otras cuatro cepas. Estos resultados sugieren que las cinco cepas no pertenecen a una sola especie. Sin embargo, estas diferencias filogenéticas y fenotípicas podrían no ser definitivas en la división de las cepas en una nueva especie. Por tanto se propone la inclusión de todas ella en el grupo II (Aruga, 2002). En el último estudio publicado de relaciones filogenéticas (Chernousova, 2009), se estudian la secuencias de dos cepas comparadas con las secuencias depositadas en el banco de datos del NCBI. El análisis de estas secuencias ha revelado la elevada similitud entre el gen hsp 60 y el de T. fructosivorans QT (91,2 y 91,5% respectivamente para las cepas BLT y G1T ). Las características genotípicas y fenotípicas descritas en ese estudio sugieren la diferencia a nivel de especie previamente y al nivel de genero de Thiothrix para cada una de las cepas BLT y G1T . Se propone el nombre de Thiothrix caldifontis para la cepa G1T , G2, K2 y P y Thiothrix lacustris para la cepa BLT . Con lo cual el árbol filogenético del género Thiothrix quedaría de la siguiente manera (figura 5):
  30. 30. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 31 Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009) Actualmente las sondas FISH disponibles para los diferentes grupos y especies del género Thiothrix son: 021N y TNI (Wagner et al., 1994), y G1B, G2M, G3M y G123T (Kanagawa et al., 2000). Sin embargo, la sonda 021N, diseñada para detectar miembros del tipo 021N, ha hibridado con un número limitado de filamentos tipo 021N (Nielsen et al., 1998; Pernelle et al., 1998, van der Waarde et al., 1998; Kanagawa et al., 2000). 1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii. Thiothrix eikelboomii: (ei.kel.boom’i.i. M.L. gen. n. eikelboomii de Eikelboom; Denominada así en honor de D.H. Eikelboom, pionero en las claves de identificación morfológicas para bacterias filamentosas del agua residual). Las células forman filamentos multicelulares. La morfología celular en los filamentos no es constante, es pleomórfica. Las células discoidales en la base de los filamentos puede medir 1.0 - 3.0 µm de diámetro y 0.4 - 0.7 µm de longitud. Pueden observarse nudos en los filamentos. Gram–negativo o Gram-variable. Sin presencia de vaina. Forman rosetas en algunas pero no en todas las cadenas de filamentos. (Howarth et al., 1999) Se pueden observar inclusiones intracelulares de gránulos sudanofílicos y poli-β- hidroxibutirato. El crecimiento se produce en un rango de temperatura entre 10-33ºC, pero no suele presentar crecimiento a 37ºC. El rango de pH está comprendido entre los 6.5 - 8.5. Reacción oxidasa positiva. No hay ningún requisito de azufre inorgánico reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Los gránulos de azufre se depositan en invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células crecen en presencia de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidrolizan la gelatina. No hidrolizan el almidón, caseína y urea. Utilizan la glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa, manitol, piruvato, succinato, malato, acetato, lactato y propinato como fuente de carbón. Reducen el nitrato a nitrito.
  31. 31. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 32 1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis Las células son filamentos celulares suavemente curvados. Los filamentos son de más de 0,5 mm de longitud. Las colonias son como huellas dactilares. La morfología celular en los filamentos es variable, particularmente por la longitud y en las células presentan formas de disco u ovales. El tamaño de las células mayores va de 1,2 - 3,0 µm de diámetro y 0,5 - 3,0 µm de longitud. La elongación y el hinchamiento celular están siempre presentes. Los septos son claramente visibles entre células individuales. Gram negativa. Con ausencia de vaina. No se observan inclusiones de volutina. Los gránulos sudanófilos (PHB) son observados en el interior celular. El crecimiento ocurre en los rangos de temperatura de 14 – 32ºC y un rango de pH 7,0 - 7,9. La temperatura optima esta entre 25 - 30ºC. Con reacción positiva a la oxidasa. También catalasa positivos con presencia de burbujas violetas generadas cuando las células son expuestas a peróxido de hidrogeno. Cuando las células están creciendo en presencia de un compuesto inorgánico de azufre reducido, los glóbulos de azufre son depositados en invaginaciones de la membrana citoplasmática. El azufre inorgánico reducido no es requerido para el crecimiento. La glucosa, fructosa, manosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, manitol, succinato, piruvato, acetato, malato, butirato, hidroxibutirato, glutamato, glicerol y aspartato son utilizados como fuentes de carbono. La mayoría de las cepas utilizan citrato y alanina. No crecen con lactato, benzoato, xylosa, erititol, galactosa, lactosa, melobiosa, rafinosa, arabinosa, ramnosa, etanol, l-propanol, sorbitol, formato, gelatina o almidón. El crecimiento es inhibido por el 0,5 % (w/V) de cloruro sódico. No reducen el nitrato. El contenido de DNA en G+C es de 44-45 mol%. (Aruga; 2002) 1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii Las células son filamentos multicelulares muy finos, similares a varillas. Las células presentan distintos diámetros desde la base del filamento, donde miden 2,0 – 4,0 pm de diámetro y 0,5 - 2,0 µm de longitud, mientras que las demás células del filamento miden 1,0 - 2,0 µm de diámetro y 5,0-10 µm longitud. Las células presentan formas irregulares, pueden ser cilíndricas u ovales (forma de barril). Generalmente son Gram- negativas. No presentan vaina. Pueden forman rosetas y gonidios aunque estas características no están presentes en todas las cepas. Las células pueden depositar intracelularmente azufre elemental en presencia de compuestos reducidos de azufre inorgánico. No presenta gránulos de volutina, pero sí gránulos de poli-β- hidroxibutirato. El crecimiento óptimo lo presenta en el rango de temperaturas 10 - 30 ºC. Esta bacteria es de crecimiento muy lento y no ha sido posible determinar las propiedades bioquímicas de este organismo. La cepa tipo es Thiothrix defluvii Ben57 '. 1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans Las células son varas de 1.2 – 2.5 µm y 1.2 - 2.5 µm de longitud, y forman filamentos multicelulares. Gram negativa. No presenta flagelo pero presentan un mechón fímbrico al final del gonidio. Presencia de vaina. Suelen forman rosetas. Las inclusiones
  32. 32. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 33 volátiles, gránulos sudanofílicos y los gránulos de poli-β–hidroxibutirato se observan en el interior de las células. El crecimiento ocurre en el rango de temperatura de 4 – 28º C y un pH de 6.5 – 8.5, pero no hay crecimiento a 33ºC. Son positivos a la oxidasa y a la catalasa, pero a esta última débilmente. No hay ningún requisito de azufre inorgánico reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Se depositan los glóbulos de azufre dentro de las invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células crecen en presencia de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidroliza la gelatina pero no el almidón, la caseína, ni la urea. La fructosa, sacarosa, piruvato, succinato, malato, acetato, lactato, son utilizados, como fuente de carbono. El nitrato es reducido a nitrito. (Howarth et al., 1999) 1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea. El análisis filogenético (Kanagawa et al., 2002) mostró claramente las diferencias entre el grupo T. nivea y Eikelboom tipo 021N, con menos del 92.0 % de similitud en las secuencias del gen 16S rDNA entre ellos. Todos los Eikelboom Tipo 021N utilizan varios tipos de azúcares, incluyendo glucosa, manosa y maltosa como fuente de carbono, mientras que los miembros del grupo T. nivea no utilizaron estos azúcares. Los filamentos de Eikelboom Tipo 021N son muy largos y pueden alcanzar varios milímetros de longitud, mientras los miembros de T. nivea son más cortos, alrededor de 1 mm de longitud (Eikelboom, 1975; Williams y Unz 1985 a; Kanagawa et al., 2000;). El grupo Eikelboom Tipo 021N forma colonias que son como huellas digitales en su identificación, característica distinta respecto de los miembros del grupo T. nivea (Williams y Unz, 1985 a; Kanagawa et al., 2000). El grupo Eikelboom Tipo 021N presenta metabolismo heterótrofo, sin el requerimiento de azufre reducido, mientras que T. nivea y T. unzii requiere azufre reducido para su crecimiento. 1.4 Identificación de morfotipos filamentosos 1.4.1 Microscopía convencional Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para determinar las características morfológicas. Eikelboom (1975), estableció una nomenclatura basada en la observación microscópica de las características morfológicas, que actualizaron posteriormente otros autores (Jenkins et al., 2004) Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y de Jenkins et al., (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), ubicación respecto al flóculo, existencia de crecimiento epifítico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares, dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios. Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos en plantas de tratamiento de aguas residuales, sin embargo no dan
  33. 33. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 34 información fiable sobe la identidad exacta de los filamentos observados, por este motivo, los filamentos son designados con los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de especie. Hoy en día se sabe que un morfotipo específico puede incluir varias especies y también puede ocurrir lo contrario, que varios morfotipos puedan representar una sola especie. La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar difícil: o Los filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de identificar y cuantificar. o El método convencional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y de la experiencia del que realiza la cuantificación e identificación. o Estructura abierta de los flóculos. o Elevada población de filamentos. o Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer iguales. Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una herramienta indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel microbiológico realmente solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser identificadas según sus características morfológicas, por ello actualmente se sabe que la identificación de las bacterias del fango activo no puede llevarse a cabo utilizando sólo el método convencional (Nielsen et al., 2009). 1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas Los métodos moleculares han sido utilizados para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos (Blackall, 1994; Wagner et al., 1994; Bradford et al., 1996; Erhart et al., 1997; Kanagawa et al., 2000;), en particular la técnica de hibridación in situ con sondas 16S DNA marcadas con fluoróforos (FISH) es considerada como la más apropiada para una correcta identificación de las bacterias filamentosas en las muestras de fangos activos (Nielsen et al., 2009). La mayoría de los morfotipos filamentosos de Eikelboom no han sido nombrados siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas y muchos reciben una identificación alfanumérica. Ello se debe principalmente a que muchos de estos microorganismos muestran una morfología celular diferente a la que presentan en los fangos activos. Esta situación está cambiando gracias al empleo de técnicas moleculares de caracterización y secuenciación del gen 16S rDNA, que empiezan a clarificar la posición taxonómica de los morfotipos de bacterias filamentosas.
  34. 34. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 35 La técnica FISH ha sido una técnica común para la detección e identificación de microorganismos en diferentes ambientes microbianos, en los que se incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de depuración con fangos activos (Amann et al., 1995). Las técnicas de identificación moleculares se basan en nuevas herramientas moleculares, que hacen posible tanto la determinación de la composición de comunidades microbianas, como la detección y cuantificación de especies dentro de las comunidades microbianas. Las técnicas moleculares más utilizadas en estos estudios de diversidad microbiana a nivel genético, son aquellas basadas en la amplificación y secuenciación del gen 16S, que codifica para la subunidad ribosómica bacteriana (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA). El ARN ribosómico 16S (o el gen que lo codifica) es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a principios de la década de 1970. Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al rRNA 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido sustituirle. De hecho, esta macromolécula presenta una serie de características, en base a las cuales fue considerado como cronómetro molecular definitivo (Woese, 1987): 1- Se trata de una molécula presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto una diana universal para su identificación. 2- Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios. 3- Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los rRNA 16S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los rRNA de la subunidad pequeña contiene, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismo más alejados, sino también los más próximos. 4- El tamaño relativamente largo de los rRNA 16S (1.500 nucleótidos) minimiza las fluctuaciones estadísticas (tamaño adecuado como para proporcionar información suficiente, con un coste asumible). 5- La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso. 6- Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los rDNA 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento. Esta técnica se basa en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de RNA que se quieren identificar. Estas sondas pueden unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23
  35. 35. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 36 rRNA y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con moléculas fluorescente (por ejemplo fluoresceína o rodamina) de forma que los híbridos formados sean fácilmente detectables con un microscopio de epifluorescencia. La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles, taxonómicos como son dominio, phylum, clase, familia, género y especie, para la identificación de las bacterias en sus diferentes comunidades naturales (Amann et al.; 1995) la hibridación directa de la bacteria diana con una sonda complementaria de una región del gen 16S o 23S rRNA. El elevado número de moléculas de rRNA (103 – 105 ) es una ventaja en la aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad (Amann, 1994). Una secuencia de DNA (sonda) puede unirse con una secuencia de RNA complementaria (16SrRNA o 23SrRNA) y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos parámetros determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón de hibridación (Alonso et al., 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72 º C por cada 1% de formamida utilizada y permite realizar la hibridación a 46 º C (Alonso et al., 2009). La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente 5’, se marca con un fluoróforo, como puede ser rodamina o fluoresceína. En las figuras 6 y 7 se muestran esquemas simplificados del proceso de hibridación in situ con sondas 16SrDNA con fluoróforos. Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH
  36. 36. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 37 Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta una serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación. Las cuales se comentan a continuación: o No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de hibridación. o Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados. o No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos (Nielsen et al., 2009). o Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años). o Se mantiene la morfología de la célula (Nielsen et al., 2009). o La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra no es habitual, por lo que no se dan resultados falsos positivos. o La especificidad de las sondas permite detectar varias especies o genes en una misma muestra, utilizando una sonda para cada especie, género o grupo, marcada con fluoróforos distintos, para la identificación de las bacterias en sus diferentes comunidades naturales. o Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están vivas o no, muy útil para la monitorización del estado de la microbiota durante la adicción de tóxicos para el control del “bulking” y del “foaming”. Además de todas las ventajas de la técnica molecular FISH anteriormente citadas, se aprecian ciertas limitaciones: o La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está disponible. o Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes, pero aún no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo. o Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas. o Su mayor limitación reside en la sensibilidad de la penetración de la propia sonda y de la matriz donde estemos hibridando, que depende del contenido de ribosomas existente en las bacterias filamentosas, si este contenido es bajo no
  37. 37. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 38 darán una señal fluorescente clara con la sonda; en muchos casos es necesario un tratamiento previo. o Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal fluorescente con otras especies, si sus secuencias de rRNA son muy parecidas. Tales resultados positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación de sondas competidoras. o La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según la molécula de rRNA de que se trate y la zona del mismo de la que sea complementaria, lo que hay que tener en cuenta para el diseño de la sonda.
  38. 38. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO I N T R O D U C C I Ó N 39
  39. 39. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO O B J E T I V O S 40 2. Objetivos El control efectivo de muchos de los problemas en el proceso de depuración se basa en la identificación de los microrganismos que lo causan y en la eliminación de las condiciones que favorecen su crecimiento. El crecimiento excesivo de las bacterias filamentosas puede interferir en el correcto funcionamiento del sistema de fangos activos produciendo problemas como la deficiente sedimentación del fango o la formación de espumas. El principal objetivo de este trabajo es la identificación y cuantificación de determinados morfotipos filamentosos del género Thiothrix, presentes en los fangos activos de varias EDAR de la Comunidad Valenciana y, estudiar las posibles relaciones con parámetros físico-químicos y operacionales. Para todo ello, en el presente trabajo se plantean los siguientes objetivos específicos: o Aplicar la técnica FISH a muestras procedentes de 4 plantas depuradoras de aguas residuales urbanas con sistemas de fangos activos de la Comunidad Valenciana (Carraixet, Castellón, Denia y Quart Benàger) para detectar la presencia de los morfotipos filamentosos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii, T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes” morfotipo 021N o Determinar la abundancia de siguientes especies del género Thiothrix: T. disciformis, T. eikelboomii, T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes” morfotipo 021N mediante el criterio subjetivo de Eikelboom 2000, 2006. o Comparar la abundancia de los morfotipos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii, T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes” morfotipo 021N obtenida con dos técnicas de detección diferentes: microscopía convencional y la técnica molecular FISH. o Estudiar las características morfológicas y estructurales de las bacterias filamentosas detectadas. o Estudiar las relaciones existentes entre los parámetros operacionales y físico- químicos de las EDAR y la abundancia de las diferentes especies de Thiothrix causadores de “bulking”.
  40. 40. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO O B J E T I V O S 41
  41. 41. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 42 3. Material y Métodos 3.1 Toma de muestras Se tomaron las muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad Valenciana con una frecuencia quincenal durante un año. En el Anexo I podemos encontrar imágenes aéreas de las 4 EDAR de estudio. A continuación se muestran los esquemas de funcionamiento y algunos datos de interés de las depuradoras elegidas para el presente estudio. 3.1.1 EDAR CARRAIXET La planta de depuración Cuenca del Carraixet se ubica en la comarca de La Ribera Alta, en el municipio de Alzira, en la Comunidad Valenciana, es capaz de tratar agua procedente de 4 municipios consiguiendo unos rendimientos del 98 % para sólidos en suspensión (SS), 95 % de DBO5 y del 91 % para DQO, según la información publicada por la EPSAR en el año 2012. Cuenta con dos líneas aerobias de tratamiento biológico, línea A+B y línea C+D, ambas con una zona anaerobia (figura 8.). El caudal tratado es de 33.584 m3 /d abasteciendo a una población de 96.230 habitantes equivalentes (he). Figura 8: Depuradora de Carraixet
  42. 42. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 43 3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA La EDAR de Castellón de la Plana se encuentra localizada en la comarca de la Plana Alta en la provincia de Castellón. Para el año 2012 el caudal tratado era de 43.220 m3 /d, prestando servicio a 193.773 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de eliminación son los siguientes: 95 % para SS, 95% para DBO5 y 91 % para DQO (Figura 9) 3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA La EDAR Denia-Ondara-Pedreguer se ubica en la comarca de La Marina Alta, en la provincia de Alicante. Da servicio a los municipios de Denia, Ondara y Pedreguer. Trata un caudal de 17.089 m3 /d y abastece a una población de 45.152 según datos del año 2012 publicados por la EPSAR. El tratamiento consta; (figura 10) de una sola línea con proceso de oxidación total y tiene un rendimiento de eliminación del 97% para sólidos en suspensión, 95% de DBO5 y 93% de DQO. Figura 10: Depuradora de Denia Figura 9: Depuradora de Castellón
  43. 43. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 44 3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER La depuradora de Quart-Benàger se ubica en la comarca valenciana de L’Horta Oest. Da servicio a los municipios de Alaquás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet, Valencia y Xirivella. El tratamiento biológico tiene lugar en cuatro reactores paralelos anóxico-aerobio de geometría rectangular (figura 11). Según datos de 2012, trata un caudal de 35.903 m3 /d, abastece a una población de 166.942 y tiene unos rendimientos de eliminación del 98% para SS, 98% para DBO5 y 95% para DQO. Figura 11: Depuradora de Quart 3.2 Muestreo El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor biológico. Se tomaron 1,5 l de licor mezcla con un recipiente de plástico, de estas muestras se tomaron unas alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24 horas. Los muestreos se realizaron cada quince días durante el año 2009. El muestreo comenzó en Diciembre de 2008 y finalizó en Diciembre de 2009. Las muestras fueron simples realizadas de forma puntual. Para el transporte y conservación de las muestras fue necesario mantener las condiciones aerobias de la muestra, lo cual se logró con la cámara de aire que queda sobre el licor mezcla en el recipiente de recogida. Las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque la planta de tratamiento de Quart-Benàger recibe además aguas industriales. El número de líneas de tratamiento independientes se distribuye de la siguiente manera Quart-Benàger y Denia con una línea cada una, total de muestras a analizar 24. Las depuradoras de Carraixet y Castellón contaban con dos líneas independientes cada una; por lo tanto se tomaron 46 muestras en cada una de las EDAR con dos líneas. El
  44. 44. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 45 cómputo total de muestras fue de 140 muestras. En el Anexo II encontramos la relación de fechas de muestreo por depuradora estudiada. 3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales En las tablas expuestas en el anexo III se encuentran los parámetros físico-químicos analizados, su nomenclatura y unidades en los que se han utilizado y en el anexo IV las tablas con todos los parámetros donde aparecen los rangos, media y desviación estándar en cada depuradora. Estos parámetros se determinaron siguiendo los procedimientos normalizados (APHA, 2005) en las muestras de las distintas EDAR. El Índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento descrito por Jenkins et al., 2004. En el presente trabajo los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos: < 0,8 oxígeno disuelto bajo (ODb), 0,8 – 2 oxígeno disuelto medio (ODm) y > 2 ppm oxígeno disuelto alto (ODa). Anexo IV, tabla 33. 3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas El método clásico de identificación de microorganismos filamentosos se basa en el examen microscópico, principalmente a 1000X y con óptica de contraste de fases, de una serie de características morfológicas y estructurales de los filamentos. Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación son los anteriormente citados y descritos por Eikelboom (1975), y Jenkins et al., (2004). La cuantificación con el método clásico sólo se puede hacer de modo indicativo, ya que los microorganismos filamentos que se encuentran en el interior del flóculo pueden pasar inadvertidos, y además el método tradicional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y experiencia del personal que realiza la identificación y/o cuantificación. 3.5 Técnica FISH 3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras Para llevar a cabo la técnica FISH fue necesario fijar las bacterias. Este primer paso es necesario para que la estructura celular se mantenga rígida y estática y se conserve su morfología favoreciendo la penetración de las sondas. Para la fijación de las muestras se utilizó un reactivo diferente según la pared celular de la bacteria (Gram + o Gram -). En el caso de las bacterias de este estudio, Gram - la permeabilización se realizó con paraformaldehido. Una vez fijadas las muestras, se conservaron a -20ºC. Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a continuación para bacterias Gram -. o Lavar 1 ml de flóculo con 500 µl de PBS 1X (7000 r.p.m durante 3 minutos)
  45. 45. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 46 o Añadir 3 vol de PFA (750 µl) a 1 vol (250 µl) de muestra y mantener a 4ºC durante 3 h. o Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y eliminar fijador o Lavar las células con PBS 1X (500 µl) o Resuspender las células con PBS 1X (500 µl) y etanol absoluto (500 µl) y mantener a -20ºC En la figura 12 se describen los pasos a realizar.
  46. 46. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 47 Guardar a –20ºC Resuspender 500µl PBS 1X + 500µl EtOH abs Gram + 1 ml muestra Lavar 1000 µl PBS 1X Centrifugar 3 min 7000 rpm Centrifugar 3 min 7000 rpm Gram - Centrifugar 3 min 7000 rpm 1 ml muestra Lavar 1000 µl PBS 1X Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 250µl PBS 1X + 750µl PFA durante 3h a 4ºC Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 500µl PBS 1X Resuspender 500µl PBS 1X + 500µl EtOH abs Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 500µl PBS 1X + 500µl EtOH abs Centrifugar 3 min 7000 rpm Mycolata Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 500µl PBS 1X 1 ml muestra Lavar 1000 µl PBS 1X Centrifugar 3 min 7000 rpm Centrifugar 3 min 7000 rpm Resuspender 250µl PBS 1X + 750µl PFA durante 1 min Fijación Figura 12: Protocolo de Fijación
  47. 47. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 48 3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH) Para la hibridación de las muestras describiremos detalladamente todos los pasos a seguir. En el Anexo V, se describe la preparación de los reactivos para la técnica de hibridación. 3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar. Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de sulfato potásico y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A continuación se detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos. o Lavar con solución de limpieza o Enjuagar con agua destilada o Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental cubriendo los portas con papel aluminio) o Cubrir con gelatina por inmersión en la solución 0,1% con cromato sulfato potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC) o Secar al aire 3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos Los pasos para la aplicación de las muestras se describen a continuación: o Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en el portaobjetos FISH. En este caso se ha colocado un volumen de 5 µl en cada pocillo del portaobjetos o Secar al aire o Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión o Deshidratar en etanol 80% durante 3 minutos por inmersión o Deshidratar en etanol 100% durante 3 minutos por inmersión o Secar al aire 3.5.2.3 Sondas utilizadas Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones, así como su secuencia de nucleótidos del extremo 5’ al 3’ y el porcentaje de formamida óptimo a utilizar se muestran en la tabla 6. Las sondas marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud de onda de absorción es de 565 nm y de emisión de 580 nm, rojo) fueron las siguientes: G123T y G2M, Meg983 y Meg1028. Las sondas marcadas con el fluoróforo FAM (Fluoresceína) cuya longitud de onda de absorción es de 494 nm y de emisión de 518 nm (verde):G1B, G3M, TNI y TFR.
  48. 48. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 49 Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas Especificidad Sonda Secuencia (5’ – 3’) %FA Referencia Thiothrix G123T CCTTCCGATCTCTATGCA 40 Kanagawa et al., (2000) Comp. Thiothrix G123TC CCTTCCGATCTTCTACGCA 40 Kanagawa et al., (2000) T. Disciformis G1B TGTGTTCGAGTTCCTTGC 30 Kanagawa et al., (2000) T. eikelboomii G2M GCACCACCGACCCCTTAG 35 Kanagawa et al., (2000) T. defluvii G3M CTCAGGGATTCCTGCCAT 30 Kanagawa et al., (2000) T. nívea TNI CTCCTCTCCCACATTCTA 45 Wagner et al., (1994) T. fructosivorans TFR CTCCTCTCCCACACTCTA 35 Kim et al., (1994) Comp. TNI y TFR TEI TCCCTCTCCCACATTCTA 45/35 Kim et al., (2002) “Meganema perideroedes” Meg 983 CGGGATGTCAAAAGGTGG 35 Kragelund et al., (2005) “M. perideroedes” Meg 1028 CTGTCACCGAGTCCCTTGC 35 Kragelund et al., (2005) 3.5.2.4 Hibridación “in situ” Los pasos y reactivos del proceso de hibridación se describen en detalle a continuación: o En primer lugar se prepara la solución de hibridación con formamida en un microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (tabla 7) Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida Reactivo % de Formamida 10 20 25 30 35 40 45 NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl HCL-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 988 µl 898 µl 798 µl 698 µl SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl o Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1 µl de sonda en cada pocillo y repartir homogéneamente por todo el campo. En el caso de que junto con la sonda se tenga que añadir sondas competidoras se deberá hacer una combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad total de 1 µl de sonda. A partir de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con la luz para evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo o Poner un trozo de papel celulosa dentro de un tubo Falcón de 50 ml y verter sobre el papel la solución de hibridación restante sin sonda, este paso es necesario para crear una atmósfera húmeda en el tubo Falcón y favorecer la hibridación. o Introducir el portaobjetos en posición horizontal dentro del tubo Falcón de 50 ml o Incubar a 46ºC durante al menos 1 hora y 30 minutos o Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los portaobjetos se prepara 50 ml de solución de lavado mezclando los reactivos
  49. 49. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 50 presentes en la siguiente tabla dependiendo del porcentaje de formamida que ha sido utilizado en la solución de hibridación (Tabla 8) Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida Reactivo % de Formamida 10 20 25 30 35 40 45 NaCl 5M 4500 µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl EDTA 0,5 M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl HCL-TRIS 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl H2O MiliQ 44,45 ml 46,3 ml 47,94 ml 47,43 ml 47,75 ml 47,06 ml 48,15 ml SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml l o Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro del tubo con la solución de lavado, los tubos se forran con papel de aluminio para protegerlos de la luz. Incubar en un baño a 48ºC durante 15 – 20 minutos. o Lavar con agua Mili-Q o Secar al aire en la oscuridad o Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC 3.5.2.5 Observación al microscopio Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la observación con el microscopio y a la toma de imágenes. A la hora de observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa utilizar un líquido de montaje (Vectashield) para evitar la pérdida de fluorescencia. Se añaden unas gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos, con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre éste para que el líquido de montaje se extienda de forma uniforme por toda la muestra, a continuación se observa el pocillo a 600X. El microscopio utilizado para la observación de las muestra ha sido un Olimpus BX 50. Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olimpus DP 10 acoplada al microscopio con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA) Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los pocillos del portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia una vez realizado el proceso de hibridación in situ. Se realizó la valoración de la abundancia de las bacterias filamentosas utilizando la escala subjetiva de Eikelboom (2000, 2006).
  50. 50. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 51 La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra en la tabla 9. Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos Índice filamento Abundancia Descripción 0 “Ninguno” Ningún filamento presente 1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo 2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos 3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculos) 4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media(5-20/flóculos) 5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculos) En la figura 13 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de las bacterias filamentosas. Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso
  51. 51. MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO M A T E R I A L E S Y M É T O D O S 52 3.6 Análisis estadístico Para el análisis estadístico de todas estas variables medidas se utilizó el paquete informático IBM Statistics SPSS versión 19. En el análisis primeramente se realizó un resumen estadístico donde se tabularon los valores mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada una de las variables operacionales, variables físico-químicas del afluente, del efluente y del licor mezcla presentes en los fangos (Anexo IV). Se integraron todo los datos de las cuatro depuradoras para obtener una matriz general con un elevado número de muestras (140) y realizar primero un análisis preliminar bivariante. Este análisis bivariante sirve para establecer la asociación existente entre la abundancia de los distintos morfotipos filamentosos con las variables del proceso de depuración, además de servir como análisis exploratorio junto con el análisis de componentes principales. Este primer análisis consistió en el cálculo del coeficiente de Spearman siendo un análisis de medida no paramétrica sin hacer ninguna suposición de la ordenación de las variables. En el análisis estadístico se emplearon 140 variables medidas; habiendo sido transformadas previamente para conseguir una distribución normal, (Esteban et al., 1991) con la consiguiente transformación logarítmica, “LN (variable+1)”, dando lugar a una matriz semejante a la que se muestra en la figura 14 de forma esquemática el tratamiento estadístico de los datos. Figura 14: Ejemplo de matriz Físico-químicas Operacionales Muestras140 Afluente Efluente

×