Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

2013 - Dinámica poblacional de las comunidades de bacterias nitrificantes en una EDAR con sistema convencional de fangos activos

1,521 views

Published on

Más información en www.abgc.es

Published in: Science
  • Be the first to comment

2013 - Dinámica poblacional de las comunidades de bacterias nitrificantes en una EDAR con sistema convencional de fangos activos

  1. 1. DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES   DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES  EN  UNA  EDAR  CON   SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS.   TRABAJO FINAL DE MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL Autora: BARBARROJA ORTIZ, PAULA Directores: DR. ALONSO MOLINA, JOSÉ LUIS DR. BORRÁS FALOMIR, LUIS Valencia, Septiembre 2013
  2. 2.  
  3. 3. AGRADECIMIENTOS   Especialmente a mis directores, José Luis y Luis, por compartir conmigo sus conocimientos, por sus útiles consejos y por su tiempo. Al IIAMA por permitirme realizar este trabajo con ellos. A Andrés por su paciencia y por su dedicación en este trabajo. A mis compañeros de máster por el tiempo compartido. A todo el personal del departamento de Química y Microbiología del Agua, por los cafés y por el apoyo recibido. Especialmente a Mariela por sus consejos y a Marta, Alba y Vero, porque sin vosotras no habría sido lo mismo. A mi familia, especialmente a mi madre y a mi tío, por el apoyo que me han dado. A mis amigos, por estar presentes a pesar de las distancias, especialmente a Maria y Ana por animarme tanto. Y muy especialmente a Txema, por compartir conmigo los buenos momentos y los no tan buenos, has sido mi pilar y mi fuente de energía.
  4. 4.  
  5. 5.     iii RESUMEN   La eliminación de nitrógeno es uno de los proceso clave en las estaciones depuradoras de aguas residuales debido a los problemas de eutrofización que el nitrógeno causa en las aguas receptoras. El sistema más comúnmente empleado para este cometido es la nitrificación- desnitrificación vía nitrato. El primer paso de este proceso es llevado a cabo por las bacterias oxidantes del amonio (BOA) y las bacterias oxidantes del nitrito (BON), las cuales presentan una alta sensibilidad a los factores ambientales y parámetros operacionales. En este trabajo se ha utilizado la técnica molecular de hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos (FISH) junto con microscopía de epiflurorescencia y análisis de imagen para la identificación y cuantificación de la población de bacterias nitrificantes presentes en el licor mezcla una EDAR con sistema de aireación prolongada y eliminación biológica de nitrógeno. Las muestras fueron tomadas quincenalmente durante un año. Se han realizado estudios bivariantes y multivariantes para determinar que variables explican mejor la dinámica poblacional de las comunidades de bacterias nitrificantes en relación a las variables físico-químicas y operacionales de la EDAR. Para la identificación de las BOA se utilizaron las sondas Nso1225, Nmo218, NEU, Nse1472 y NmV, de las cuales las tres primeras dieron una abundancia significativa y establecieron a N.oligotropha como la especie dominante en la oxidación del amonio a nitrito. Para la identificación de BON se utilizaron la sonda NIT3 y Ntspa 662, siendo en este caso Nitrospira el género responsable de la oxidación de nitrito a nitrato. Tras la observación de la dinámica poblacional este estudio sugiere que la estabilidad en los rendimientos de nitrificación no está necesariamente ligada a una comunidad de bacterias nitrificantes constante. Los resultados del análisis estadístico revelaron que la dinámica poblacional estaba influenciada por las concentraciones de nitrógeno del afluente, la temperatura, la edad del fango y la carga másica. ABSTRACT   Nitrification is the key process in wastewater treatment plants (WWTPs) in order to reduce eutrophication of recipient waters. Nitrogen is commonly removed by oxidation of ammonium via nitrite. The first step in this process is carried out by the ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and nitrite-oxidizing bacteria (NOB). Both are highly sensitive to environmental factors and operational parameters. By using fluorescence in situ hybridization (FISH) and epifluorescence microscopy, we followed biomass changes during 1 year in the mixed liquor of the WWTP with extended aeration and biological nitrogen removal system. In order to study the correlations between microbial community structures and environmental variables we used Canonical Correspondence Analysis (ACC). Ammonium oxidizing bacteria (AOB) were identified by using Nso1225, Nmo218, NEU y Nse147 and NmV probes. The first three ones
  6. 6.   gave us an important abundance and revealed the dominance of N. oligotorpha in the ammonium oxidation. Nitrite oxidizing bacteria (NOB) were identified using NIT3 and Ntspa 662 probes, with Nitrospira as dominant NOB specie. This study suggests that stable nitrogen removal efficiency is not necessarily linked to a stable AOB community. Results reported that the dynamics of AOB community were associated with total nitrogen influent, mixed liquor temperature, sludge retention time (SRT) and Food-to-Microorganism ratio (F/M). RESUM   La eliminació de nitrogen és un dels processos clau en les estacions depuradores d’aigües residuals (EDAR) degut als problemes d’eutrofització que el nitrogen causa en les aigües receptores. El sistema emprat habitualment per a portar a terme aquest procés és la nitrificació- desnitrificació via nitrat. El primer pas d’aquest procés es portat a terme pels bacteris oxidants de l’amoni (BOA) i els bacteris oxidants del nitrit (BON), els quals presenten una elevada sensibilitat als factors ambientals i paràmetres operacionals. En aquest treball s’ha utilitzat la tècnica molecular d’hibridació in situ amb sondes marcades amb fluoròfors (FISH) junt a microscòpia de eplifluorescència i tractament d’imatge per a la identificació i quantificació de la població de bacteris nitrificants presents en el licor-mescla una EDAR amb sistema de ventilació prolongada i eliminació biològica de nitrogen en mostres preses quinzenalment durant un any. S’ha realitzat estudis de correlacions bivariants i multivariants per a determinar quines variables expliquen millor la dinàmica poblacional de les comunitats de bacteris nitrificants en relació a les variables fisicoquímiques i operacionals de la EDAR. Per a la identificació dels BOA s’utilitzaren les sondes Nso 1225, Nmo 218, NEU, Nse 1472 i NmV, de les quals les tres primeres donaren una abundància significativa i establiren a N. oligotropha com l’espècie dominant en l’oxidació d’amoni a nitrit. Per a la identificació de BON es va utilitzar la sonda NIT3 i Ntspa 662 i en aquest cas va ser Nitrospira el gènere responsable de l’oxidació de nitrit a nitrat. Després de l’observació de la dinàmica poblacional aquest estudi suggereix que l’estabilitat en els rendiments de nitrificació no està necessàriament lligada a una comunitat de bacteris nitrificants constant. Els resultats de l’anàlisi estadístic revelaren que la dinàmica poblacional estava estretament associada amb l’entrada de nitrogen en l’afluent, la temperatura, l’edat del fang i la càrrega màssica.
  7. 7.     v LISTADO  DE  ACRÓNIMOS     ACC Análisis de correspondencias canónicas ACP Análisis de componentes principales AM Análisis multivariante Amo Enzima Amonio monooxigenasa AOA Arqueas Oxidantes del Amonio ARU Aguas Residuales Urbanas BOA Bacterias oxidantes del amonio BON Bacterias oxidantes del nitrito DBO Demanda Biológica de Oxígeno DQO Demanda Química de Oxígeno EDAR Estación Depuradora de Aguas Residuales FISH Fluorescense in situ hybridization EF Edad del Fango HAO Enzima Oxidorreductasa hidroxilamina NKT Nitrógeno Kjeldhal MBR Membrane bioreactor. Nxr Enzima Nitrito oxidoreductasa OD Oxígeno disuelto TRH tiempo de retención hidráulico
  8. 8.  
  9. 9.     vii ÍNDICE   1. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1 1.1. EL CICLO DEL NITRÓGENO ...................................................................................... 4 1.1.1. El nitrógeno en las aguas residuales ................................................................................5 1.2. BIOQUÍMICA DEL PROCESO DE NITRIFICACIÓN ........................................................ 7 1.3. PRINCIPALES ORGANISMOS QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE NITRIFICACIÓN .. 8 1.3.1. Bacterias Oxidantes del Amonio.....................................................................................9 1.3.2. Bacterias Oxidantes del Nitrito.....................................................................................11 1.4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COMUNIDADES MICROBIANAS ................................................................................................................ 13 1.5. TÉCNICAS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA MUESTRAS AMBIENTALES ................... 17 1.5.1. Análisis bivariante ......................................................................................................17 1.5.2. Análisis multivariante.................................................................................................19 2. OBJETIVOS...........................................................................................23 3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................25 3.1. DESCRIPCIÓN DE LA EDAR .................................................................................. 25 3.2. TOMA DE MUESTRAS............................................................................................. 26 3.3. VARIABLES FÍSICO-QUÍMICAS Y PARÁMETROS OPERACIONALES............................. 27 3.4. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU CON SONDAS MARCADAS CON FLUOROFOROS 28 3.4.1. Fijación de las muestras...............................................................................................28 3.4.2. Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón......................................................28 3.4.3. Aplicación de las muestras a los portaobjetos y permeabilización de las celulas. ................29 3.4.4. Hibridación in situ......................................................................................................29 3.4.5. Sondas utilizadas en el estudio .....................................................................................31 3.5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS ............................................................ 32 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ......................................................................................... 34 3.6.1. Tratamiento de datos realizado para determinar las correlaciones de Pearson y Spearman 36 3.6.2. Tratamiento de datos realizado en el análisis de componentes principales.........................36 3.6.3. Tratamiento de datos realizado en el análisis canonico de correspondencia.......................38 4. RESULTADOS.......................................................................................39 4.1. CAPTURA DE IMÁGENES DE LAS SONDAS CON SEÑAL DE HIBRIDACIÓN POSITIVA ... 39 4.2. CUANTIFICACIÓN DE LA SEÑAL DE HIBRIDACIÓN MEDIANTE TRATAMIENTO DE IMAGEN ......................................................................................................................... 43 4.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ENTRE LAS SEÑALES OBTENIDAS PARA LAS BACTERIAS BOA Y BON Y LOS PARÁMETROS OPERACIONALES DE LA EDAR ............................................ 46 4.3.1. Variables físico-químicas y operacionales utilizadas en el análisis estadístico ....................46 4.3.2. Análisis bivariante. Coeficientes de correlación de Pearson y Spearman ...........................48 4.3.3. Análisis multivariante. Análisis de componentes principales...........................................51 4.3.4. Análisis de correspondencias canonicas .........................................................................53
  10. 10.   5. DISCUSIÓN ..........................................................................................58 5.1. DINÁMICA POBLACIONAL ..................................................................................... 58 5.1. RENDIMIENTOS DE ELIMINACIÓN.......................................................................... 61 5.2. VARIABLES DEL AFLUENTE. .................................................................................. 61 5.3. VARIABLES OPERACIONALES................................................................................. 62 5.4. VARIABLES DEL LICOR MEZCLA............................................................................. 65 6. CONCLUSIONES ...................................................................................66 7. REFERENCIAS......................................................................................67
  11. 11.     ix ÍNDICE  DE  ECUACIONES     Ecuación 1. Oxidación del amoniaco a hidroxilamina........................................................... 7 Ecuación 2. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito.............................................................. 7 Ecuación 3. Formación de agua............................................................................................ 7 Ecuación 4. Oxidación de amonio a nitrito. .......................................................................... 7 Ecuación 5. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito.............................................................. 7 Ecuación 6. Formación de agua............................................................................................ 7 Ecuación 7. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito.............................................................. 8 Ecuación 8. Reacción global de nitrificación. ........................................................................ 8 Ecuación 9. Reacción de síntesis celular................................................................................ 8 Ecuación 10. Reacción global ............................................................................................... 8 Ecuación 11. Calculo del coeficiente de correlación lineal de Pearson .................................. 17 Ecuación 12. Calculo del coeficiente de correlación de Spearman. ....................................... 18 Ecuación 13. Vector de componentes ACP ......................................................................... 19 Ecuación 14. Modelización realizada en el ACP ................................................................. 20
  12. 12.  
  13. 13.     xi ÍNDICE  DE  FIGURAS     Figura 1. Ciclo del Nitrógeno (Metcalf &Eddy, 2000)............................................................ 4 Figura 2. Transformaciones del nitrógeno en el proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrato. (Metcalf &Eddy, 2000)...................................................................................... 6 Figura 3. Árbol filogenético de las bacterias amino oxidantes BOA basado en la secuencia del gen 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). .................................................................... 10 Figura 4. Árbol filogenético de las bacterias nitro oxidantes BON basado en la secuencia del gen 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). .................................................................... 12 Figura 5. Árbol filogenético del gen 16S rRNA basado en los linajes principales de bacterias amonio- oxidantes conocidas (Daims et al., 2009)......................................................... 14 Figura 6. Árbol filogenético del género Nitrosomonas inferido del análisis comparativo del gen 16S rRNA (Gieseke et al., 2000)................................................................................... 15 Figura 7. Árbol filogenético que muestra las relaciones de las BOA aisladas N. mobilis (sonda Nm93) y N. europea (sonda Nm103) y otras bacterias cercanas pertenecientes a la subclase Proteobacteria. (Juretschko et al., 1998). ......................................................... 16 Figura 8. Árbol filogenético del gen 16S rRNA basado en los linajes principales de bacterias nitrito-oxidantes BON conocidas (Daims et al., 2009)................................................... 16 Figura 9. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP. .............................. 20 Figura 10. Matriz de covarianzas ACC ............................................................................... 21 Figura 11. Esquema de depuración de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer (EPSAR)............ 25 Figura 12. Sondas utilizadas para la identificación de BOA ................................................. 31 Figura 13. Sondas utilizadas para la identificación de BON ................................................. 31 Figura 14. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias. .......................................... 34 Figura 15. BOA. A) sonda Nso 1225, B) Mismo campo sondas EUB338mix. 600X.............. 40 Figura 16. BOA. A) sonda NEU, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y NEU. 1000X. ............................................................................ 41 Figura 17. BOA. A) sonda Nmo 218, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y Nmo 218. 1000X....................................................................... 41
  14. 14.   Figura 18. BOA. A) sonda NmV, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y NmV. 1000X............................................................................. 42 Figura 19. BOA. A) sonda Nse 1472, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y Nse 1472. 1000X. ...................................................................... 42 Figura 20. BOA. A) sonda Ntspa 662, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y Ntspa 662. 1000X........................................................... 42 Figura 21. BOA. A) sonda NIT3, B) Mismo campo sondas EUB338mix, C) Mismo campo sondas EUB338mix y NIT3. 1000X............................................................................. 43 Figura 22. Modelo de hoja Excel de resultados extraídos del software de cuantificación ....... 43 Figura 23. Gráfico de análisis canónico de correspondencia para bacterias nitrificantes y variables del afluente................................................................................................... 54 Figura 24. Gráfico de análisis canónico de correspondencia para bacterias nitrificantes y variables del licor mezcla............................................................................................. 55 Figura 25. Gráfico de análisis canónico de correspondencia para bacterias nitrificantes y variables del efluente ................................................................................................... 56 Figura 26. Gráfico de análisis canónico de correspondencia para bacterias nitrificantes y variables operacionales................................................................................................ 57
  15. 15.     xiii ÍNDICE  DE  TABLAS     Tabla 1. Contaminantes de importancia en el tratamiento del agua residual ........................... 1 Tabla 2. Fraccionamiento del nitrógeno en las aguas residuales. ............................................ 5 Tabla 3. Rendimientos de eliminación en la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer...................... 26 Tabla 4. Esquema de la campaña de muestreo (Zornoza et al., 2010).................................... 26 Tabla 5.Variables físico-químicos del afluente, efluente y licor mezcla en relación a la campaña de muestreo ................................................................................................................ 27 Tabla 6. Parámetros operacionales...................................................................................... 27 Tabla 7. Solución de hibridación en función del porcentaje de formamida............................ 29 Tabla 8. Solución de lavado en función del porcentaje de formamida................................... 30 Tabla 9. Sondas utilizadas en el presente estudio ................................................................. 32 Tabla 10. Variables empleadas en el estudio y etiquetas ....................................................... 35 Tabla 11. Fecha de muestreos............................................................................................. 35 Tabla 12. Variables utilizadas para realizar el análisis de componentes principales ............... 37 Tabla 13. Resumen de los resultados de las señales de hibridación ....................................... 40 Tabla 14. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las BOA, desviación estándar y error de medida................................................................................................................... 44 Tabla 15. Promedio de las áreas en pixeles ocupadas por las BON, desviación estándar y error de medida................................................................................................................... 45 Tabla 16. Bacterias nitrificantes expresadas como mg SSVLM / L....................................... 46 Tabla 17. Media, desviación estándar (SD) y rango (máximo-mínimo) de los parámetros físico- químicos del afluente................................................................................................... 47 Tabla 18. Media, desviación estándar (SD) y rango (máximo-mínimo) de los parámetros físico- químicos del licor mezcla ............................................................................................ 47 Tabla 19. Media, desviación estándar (SD) y rango (máximo-mínimo) de los parámetros físico- químicos del efluente................................................................................................... 47
  16. 16.   Tabla 20. Media, desviación estándar (SD) y rango (máximo-mínimo) de los parámetros operacionales .............................................................................................................. 48 Tabla 21. Correlaciones de Pearson y Spearman entre las bacterias nitrificantes, los rendimientos de eliminación de nitrógeno y las variables físico-químicas del afluente .... 49 Tabla 22. Correlaciones de Pearson y Spearman entre las bacterias nitrificantes y las variables físico-químicas del licor mezcla ................................................................................... 50 Tabla 23. Correlaciones de Pearson y Spearman entre las bacterias nitrificantes con las variables físico-químicas del efluente............................................................................ 50 Tabla 24. Correlaciones de Pearson y Spearman entre las bacterias nitrificantes con las variables operacionales................................................................................................ 51 Tabla 25. Matriz de componentes rotados variables afluente................................................ 52 Tabla 26. Matriz de componentes rotados variables licor mezcla.......................................... 52 Tabla 27. Matriz de componentes rotados variables operacionales ....................................... 53 Tabla 28. Matriz de componentes en espacio rotado variables efluente................................. 53
  17. 17.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     1 1. INTRODUCCIÓN El agua es un factor determinante para el desarrollo de la vida, además cumple importantes funciones económicas, sociales y ambientales. Si bien este no es un recurso escaso, hay que tener en cuenta que se encuentra distribuido de manera poco homogénea y solo una pequeña proporción se encuentra disponible para su uso. El ser humano ha ido incrementando sus requerimientos de agua así como la cantidad y la carga contaminante de los vertidos a medios naturales. Esto es causa de alteraciones en la dinámica de los ecosistemas, lo que afecta a su capacidad de autodepuración y a la renovación y redistribución del agua dentro del ciclo hidrológico. En las últimas décadas se ha observado un creciente interés por la protección de este vulnerable recurso que ha motivado el desarrollo de políticas basadas en la eficiencia, reutilización y reciclado del agua. Estas se han traducido principalmente en la aplicación de herramientas legislativas para el control de vertidos y en el desarrollo de tecnologías de tratamiento más eficientes encaminadas a la reducción de la carga contaminante de los vertidos. Las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) son las encargadas de minimizar el impacto de estos vertidos en el medio receptor. La mayor parte de ellas emplean procesos biológicos para la degradación de la materia orgánica, eliminación de nutrientes, sólidos en suspensión y microorganismos patógenos, que son los principales compuestos contaminantes de las aguas residuales urbanas (ARU). En la tabla que se presenta a continuación podemos ver el efecto sobre el medio ambiente de cada uno de estos contaminantes en las ARU. Tabla 1. Contaminantes de importancia en el tratamiento del agua residual La eliminación de nutrientes suscita un especial interés debido a los problemas de eutrofización que su vertido causa en ríos, lagos y costas. La eutrofización se puede definir como el incremento progresivo de productores primarios (algas y plantas) debido a la alteración de alguno de los factores que limitan su crecimiento: temperatura, luz y nutrientes.
  18. 18. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   2 El crecimiento acelerado de estos organismos provoca una serie de cambios perjudiciales para los ecosistemas, los cuales se detallan a continuación (Martín, 2005): - Aumento de la turbidez debido a mayores concentraciones de fitoplancton en el agua. Ello da lugar a una menor penetración de la luz en la columna de agua y a la posible desaparición de la vegetación de fondo por falta de radiación solar. - Aumento de la toxicidad del agua debido a la producción de sustancias tóxicas por parte de algunas especies de fitoplancton. Esto puede tener graves consecuencias sobre la fauna piscícola, fauna terrestre que abastece de esas aguas y en los abastecimientos de poblaciones a partir de embalses eutrofizados. - Disminución de la biodiversidad en general, tanto especies de fitoplancton como de seres superiores. Se produce una simplificación notable de los ecosistemas, haciendo a éstos más vulnerables a posibles perturbaciones futuras. - Fluctuaciones notables en las concentraciones de oxígeno disuelto (OD) en el agua: altas durante el día y bajas por la noche debido al balance entre fotosíntesis y respiración del fitoplancton. En conjunción con épocas de alta temperatura y alta actividad de biodegradación de materia orgánica, puede dar lugar a periodos de varios días con niveles de OD extraordinariamente bajos. - Aumento notable de pH debido a la alta tasa de consumo de CO2 por parte de fitoplancton. El incremento de la concentración de nitrógeno en las corrientes de agua, debido al aporte derivado de la actividad antropogénica, es una de las principales causas de esta problemática en la actualidad. Han sido varias las iniciativas legislativas comunitarias relacionadas con la protección del medio frente a la problemática de la eutrofización y la gestión más eficiente del agua: - Directiva 2000/60/EC del Parlamento Europeo, cuyo objetivo es proteger el estado ecológico de las masas de agua continentales, aguas de transición, aguas costeras y aguas subterráneas. - Directiva 91/271/CEE, modificada por la Directiva 98/15/CE, en la que se establecen la obligación de disponer de sistemas colectores y tratar las ARU y ARI, así como los límites de vertido de los contaminantes procedentes de EDAR. Esta directiva introduce el concepto de zona sensible a la eutrofización haciendo referencia a la importancia de eliminar nutrientes, especialmente nitrógeno y fósforo. - Directiva 91/676/CEE para la protección de las aguas contra la contaminación producida por nitratos procedentes de fuentes agrícolas. La Directiva 91/271/CEE fue transpuesta al ordenamiento español a través de el Real Decreto Ley 11/1995 de 20 de Diciembre, en el se definen los criterios para la clasificación de los
  19. 19.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     3 puntos de vertido en “zona sensible” y “zona menos sensible” de los cuales dependen los requisitos de vertido. Este Real Decreto fue desarrollado por el Real Decreto 509/1996, modificado por el Real Decreto 2116/1998, en el que se desarrolla la normativa aplicable para el control de las ARU en España. Debido a la importancia que ha adquirido la eliminación de nitrógeno en las corrientes de agua residual, la nitrificación en las EDAR se ha convertido en uno de los procesos clave de la depuración. Este proceso biológico, que consiste en la oxidación secuencial aerobia de amonio a nitrito y de nitrito a nitrato, depende de la presencia de poblaciones de bacterias nitrificantes quimiolitoautótrofas encargadas de catalizar dicha transformación: las bacterias oxidantes de amonio (BOA) y las bacterias oxidantes del nitrito (BON). El lento crecimiento de las comunidades nitrificantes y la extrema sensibilidad que presentan a los factores ambientales y operacionales, entre los que se incluyen la temperatura, pH, OD, compuestos inhibidores (Posser, 1989), concentración de amonio y nitrito (Koops and Pommerening-Roser, 2001; Siripong and Rittmann, 2007), alcalinidad (Biesterfeld et al., 2003) y la disponibilidad de carbono inorgánico (Guisasola et al., 2007: Wett and Rauch 2003), hacen que el proceso de nitrificación sea un paso crítico a controlar en las estaciones depuradoras de aguas residuales. La técnica molecular de hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos (FISH) junto con la reciente aplicación de técnicas de cuantificación por tratamiento de imagen, se presentan como una de las mejores alternativas para el control y seguimiento de las poblaciones de bacterias nitrificantes debido a su rapidez y especificidad. Aunque un gran número de estudios han investigado la dinámica poblacional de las bacterias nitrificantes en los procesos de tratamiento de aguas residuales (Daims et al., 2001a; Limpiyakorn et al., 2005; Siripong and Rittmann, 2007; Whang et al., 2009; Huang et al., 2010), la mayoría de ellos relacionan de una forma independiente la influencia de algunos de estos parámetros operacionales y físico-químicos con el rendimiento del proceso de nitrificación. Sin embargo, la eficiencia del proceso en las EDAR es el resultado de la influencia conjunta de estos parámetros, siendo los estudios que los relacionan a escala real todavía escasos (Fukushima et al., 2013; Koops et al., 2006). Establecer las relaciones entre la comunidad de bacterias nitrificantes y las variables ambientales mediante análisis estadísticos avanzados, ayudará a esclarecer que parámetros son determinantes en el control del proceso para la mejora del rendimiento y ahorro de costes de explotación.
  20. 20. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   4 1.1. EL CICLO DEL NITRÓGENO La química del nitrógeno es compleja debido a los numerosos estados de oxidación en los que se puede presentar y al hecho de que el cambio en el estado de oxidación puede ser llevado a cabo por organismos vivos. La mayor parte del nitrógeno se encuentra en la atmósfera en forma diatómica y estado gaseoso a temperatura y presión ordinaria. En su forma elemental es relativamente inerte. El nitrógeno atmosférico es fijado a través de procesos biológicos, aunque en ocasiones también es transformado como resultado de procesos químicos espontáneos. Los organismos responsables de esta fijación son bacterias y algas (bacterias simbióticas como Rhizobium, las Cianobacterias o bien bacterias libres como Azobacter), que transforman este nitrógeno en nitrógeno inorgánico asimilable por los seres vivos (NH! ! , NO! ! y NO! ! ). La mayor parte del nitrógeno que encontramos en el suelo está en forma orgánica debido a la descomposición y procesos metabólicos de plantas y animales. El nitrógeno orgánico pasará a nitrógeno amoniacal tras la mineralización. La materia proteica no asimilable es convertida en gran medida a amonio por la acción de las bacterias saprófitas, bajo condiciones aerobias o anaerobias. El amonio liberado puede ser usado por las plantas para producir proteínas, el sobrante tras esta asimilación es oxidado por las bacterias nitrificantes. Los nitratos producidos en el proceso de nitrificación pueden servir como fertilizantes para las plantas y los que se producen en exceso, pueden acabar en el agua principalmente a través de la percolación y la escorrentía. Figura 1. Ciclo del Nitrógeno (Metcalf &Eddy, 2000)
  21. 21.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     5 En el medio acuático el nitrógeno se encuentra mayoritariamente en forma de nitrógeno amoniacal o nitrógeno nítrico, aunque también puede estar presente como óxido nitroso y nitrógeno orgánico incorporado a sustancias orgánicas. La cantidad de nitrógeno en las aguas ha aumentado debido al uso de fertilizantes nitrogenados empleados en la agricultura, llegando a causar la contaminación de los recursos superficiales y subterráneos. El nitrato es la forma predominante por tratarse del compuesto más estable, convirtiéndose de este modo en el contaminante más común. Tanto en el suelo como en el agua la proporción entre estas formas del nitrógeno en sus diferentes estados de oxidación depende del proceso de nitrificación. Bajo condiciones anóxicas los nitritos y nitratos son reducidos a través del proceso de desnitrificación a N2, que regresará a la atmósfera de este modo. En la actualidad existen otros focos de emisión de compuestos nitrogenados originados por actividades antropogénicas como la quema de combustibles fósiles y otros procesos industriales como la fabricación de abonos y amoniaco. 1.1.1. EL NITRÓGENO EN LAS AGUAS RESIDUALES El nitrógeno en las aguas residuales procede principalmente de la metabolización de las proteínas del cuerpo humano. Fundamentalmente aparece como nitrógeno orgánico, amoniacal, nitrato y nitrito en concentraciones variables, siendo el nitrógeno amoniacal y el orgánico las formas predominantes. El sumatorio de estos cuatro compuestos da como resultado el nitrógeno total, a la suma del nitrógeno inorgánico y el amoniacal se le denomina N-Kjeldahl y a las formas de nitrito y nitrato se les denomina N-Nítrico. Tabla 2. Fraccionamiento del nitrógeno en las aguas residuales. El nitrógeno orgánico, que se encuentra mayoritariamente en forma de urea y proteínas, es degradado a nitrógeno amoniacal por la actividad de las bacterias amonificantes. En disolución acuosa el nitrógeno amoniacal puede estar en forma de amoniaco (NH3) o en su forma ionizada (NH! ! ), siendo esta última la forma predominante en las aguas residuales debido al pH característico de las mismas. El nitrógeno nítrico aparece mayoritariamente como nitrato debido a que el nitrito es fácilmente oxidable a nitrato y este es empleado como aceptor cuando el oxígeno es escaso, como suele ser habitual en los sistemas de alcantarillado debido a la fuerte demanda de oxígeno que ejerce la materia orgánica.
  22. 22. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   6 En las EDAR el nitrógeno es eliminado por diferentes vías. En primer lugar el amonio es empleado como nutriente para la síntesis de material celular. Se estima entre 10% y 30% el consumo de nitrógeno para el crecimiento de la biomasa en los sistemas de fangos activos. Si existe decantación primaria esta alcanzará a eliminar entre un 5%-10% del nitrógeno en forma de nitrógeno particulado. Pero estos porcentajes de eliminación siguen siendo insuficientes para el cumplimento de los requisitos de vertido. Por ello se aplican otros procesos para aumentar el grado de eliminación. Dentro de estos procesos, que pueden ser tanto físico-químicos, como biológicos, destaca el proceso biológico de nitrificación-desnitrificación vía nitrato, mediante el cual el amonio es oxidado a nitrato (nitrificación) y posteriormente el nitrato es reducido a nitrógeno gas y otros compuestos nitrogenados (desnitrificación). En la Figura 2 podemos ver las transformaciones que tienen lugar en el proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrato en las EDAR. Figura 2. Transformaciones del nitrógeno en el proceso de nitrificación-desnitrificación vía nitrato. (Metcalf &Eddy, 2000)
  23. 23.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     7 1.2. BIOQUÍMICA DEL PROCESO DE NITRIFICACIÓN La nitrificación consiste en la oxidación secuencial del amonio a nitrato catalizada por organismos procariotas quimiolitoautótrofos (Prosser, 1989). Estos organismos emplean carbono inorgánico como fuente de carbono para la síntesis celular y nitrógeno inorgánico para la obtención de energía. En el primer paso del proceso las BOA transforman el amonio a nitrito. Para ello son necesarias dos enzimas encargadas de catalizar el proceso; la amonio monooxigenasa (Amo) (Hollocher et al.,1981) que es la responsable de la oxidación del amonio a hidroxilamina y la oxidorreductasa hidroxilamina (HAO) (Olson and Hooper, 1983) que controla la oxidación de la hidroxilamina a nitrito. A continuación se muestran las reacciones que tienen lugar en este proceso. 𝑁𝐻! + 𝑂! + 2𝐻! + 2𝑒! !"# 𝑁𝐻! 𝑂𝐻 + 𝐻! 𝑂 Ecuación 1. Oxidación del amoniaco a hidroxilamina. 𝑁𝐻! 𝑂𝐻 + 𝐻! 𝑂 !"# 𝑁𝑂! ! + 5𝐻! + 4𝑒!     Ecuación 2. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito. 1 2 𝑂! + 2𝐻! + 2𝑒! → 𝐻! 𝑂 Ecuación 3. Formación de agua. La reacción global de la oxidación de amonio a nitrito puede expresarse como: 𝑁𝐻! ! +  3 2 𝑂!  → 𝑁𝑂! ! + 2𝐻! + 𝐻! 𝑂     Ecuación 4. Oxidación de amonio a nitrito. El nitrito es posteriormente oxidado a nitrato por las bacterias oxidantes del nitrito (BON) (Bock et al., 1992). Esta reacción es catalizada por la enzima nitrito oxidoreductasa (Nxr) (Bock and Wagner, 2001) para el género Nitrobacter, mientras que para el resto de BON es catalizada por la enzima denominada sistema nitrito-oxidante. 𝑁𝑂! ! + 𝐻! 𝑂 !"# 𝑁𝑂! ! + 2𝐻! + 2𝑒!     Ecuación 5. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito. 1 2 𝑂! + 2𝐻! + 2𝑒! → 𝐻! 𝑂 Ecuación 6. Formación de agua. La reacción total del proceso de oxidación del nitrito a nitrato puede expresarse como:
  24. 24. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   8 𝑁𝑂! ! + 1 2 𝑂! → 𝑁𝑂! ! Ecuación 7. Oxidación de la hidroxilamina a nitrito. La reacción global del proceso de nitrificación viene dada por la expresión: 𝑁𝐻! ! +  2𝑂!  → 𝑁𝑂! ! + 2𝐻! + 𝐻! 𝑂     Ecuación 8. Reacción global de nitrificación. En el balance total de la reacción se produce energía que es utilizada por los microorganismos para sus funciones de crecimiento y mantenimiento celular. Como se comentaba anteriormente, una parte del nitrógeno amoniacal es empleada por los microorganismos como nutriente para la síntesis de material celular, si consideramos la fórmula química de la biomasa como C5H7NO2 esta reacción puede expresarse como: 4𝐶𝑂! + 𝐻𝐶𝑂! ! + 𝑁𝐻! ! +   𝐻! 𝑂   → 𝐶! 𝐻! 𝑁𝑂! + 5𝑂!     Ecuación 9. Reacción de síntesis celular. Con lo que la ecuación global del proceso de nitrificación quedaría de la siguiente manera: 4𝐶𝑂! + 𝐻𝐶𝑂! ! + 22  𝑁𝐻! ! +  37𝑂!  → 𝐶! 𝐻! 𝑁𝑂! + 21𝑁𝑂! ! + 20𝐻! 𝑂 + 42𝐻! ! Ecuación 10. Reacción global Tal y como podemos observar en la reacción global del proceso la oxidación del amonio requiere el consumo de CO2 del medio y produce H+ , lo que conlleva un consumo de alcalinidad del medio. 1.3. PRINCIPALES ORGANISMOS QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE NITRIFICACIÓN Los organismos responsables del proceso de nitrificación han sido objeto de estudio desde su descubrimiento por Winogradsky en 1890 debido a la relevancia de este proceso en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno. Las bacterias nitrificantes, como se ha comentado anteriormente, son organismos quimiolitoautótrofos a expensas de compuestos reducidos de nitrógeno inorgánico y respiradores aerobios por definición. Generalmente se caracterizan por ser bacterias de crecimiento lento y poseer sistemas membranosos internos complejos. Estas bacterias están ampliamente distribuidas en suelos y agua y suelen ser muy abundantes en hábitats con elevados niveles de amonio y pH alcalino. En su mayoría pertenecen al grupo de las proteobacterias.
  25. 25.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     9 Actualmente los organismos nitrificantes conocidos se encuentran dentro de pocos linajes filogenéticos y únicamente escasas poblaciones son las que dominan habitualmente en las plantas de tratamiento de aguas residuales. Hasta la fecha no se conoce ningún organismo capaz de realizar la oxidación completa del amonio a nitrato, aunque se ha especulado que estos organismos podrían existir (Costa et al., 2006). 1.3.1. BACTERIAS OXIDANTES DEL AMONIO. Las BOA son las responsables de la primera etapa del proceso de nitrificación, la oxidación del amonio a nitrito. Todos los géneros de BOA conocidos pertenecen al phylum proteobacteria, dentro del cual se distinguen dos clases, las Betaproteobacterias, cuya presencia es mayoritaria en los procesos de tratamiento de aguas residuales, y las Gammaproteobacterias, las cuales son halófilas y tienen escasa presencia en los procesos convencionales. Las proteobacterias están ampliamente distribuidas en ambientes naturales y ambientes creados por el hombre. Inicialmente fueron subdivididas en 4 géneros Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosovibro y Nitrosolobus, pero estudios posteriores basados en análisis filogenéticos del gen 16S rRNA no dieron resultados significativos que justifiquen esta diferenciación a nivel de género, por lo que se propuso incluir estos tres últimos géneros mencionados en uno mismo (Head et al., 1993). En la mayoría de EDAR la oxidación de amonio esta asociada a Betaprotobacteria del género Nitrosomonas (Purkhold et al., 2000; Zhang et al., 2011b), aunque no se descarta que otros géneros diferentes de las Betaproteobacterias puedan contribuir al proceso de nitrificación, debido a la baja abundancia que suelen presentar (Sánchez et al., 2013). Tal y como se observa en la Figura 3, Nitrosomonas pueden ser subdivididas en varios sublinajes filogenéticos, entre los cuales las especies más representativas en la depuración de aguas son N. europaea, N. eutropha, Nitrosococcus mobilis y N. oligotropha. La distribución de las diferentes especies de Nitrosomonas parece depender del sistema de tratamiento y de los parámetros operacionales. Mientras que en algunos reactores domina una sola especie (Juretschko et al., 1998) otros sistemas pueden contener hasta 5 especies diferentes (Daims et al., 2001b; Gieseke et al., 2003). La mayoría de los miembros del linaje N. europaea/N. mobilis son halotolerantes o moderadamente halófilas y tienen preferencia por las elevadas concentraciones de sustrato. Estudios en plantas piloto y a escala real sitúan a N.mobilis en reactores con elevadas concentraciones de amonio y sal (Juretschko et al., 1998), al igual que N. europaea, que aparece con altas concentraciones de amonio (Tan et al., 2008) y suelen ser dominantes en reactores que tratan aguas residuales salinas (Park et al., 2009).
  26. 26. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   10 Figura 3. Árbol filogenético de las bacterias amino oxidantes BOA basado en la secuencia del gen 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Por otro lado estudios realizados en plantas piloto de cultivos puros sugieren que N. oligotropha presenta una mayor adaptación a bajas concentraciones de amonio que N. europaea. (Limpiyakorn et al., 2007; Wang et al., 2010). Recientemente, estudios en reactores MBR alimentados con concentraciones controladas de amonio han sugerido la existencia de dos poblaciones de N.oligotropha diferentes, las cuales presentan adaptaciones diferentes a la concentración de sustrato y podrían ser importantes para la nitrificación en las EDAR (Almstrand et al., 2013). Por tanto, la concentración de amonio es un factor que repercute directamente en la composición de la comunidad de BOA, en el género Nitrosomonas la afinidad por el amonio varía entre los miembros de los diferentes linajes (Pommerening-Röser et al., 1996) pero tiende a ser relativamente similares dentro de un linaje específico. En cultivos puros de Nitrosomonas se ha observado que crecen como células libres, regulares en forma de suspensión (Bock and Wagner 2006), mientras que en los flóculos de fangos activos y biopelículas las Nitrosomonas suelen formar agregados de células compactas casi esféricas. El tamaño de estos agregados oscila entre 10 y 50 micras. En ocasiones agregados de menor tamaño han sido observados, cuyas células presentan una organización más irregular y mayor espacio intersticial entre ellas. Normalmente no se suelen observar células individuales, aunque pueden pasar desapercibidas cuando se observan flóculos o estructuras densas. Los organismos AOB de la clase Gammaproteobacteria son halófilos que se encuentran principalmente en ecosistemas marinos y salobres (Koop et al., 1990). No se ha observado ni atribuido un papel significativo a estos organismos en el proceso de nitrificación que tiene lugar en el tratamiento de aguas residuales. Figura 1.15. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). 1.2.3.2 Características de los organismos nitritoxidantes (NOB) Los organismos nitritoxidantes (NOB) son los responsables de la conversión del nitrito a nitrato, segundo paso de la reacción de nitrificación. Esta reacción es catalizada por la enzima nitrito oxidoreductasa (Nxr). Desde el punto de vista filogenético los organismos NOB son un grupo más heterogéneo que las bacterias AOB. En la Figura 1.16 se encuentra el árbol filogenético de los organismos NOB. Estos microorganismos son procariotas quimioautótrofos, divididos en cuatro géneros Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus y Nitrospina.
  27. 27.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     11 El género Nitrosospira, también perteneciente a clase Betaproteobacteria, es característico de la oxidación del amonio en suelos, a pesar de que también han sido detectadas en EDAR ocasionalmente. Esto puede ser debido a que Nitrosospira está mejor adaptada a bajas concentraciones de sustrato (Schramm et al., 1999), por tanto no pueden competir con Nitrosomonas en las EDAR, donde las concentraciones de amonio suelen ser más elevadas que en los suelos. Representantes de la clase Gammaproteobacterias son Nitrosococcus halophilus y Nitrosococcus oceani que, tal y como se comentaba anteriormente, debido a sus altos requerimientos de sal son habituales en hábitats marinos junto con Nitrosomonas marina perteneciente a la clase Betaproteobacteria, a pesar de que representantes de esta especie sí han sido encontrados en ambientes salobres como en un filtro percolador de un sistema de acuicultura marina (Foesel et al., 2007). Arqueas oxidantes del amonio Tal y como se comentaba anteriormente, se ha sugerido que las BOA no son las únicas responsables de la oxidación del amonio en las EDAR. Han sido numerosos los estudios acerca de la presencia de organismos del dominio Archaea los cuales son capaces de realizar la oxidación autotrófica del amonio en suelos y océanos (Schleper et al., 2005), confirmándose finalmente que estos organismos juegan un papel importante en la nitrificación en ecosistemas marinos y terrestres (Beman et al., 2008; Leininger et al., 2006; Wucher et al., 2006). Tras este descubrimiento el punto de mira se sitúa ahora sobre el papel de las arqueas oxidantes del amonio (AOA) en los sistemas de tratamiento de aguas residuales. AOA del phylum Crenarcheota y Thaumachaeota (Spang et al., 2010) han sido detectadas en EDAR (Parck et al., 2006; Wells et al.,2009) y en EDAR de aguas residuales industriales (Mussmann et al., 2011). A pesar de estos hallazgos todavía no está claro si estos organismos crecen exclusivamente a expensas de la oxidación autotrófica del amonio y su papel en la nitrificación en los sistemas biológicos de tratamiento de aguas residuales no ha sido esclarecido todavía ( Limpiyakorn et al., 2011; Zhang et al., 2009). 1.3.2. BACTERIAS OXIDANTES DEL NITRITO. El grupo de BON es un grupo más diverso filogenéticamente que el de las BOA, tal y como se refleja en la Figura 4. La mayoría de los linajes de BON son altamente versátiles y se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza (ecosistemas marinos, terrestres y artificiales como las EDAR). A menudo en las EDAR, tanto en flóculos como en biopelículas, encontramos las BOA y BON
  28. 28. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   12 en una misma área, lo que refleja la simbiosis de ambos grupos funcionales (Maixner et al., 2006). Las especies descritas, a excepción de Nitrospira, Nitrospina y Nitrolancetus, se encuentran dentro del phylum Proteobacteria. Figura 4. Árbol filogenético de las bacterias nitro oxidantes BON basado en la secuencia del gen 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Nitrobacter, dentro de las Alphaproteobacterias, ha sido detectada tanto en hábitats acuáticos como terrestres, algunas de las subespecies descritas han sido N. winogradskyi, N. hamburgensis, N. vulgaris y N. alkalicus. Se había considerado este grupo como predominante en los sistemas de tratamiento de aguas residuales (Henze et al., 1997), hasta que estudios posteriores en plantas a escala real basados en técnicas moleculares como FISH y otras técnicas basadas en métodos no dependientes de cultivo confirmaron que Nitrospira era la especie clave en este proceso (Juretscho et al., 1998), una a excepción pueden ser reactores que tratan elevadas concentraciones de nitrito, en los que Nitrobacter puede alcanzar una abundancia relativamente alta (Daims et al., 2001a). Esto es debido a que Nitrobacter presenta mejor adaptación a altas concentraciones de NO2 mientras que Nitrospira se adapta mejor a las bajas concentraciones. (Schramm et al., 1999). Dentro de phylum Proteobacteria aunque asociadas a ambientes marinos, encontramos los géneros Nitrococcus (N. mobilis) en la clase Gammaproteobacteria y Nitrotoga (N. artica) en la clase Betaproteobacteria (Alawi et al., 2007). El género Nitropina fue asignado provisionalmente dentro de la clase Deltaproteobacteria (Teske et al., 1994), aunque esta afiliación fue cuestionada debido a su dificultad de clasificarla únicamente con análisis filogenéticos basados en el gen 16s rRNA 44 Introducción Figura 1.16. Árbol filogenético hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). El género Nitrobacter perteneciente a la clase Alphaproteobacteria contiene las especies N. winogradskyi, N. hamburgensis, N. vulgaris y N. alkalicus (Seviour y Nielsen, 2010). Estas especies se han encontrado en diferentes ecosistemas acuáticos y terrestres, incluyendo sedimentos de lagos de alta alcalinidad (Sorokin et al., 1998). Las especies Nitrosococcus mobilis (Gammaproteobacteria) y Nitrospina gracilis (Deltaproteobacteria) se encuentran relacionadas con ecosistemas marinos. Por otro lado, el género Nitrospira constituye el grupo más diverso de organismos NOB conocido. Este grupo sólo contiene dos especies descritas N. marina (Watson et al., 1986) y N. moscoviensis (Ehrich et al., 1995). Sin embargo, se ha encontrado gran diversidad de secuencias de 16 rRNA de organismos pertenecientes al género Nitrospira aún no caracterizada en diversas muestras de suelo, sedimento, agua dulce y agua de mar (Daims et al., 2001a). Dentro de la familia Nitrospirae, el género Nitrospira ha sido dividido en cuatro subgrupos filogenéticos I-IV (Daims et al., 2001a). Las especies del género Nitrobacter pueden ser enriquecidas y desarrolladas mediante incubación en sistemas de fangos activados y de soporte sólido. De hecho, estas especies fueron consideradas como los organismos NOB dominantes en los sistemas de tratamiento de agua residual. No obstante, la aplicación de técnicas más especificas para la detección microbiológica,
  29. 29.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     13 (Schloss and Handelsman, 2004). Estudios posteriores proponen la inclusión de este género dentro de un nuevo phylum provisionalmente denominado Nitrospinae (Lucker et al., 2013). Esta bacteria parece ser la especie dominante en la oxidación del nitrito en los ecosistemas marinos (Lucker et al., 2013). También aparece asociada a ambientes radioactivos (Weidler et al., 2007). Tal y como se comentaba anteriormente el género Nitrospira, no está relacionado con el resto de proteobacterias, sino que se engloba dentro del phylum Nitrospirae (Daims et al., 2001a) y es clave en la oxidación del nitrito a nitrato en las EDAR. El género Nitrospira es diverso y cuenta por lo menos con cuatro sublinajes filogenéticos diferentes (Daims et al., 2001a). Han sido descritas como bacterias de difícil cultivo y únicamente pocas especies han podido ser cultivadas aisladamente. La primera especie descrita fue N. marina aislada del agua del mar (Watson et al., 1986), seguida por N. moscoviensis, la cual fue aislada a partir de un tubo de hierro de un sistema de calefacción en Moscú (Ehrich et al., 1995) y se asocia a aguas dulces. En las EDAR Nitrospira forma agregados celulares con forma esférica o irregular, que contienen cientos o miles de células. El diámetro de estos agregados va desde 10 a 100 micras, aunque en ocasiones pueden ser encontrados agregados de mayor tamaño, los cuales habitualmente contienen estrechos "canales" y grandes cavidades (Daims, 2009) Recientes investigaciones han descrito un nuevo género, Nitrolancetus (N. holandicus), que en contraste con el resto de BON conocidas pertenece al phylum Chloroflexi (Sorokin et al., 2012). 1.4. TÉCNICAS MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COMUNIDADES MICROBIANAS Los fangos activos contienen una compleja población microbiana, que en la mayoría de ocasiones no es posible caracterizar mediante métodos dependientes de cultivo (Wagner et al., 1993). Es por ello que a día de hoy se emplean gran variedad de técnicas no basadas en cultivo para el estudio de las comunidades bacterianas presentes en estos sistemas como FISH, FISH- MAR, PCR, etc. Entre estas destaca la técnica molecular FISH la cual permite la detección e identificación de microorganismos en comunidades complejas con alto grado de especificidad y aporta información, que otros medios no pueden ofrecer, acerca de la morfología, cantidad y distribución espacial en el medio. La técnica FISH está basada en la hibridación DNA/RNA de una región del gen 16S o 23S. Para ello emplea secuencias de oligonucleótidos que se unirán específicamente formando un hibrido con el rRNA de los organismos diana bajo condiciones específicas. Las secuencias de DNA están marcadas con sustancias fluorescentes llamadas fluoróforos, que permiten la detección de las células diana mediante el uso de un microscopio de epifluorescencia.
  30. 30. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   14 Las sondas FISH ideales deben ofrecer una alta sensibilidad y especificidad. La sensibilidad se refiere al nivel de fluorescencia suficiente para distinguir la célula hibridada de la fluorescencia de fondo, mientras que por especificidad se entiende la capacidad de distinguir las células diana de las que no lo son y que podrían dar una señal de hibridación falsa. Las condiciones de hibridación son factores clave para que se mantengan los dos requisitos anteriormente mencionados. Un parámetro fundamental es la concentración de formamida, la cual permite disminuir la temperatura de desnaturalización del DNA manteniendo la morfología celular y haciendo la hibridación específica, aunque compromete la señal de la sonda de hibridación. La sondas pueden ser diseñadas en función de la especificidad deseada, ajustándose a los diferentes niveles taxonómicos. A continuación se presenta una relación de las sondas más comunes empleadas para la identificación de bacterias nitrificantes presentes en los sistemas de tratamiento de aguas residuales, marcadas en rojo aparecen las sondas utilizadas en el presente estudio. Figura 5. Árbol filogenético del gen 16S rRNA basado en los linajes principales de bacterias amonio- oxidantes conocidas (Daims et al., 2009). Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia 21 protocolos. La formamida disminuye la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno. Este compuesto disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA-RNA en 0,72 ºC por cada 1% de formamida utilizada y permite realizar la hibridación entre los 30-50 ºC (Alonso et al, 2009). La clasificación taxonómica de los organismos amonio-oxidantes y sus respectivas sondas utilizadas en la técnica FISH se encuentra en la Figura 6 a continuación. Figura 6. Árbol filogenético de 16S rARN basado en los linajes principales de bacterias amonio- oxidantes conocidas (Daims t al, 2009). Nmo218 Nse1472
  31. 31.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     15 A continuación podemos ver los árboles filogenéticos más específicos donde se incluyen diferentes sondas empleadas en el presente estudio con sus respectivas subespecies. La sonda Nmo218 identifica las subclases que se observan en la Figura 6 que se presenta a continuación. Figura 6. Árbol filogenético del género Nitrosomonas inferido del análisis comparativo del gen 16S rRNA (Gieseke et al., 2000). En la Figura 7 se presentan las subespecies identificadas por la sonda Nse1472. 22 incluyen algunas sondas con sus respectivas subespecies identificadas que fueron utilizadas en este estudio. La sonda Nmo218 utilizada en este estudio identifica las subclases que se observan en la Figura 7. Figura 7. Árbol filogenético del genero Nitrosomonas inferido del análisis comparativo del gen 16S rDNA (Gieseke et al, 2000). Otra sonda utilizada en este estudio es la Nse1472, a continuación se presentan las subespecies identificadas por esta sonda.
  32. 32. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   16 Figura 7. Árbol filogenético que muestra las relaciones de las BOA aisladas N. mobilis (sonda Nm93) y N. europea (sonda Nm103) y otras bacterias cercanas pertenecientes a la subclase Proteobacteria. (Juretschko et al., 1998). En la Figura 8 se muestra la clasificación taxonómica de los organismos nitrito-oxidantes y sus respectivas sondas identificativas. Figura 8. Árbol filogenético del gen 16S rRNA basado en los linajes principales de bacterias nitrito-oxidantes BON conocidas (Daims et al., 2009). Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia Figura 8. Árbol filogenético que muestra las relaciones de las AOB aisladas N. mobilis Nm93 y N. europea Nm103 y otras bacterias cercanas pertenecientes a la subclase Proteobacteria. (Juretschko et al, 1998). La clasificación taxonómica de los organismos nitrito-oxidantes y sus respectivas sondas identificativas correspondientes a la técnica FISH se encuentran en la Figura 9. Figura 9. Árbol filogenético de 16S ARNr basado en los linajes principales de bacterias nitrito-oxidantes Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia 23 Figura 8. Árbol filogenético que muestra las relaciones de las AOB aisladas N. mobilis Nm93 y N. europea Nm103 y otras bacterias cercanas pertenecientes a la subclase Proteobacteria. (Juretschko et al, 1998). La clasificación taxonómica de los organismos nitrito-oxidantes y sus respectivas sondas identificativas correspondientes a la técnica FISH se encuentran en la Figura 9. Figura 9. Árbol filogenético de 16S ARNr basado en los linajes principales de bacterias nitrito-oxidantes conocidas (Daims et al, 2009).
  33. 33.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     17 La técnica molecular FISH junto con las novedosas técnicas de cuantificación por tratamiento de imagen, se presentan como una de las mejores alternativas para el control y seguimiento de las poblaciones de bacterias nitrificantes debido a su rapidez y especificidad. 1.5. TÉCNICAS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA MUESTRAS AMBIENTALES 1.5.1. ANÁLISIS BIVARIANTE Las técnicas de análisis bivariante expresan el grado de relación entre dos variables. Pueden considerarse, en algunos supuestos, como casos especiales o simplificados de algunas técnicas de análisis multivariante. Por ello es recomendable realizar una exploración previa mediante este tipo de análisis antes de abordar la aplicación de cualquier técnica multivariante. Las técnicas de correlación son usadas con frecuencia para resumir la fuerza de la asociación entre dos variables métricas. Coeficiente de correlación lineal de Pearson. El coeficiente de correlación de Pearson es un coeficiente estadístico que se suele emplear para medir la intensidad de la relación entre dos variables linealmente relacionadas X e Y, y es calculable siempre que ambas variables se distribuyan normalmente. Se calcula con la fórmula expresada en la Ecuación 11. r x y y x y y i n i i n i i n = = − = − = ∑ ∑ ∑( x)( ) / ( x)² ( )²i i- - 1 1 1 𝑋: 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎  𝑑𝑒  𝑋 𝑌: 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎  𝑑𝑒  𝑌 Ecuación 11. Calculo del coeficiente de correlación lineal de Pearson El coeficiente de correlación de Pearson está comprendido entre -1 y +1, donde los valores positivos indican una dependencia lineal creciente y los valores negativos indican una dependencia lineal decreciente. El valor absoluto del coeficiente de correlación indica el grado de la relación lineal entre las variables. Valores absolutos grandes indican las relaciones más fuertes. Cuando los valores del coeficiente sean pequeños, significativos de una pequeña dependencia lineal, se debe cambiar el modelo lineal por otro tipo de curva a fin de tener una mejor aproximación.
  34. 34. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   18 Coeficiente de Correlación de Spearman El coeficiente de Correlación de Spearman es una versión no paramétrica del coeficiente de correlación de Pearson. Este parámetro estadístico es adecuado para datos ordinales, o de intervalo, que no satisfagan el supuesto de normalidad. La correlación de Spearman se basa en los rangos de los datos en lugar de los valores reales, y compara dichos rangos para cada grupo de variables (Conover, 1998). El uso de este coeficiente estadístico es aconsejable cuando tenemos un número relativamente alto de categorías. El coeficiente de correlación de Spearman requiere que las variables sean aleatorias continuas, o por lo menos una de ellas, de forma que los objetos o individuos puedan colocarse en series ordenadas (Siegel, 1983). El coeficiente de Spearman se calcula con la fórmula expresada en la Ecuación 12. di : la diferencia entre los rangos de X e Y, es decir di=rXi-rYi. N: número de valores de la muestra. Ecuación 12. Calculo del coeficiente de correlación de Spearman. Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la variable estudiada. Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Índices cercanos a +1 indican una fuerte correlación creciente mientras que valores cercanos a -1 indican una fuerte correlación decreciente, los valores próximos a 0 indican que no hay correlación entre las variables (Siegel, 1983). La prueba de significación asociada a ambos coeficientes únicamente prueba la hipótesis nula de que el coeficiente pueda ser igual a 0, es decir, que no exista ninguna relación lineal entre ambas variables. El nivel de significación “p” representa la probabilidad de error que se comete al aceptar el resultado observado como válido. Cuanto mayor sea este nivel de significación mayor error se comete al aceptar que las correlaciones observadas entre las variables de la muestra son indicadoras de la relación entre las respectivas variables de la población. Por ejemplo si p ≤ 0.05 existe una probabilidad del 5 % de que la relación observada entre las variables en la muestra estudiada sea casualidad. El nivel de significación 0.05 se considera un nivel de error aceptable en muchas áreas de estudio. 42 indican una dependencia lineal decreciente. Los valores del coeficiente r pequeños indican una pequeña dependencia lineal. En estos casos se debe cambiar el modelo lineal por otro tipo de curva a fin de tener una mejor aproximación. 3.4.2 Coeficiente de Correlación de Spearman El coeficiente de correlación de Spearman o por rangos, también llamado rs es una medida no paramétrica de asociación que requiere que ambas variables sean aleatorias continuas, de forma que los objetos o individuos puedan colocarse en series ordenadas (Siegel, 1983). El coeficiente de Spearman utiliza los números de orden (rangos) de cada grupo de variables y compara dichos rangos (Conover, 1998). Este coeficiente es recomendable utilizarlo cuando los datos presentan valores externos que afectan al coeficiente de Pearson o ante distribuciones no normales. La fórmula para calcular el Coeficiente de Spearman es la siguiente:  = 1 − 6 · ∑    −  donde: di es la diferencia entre los rangos de X e Y, es decir di = rXi-rYi. N es el número de valores de la muestra
  35. 35.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     19 1.5.2. ANÁLISIS MULTIVARIANTE El análisis multivariante (AM) es la parte de la estadística y del análisis de datos que estudia, analiza, representa e interpreta los datos que resultan de observar más de una variable estadística sobre una muestra de individuos. Las variables observables son homogéneas y correlacionadas, sin que alguna predomine sobre las demás. Dentro del AM se encuentran las dos técnicas que se describen a continuación: Análisis de componentes principales El análisis de componentes principales (ACP) es una técnica de reducción de la información disponible sobre un grupo de muestras, de los cuales se han tomado diversas variables sobre diversas características. Por ejemplo si se tienen datos de N muestras referentes a p características diferentes de éstos, es decir, X=(X1,....,Xp), el objetivo del ACP consiste en reducir las dimensiones de la variable X creando una nueva variable U=(U1,.....,Ur), donde r<p, cuyas componentes Ui sean combinación lineal de las Xi y que también expliquen una proporción suficientemente grande de la dispersión total presente en los datos originales (Pérez, 1996). Estas aproximaciones se puede orientar al estudio inicial de la variabilidad ambiental de las unidades poblacionales, y en este sentido cabe considerarla como una técnica de ordenación indirecta (Jongman et al., 1995) que permite analizar y/o modelar posteriormente la respuesta biológica de interés ante los factores extraídos por el análisis (Rottenberry and Wiens, 1980) El proceso de cálculo del ACP es el siguiente: El primer componente se construye buscando un vector b= (b1,...,bp) que, entre todos los que tengan modulo unitario, atribuya a U1 la mayor varianza posible, de forma tal que este nuevo componente constituya la mejor explicación unidimensional de la varianza total en los datos (Pérez, 1996). Ecuación 13. Vector de componentes ACP Procediendo con las variables sucesivas se construyen las componentes principales. Este método logra sintetizar al máximo la información con el criterio de pérdida mínima de capacidad explicativa con respecto a la varianza de las series (Pérez, 1996). Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente modelación (Aguado, 2004): Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia 43 Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la variable estudiada. Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Para índices cercanos a +1 la asociación es positiva, para valores cercanos a -1 la asociación es negativa y 0 significa que no hay correlación entre las variables (Siegel, 1983). 3.4.3 Análisis de Componentes Principales (ACP) El ACP es una técnica de reducción de la información disponible sobre un grupo de muestras, de los cuales se han tomado diversas variables sobre diversas características. Por ejemplo si se tienen datos de N muestras referentes a p características diferentes de éstos, es decir, X=(X1,….,Xp), el objetivo del ACP consiste en reducir las dimensiones de la variable X creando una nueva variable U=(U1,…..,Ur), donde r<p, cuyas componentes Ui sean combinación lineal de las Xi y que también expliquen una proporción suficientemente grande de la dispersión total presente en los datos originales (Pérez, 1996). El proceso de cálculo del ACP es el siguiente: El primer componente se construye buscando un vector b= (b1,…,bp) que, entre todos los que tengan modulo unitario, atribuya a U1 la mayor varianza posible, de forma tal que este nuevo componente constituya la mejor explicación unidimensional de la varianza total en los datos (Pérez, 1996). U1=b11·X1+b12·X2+….+b1P·Xp Procediendo con las variables sucesivas se construyen las componentes principales. Este método logra sintetizar al máximo la información con el criterio de pérdida mínima de capacidad explicativa con respecto a la varianza de las series (Pérez, 1996). Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente modelación (Aguado, 2004):  =   ·   +  =  +   
  36. 36. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   20 Ecuación 14. Modelización realizada en el ACP Donde, pa son los vectores de pesos que definen las direcciones principales de máxima varianza en el espacio X. Estas direcciones determinan un subespacio de menor dimensión (A) que el espacio original. La dimensión (A) se escoge de manera que no exista información importante de X en E que es la matriz de residuos, y que, por tanto, representa el ruido. 𝑋es la estimación de X a partir de modelo con A componentes. En la Figura 9 se muestran de forma gráfica las matrices del modelo ACP. Figura 9. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP. Para una componente dada, los pesos son definidos como la dirección sobre la que se están proyectando las observaciones y están poniendo de manifiesto la contribución de las variables originales en la formación de dicha componente. Análisis Canónico El análisis de correspondencias canónicas (ACC) es una técnica de ordenación directa, a diferencia del ACP. El ACC asume un modelo unimodal en la respuesta de los organismos sobre combinaciones de un conjunto de variables, considerando simultáneamente la información biológica y la información ambiental. En el ACC, los ejes que explican la respuesta biológica están forzados a ser una suma ponderada de las variables estudiadas (ter Braak and Smilauer, 1998). En los análisis canónicos se extrae toda la varianza de la matriz respuesta que esta relacionada con la matriz explicativa. La ordenación de la matriz respuesta se precisa de forma que los vectores de ordenación resultantes son combinaciones lineales de las variables de la matriz explicativa. El proceso del ACC es el siguiente: 43 explicativa con respecto a la varianza de las series (Pérez, 1996). Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente modelación (Aguado, 2004):  =   ·   +  =  +    Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia 44 Donde, pa son los vectores de pesos que definen las direcciones principales de máxima varianza en el espacio X. Estas direcciones determinan un subespacio de menor dimensión (A) que el espacio original. La dimensión (A) se escoge de manera que no exista información importante de X en E que es la matriz de residuos, y que, por tanto, representa el ruido Xˆ es la estimación de X a partir de modelo con A componentes. En la Figura 16 se muestran de forma gráfica las matrices del modelo ACP. Figura 16. Representación esquemática de las matrices del modelo ACP. Para una componente dada, los pesos son definidos como la dirección sobre la que se están proyectando las observaciones y están poniendo de manifiesto la contribución de las variables originales en la formación de dicha componente (Aguado, 2004). 3.4.4 Tratamiento por ordenador Las correlaciones de Pearson y Spearman se obtuvieron mediante el programa Statgraphics Plus versión 5.1. En este programa se introdujo una matriz semejante a la Figura 15 con todos los parámetros a estudiar y se realizó un análisis estadístico correspondiente a las correlaciones de Pearson y Spearman. El programa genera como salida de este estudio una gran tabla con los valores de las correlaciones y los p-valores de cada una. Estos últimos indican la bondad estadística del modelo
  37. 37.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     21 Sean X= (X1, …, Xp), Y=(Y1, …, Yq) dos vectores aleatorios de dimensiones p y q. Se pretende encontrar dos variables compuestas, U = Xa = a1X1+ … + apXp, V = Yb = b1Y1 + … + bqYq, siendo a = (a1, …, ap), b = (b1, …, bq)´, tales que la correlación entre ambas sea máxima. Se indicarán por S11, S22 las matrices de covarianzas (muestrales) del primer y segundo conjunto, es decir, de las variables X, Y, respectivamente, y sea S12 la matriz p x q con las covarianzas de las variables X con las variables Y. Es decir: donde: S21 = S12 Figura 10. Matriz de covarianzas ACC Entonces podremos suponer que var (U) = a´S11a =1 , var (V) = b´S22b = 1, reduciendo el problema a maximizar a´S12b restringido a a´S11a =1, b´S22b = 1. Los vectores de coeficientes a, b que cumplen esta condición son los primeros vectores canónicos. La máxima correlación entre U, V es la primera correlación canónica r1. La posibilidad de comprobar si existe una relación estadísticamente significativa entre la composición de la comunidad y una matriz de variables ambientales permite pasar de un uso meramente descriptivo de las ordenaciones a emplearlas como herramientas para el contraste de hipótesis formuladas a priori. La hipótesis nula de un ACC es que no existe relación alguna entre la matriz de variables respuesta y la matriz de variables explicativas. La significación de esta hipótesis nula se puede evaluar mediante permutaciones. En este caso, el estadístico es la suma de todos los valores propios canónicos y su significación se evalúa mediante un test de F. La hipótesis alternativa establece que la suma de todos los valores propios canónicos es mayor que la que se obtiene de matrices en las que se han permutado sus filas de datos. La suma de todos los valores propios canónicos dividida por el total de variación de la matriz Y permite obtener la proporción de la variación de Y explicada por X, que es análoga al coeficiente de determinación de las regresiones múltiples. obtenemos R2 = cov2 (Y; bY ) var(Y )var(bY ) = var(bY ) var(Y ) : (4.2) 4.3. CorrelaciÛn canÛnica Sean X = (X1; : : : ; Xp); Y = (Y1; : : : ; Yq) dos vectores aleatorios de di- mensiones p y q: Planteemos el problema de encontrar dos variables com- puestas U = Xa = a1X1 +    + apXp; V = Yb = b1Y1 +    + bqYq; siendo a = (a1; : : : ; ap)0 ; b = (b1; : : : ; bq)0 tales que la correlaciÛn entre ambas cor(U; V ) sea m·xima. Indiquemos por S11; S22 las matrices de covarianzas (muestrales) del primer y segundo conjunto, es decir. de las variables X; Y; respectiva- mente, y sea S12 la matriz p  q con las covarianzas de las variables X con las variables Y: Es decir: X Y X S11 S12 Y S21 S22
  38. 38. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   22
  39. 39.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     23 2. OBJETIVOS El presente trabajo se ha desarrollado con el objetivo de estudiar las relaciones entre la población de bacterias nitrificantes presentes en el fango activo de la EDAR Denia-Ondara- Pedreguer y las variables físico-químicas y operacionales del proceso de la EDAR durante un año. Los objetivos específicos que se pretenden alcanzar son: - Identificar diversas subclases de BOA y BON mediante la utilización de sondas específicas con la técnica FISH. - Cuantificar en cada muestra los grupos de bacterias nitrificantes estudiadas con respecto a la población total de bacterias. - Estudiar las relaciones existentes entre la dinámica poblacional de las bacterias nitrificantes y su abundancia con los parámetros físico-químicos y operacionales de la EDAR. - Estudiar la abundancia de distintas especies de BOA y BON a lo largo del tiempo y valorar su contribución a la eliminación de amonio (N-NH4 + ).
  40. 40. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   24
  41. 41.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     25 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. DESCRIPCIÓN DE LA EDAR Las muestras empleadas para la realización de este proyecto fueron tomadas en la EDAR de Denia-Ondara-Pedreger ubicada en la Marina Alta (Provincia de Alicante), que trata las aguas residuales de los municipios de Denia, Ondara y Pedreguer. Esta EDAR trata un caudal de 17.089 m3/día correspondiente a una población de 45.152 he (Datos EPSAR, 2010). La línea de aguas cuenta con un pretratamiento compuesto por reja de gruesos, tamices, desarenador y desengrasador. El tratamiento secundario de la planta consiste en un reactor anóxico/óxico, donde el volumen total del tanque de aireación es de 12.111 m3 , seguido de decantación y un tratamiento terciario de desinfección por ultravioletas. El proceso que se desarrolla es de aireación prolongada, con eliminación biológica de nitrógeno mediante nitrificación-desnitrificación vía nitrato y eliminación fisco-química de fósforo. En la Figura 11 podemos observar el esquema de depuración. Figura 11. Esquema de depuración de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer (EPSAR) En la Tabla 3 se presentan los rendimientos de eliminación en la EDAR durante el periodo de estudio. Podemos observar los elevados rendimientos de eliminación de nitrógeno total, kjeldahl y amoniacal, lo que es significativo de un buen proceso de nitrificación.
  42. 42. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   26 Tabla 3. Rendimientos de eliminación en la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer 3.2. TOMA DE MUESTRAS Las muestras utilizadas para el desarrollo de este proyecto fueron proporcionadas por el Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) de la Universidad Politécnica de Valencia (UPV). La toma de muestras se realizó durante el periodo de diciembre de 2008 a diciembre de 2009, con una frecuencia quincenal, lo que supone un total de 23 muestras. Las campañas de muestreo tuvieron una duración de cuatro días. Los días 1 y 2 se analizaron la DQO total, DQO soluble y DBO5 en el afluente al reactor, mientras que el día 3 se llevó a cabo un análisis completo del afluente y el efluente. El objetivo del primer análisis fue estudiar la influencia de la carga orgánica y del segundo establecer el rendimiento del proceso biológico (Zornoza et al., 2010). El cuarto día se procedió al muestreo del licor mezcla, que servirá empleado para la identificación y la cuantificación de bacterias nitrificantes. Tanto las muestras del afluente como del efluente fueron muestras integradas, obtenidas a partir de la mezcla de muestras simples horarias en relación al caudal, mientras que las muestras del licor mezcla que se tomaron a la salida del reactor biológico fueron de tipo simple y de carácter puntual. En la Tabla 4 se presenta un esquema de la campaña de muestreo indicándose la duración el origen y tipo de muestra. Tabla 4. Esquema de la campaña de muestreo (Zornoza et al., 2010)
  43. 43.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     27 3.3. VARIABLES FÍSICO-QUÍMICAS Y PARÁMETROS OPERACIONALES Las variables físico-químicas se determinaron mediante procedimientos normalizados de la American Public Health Association (APHA, 2005). La fracción filtrada se obtuvo a través de un filtro de lana de vidrio (Whatman GF/C) con un tamaño de poro de 1.2 µm. La fracción soluble se obtuvo a través de un filtro de 0.45 µm (Grady, 1989). En la Tabla 5 se muestra una relación de los parámetros físico-químicos analizados que han sido usados en el presente estudio y sus respectivos días de muestreo. Tabla 5.Variables físico-químicos del afluente, efluente y licor mezcla en relación a la campaña de muestreo En la Tabla 6 se detalla la relación de las variables operacionales que han sido consideradas en el presente estudio. Tabla 6. Parámetros operacionales
  44. 44. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   28 Los valores de OD en el reactor fueron distribuidos en tres intervalos: < 0,8 OD bajo, 0,8 – 2 OD medio y > 2 ppm OD alto. 3.4. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU CON SONDAS MARCADAS CON FLUOROFOROS A continuación se describe el protocolo empleado para la realización de la técnica FISH en las muestras empleadas en el presente estudio. 3.4.1. FIJACIÓN DE LAS MUESTRAS. El objetivo de la fijación de las muestras es que las células mantengan su morfología e inactivar la actividad enzimática. La fijación de las células fue realizada tras la toma de muestras siguiendo el protocolo para Gram negativas que se describe a continuación: - Lavar 1 ml de flóculo con 500 µl de PBS, seguidamente añadir 750 µl de PFA y mantenerlo a 4ºC durante 1 a 3 horas. - Centrifugar la muestra durante 3 minutos y eliminar el fijador. - Lavar las celular con 500 µl de PBS 1X. - Resuspender en 500 µl de PBS 1X y añadir 500 µl de etanol frío (4 oC). - Guardar a -20 oC, se pueden conservar durante varios meses bajo estas condiciones.. 3.4.2. TRATAMIENTO DE LOS PORTAOBJETOS CUBIERTOS CON TEFLÓN. El objetivo del tratamiento de los portaobjetos es crear un medio adecuado en el que se mantengan las células ya fijadas tras ser aplicadas en el portaobjeto a pesar de los lavados posteriores a los que serán sometidos. Los pasos realizados se describen a continuación: − Lavar con solución de limpieza. − Enjuagar con agua destilada. − Secar al aire dejándolo escurrir durante un día. Se deben proteger del polvo ambiental cubriendo con papel de aluminio. − Cubrir con gelatina por inmersión en la solución de gelatina 0,1% con cromato sulfato potásico 0,01% preparada al momento a una temperatura de 60oC. − Secar al aire.
  45. 45.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     29 3.4.3. APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS A LOS PORTAOBJETOS Y PERMEABILIZACIÓN DE LAS CELULAS. La metodología empleada fue la siguiente: - Mediante uso de micropipetas se coloca en cada uno de los pocillos del portaobjetos un volumen de 4µl de muestra fijada. − Secar al aire. − Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión. − Deshidratar en etanol 80% durante 3 minutos por inmersión. − Deshidratar en etanol absoluto durante 3 minutos por inmersión. 3.4.4. HIBRIDACIÓN IN SITU. Preparación de la solución de hibridación El primer paso de la técnica es la preparación de la solución de hibridación, cuya composición variará en función del porcentaje de formamida tal y como se indica en la Tabla 7. Tabla 7. Solución de hibridación en función del porcentaje de formamida - Introducir los reactivos en las cantidades establecidas en un microtubo de 2 ml. - Añadir las sondas a la solución de hibridación según las consideraciones establecidas a continuación: § Por cada pocillo se necesitan 9 µl de solución de hibridación y 1 µl de sonda por tanto se prepara una solución con estas proporciones y se aplican 10 µl de esta solución a cada uno de los pocillos. § En estas hibridaciones se necesita utilizar más de una sonda. Se utiliza la sonda EUBMIX para identificar el total de bacterias presentes en la muestra y la sonda correspondiente a la bacteria nitrificante que se pretende identificar. En este caso se aplica las sondas de manera equimolecular, es decir en relación 1:1.
  46. 46. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   30 § En ocasiones para aumentar la especificidad del método es necesario emplear una sonda competidora de la bacteria nitrificante a identificar. En este caso las proporciones aplicadas de las sondas son 2:1:1, que corresponde a EUBMIX, bacteria nitrificante y competidora de la bacteria nitrificante respectivamente. - Distribuir de manera homogénea en cada uno de los pocillos la solución de hibridación junto con las sondas. - Colocar los portaobjetos con las muestras en un tubo falcon de 50 ml. En el tubo falcon previamente se habrá introducido papel de celulosa humedecido con 1.5 ml de la solución de hibridación. Los portaobjetos se deben mantener en posición horizontal - Incubar las muestras durante un mínimo de 1 hora y 30 minutos a 46ºC. Lavado de las muestras Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los portaobjetos se prepara una solución de lavado con los reactivos indicados en la Tabla 8 dependiendo del porcentaje de formamida que ha sido utilizado en la solución de hibridación. Tabla 8. Solución de lavado en función del porcentaje de formamida El procedimiento de lavado de los portaobjetos es el siguiente: - Sacar el portaobjetos de la incubadora e introducirlo en un tubo con la solución de lavado, mantenerlo en un baño de agua a 48 ºC durante 10 -15 minutos protegidos de la luz cubriéndolos con papel de aluminio. - Lavar el portaobjetos con la solución de lavado y sumergirlo en agua MiliQ. - Secar el portaobjetos a temperatura ambiente protegiéndolo de la luz. A partir de este momento la muestra esta lista para ser visualizada, o bien se guarda a -20ºC.
  47. 47.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     31 3.4.5. SONDAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO En el presente estudio fueron realizadas 161 hibridaciones correspondientes a las 7 sondas empleadas para la identificación de las comunidades de bacterias nitrificantes presentes en las 23 muestras de la depuradora de estudio. Para la identificación de las BOA se utilizaron 5 sondas: Nso 1225, Nse 1472, Nmo 218, NEU y NmV. En la Figura 12 se resume la clasificación taxonómica de los organismos a los que identifican. Figura 12. Sondas utilizadas para la identificación de BOA Para la identificación de las BON se utilizaron 2 sondas: Nspta 662 y NIT3. En la Figura 13 se resume la clasificación taxonómica de los organismos a los que identifican. Figura 13. Sondas utilizadas para la identificación de BON En la Tabla 9 se presentan las especificaciones de cada una de las sondas empleadas en el presente estudio. Nitrosomonas   Nso  1225   N.  halophila,    N.  eutropha   N.europaea,  N.  mobilis   NEU   N.  halophila   N.  eutropha,  N.europaea   Nse  1472   N.  mobilis   Nmv   N.  oligotropha   Nmo  218   Nitrobacter   NIT  3   Nitrospira   Nspta  662  
  48. 48. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   32 Tabla 9. Sondas utilizadas en el presente estudio 3.5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS La cuantificación de microorganismos en las muestras hibridadas consiste en la observación de las muestras con microscopio de epifluorescencia y la captura de imágenes que posteriormente son procesadas por el software desarrollado por Borras (2008). El microscopio utilizado fue un microscopio de epifluorescencia Olympus BX 50. Previamente a la observación con el microscopio se aplicó Vectashield, un compuesto que evita la perdida de fluorescencia. Las observaciones se realizaron a 1000 aumentos para todas las sondas excepto para la sonda Nso 1225 que se realizaron a 600 aumentos. Por cada pocillo se fotografiaron entre 20 y 25 campos. Por cada campo se capturaron entre 2 y 3 fotografías, una primera correspondiente a las bacterias nitrificantes diana (sonda específica), la segunda de toda la comunidad bacteriana (sonda EUBmix), y en ocasiones una tercera con el filtro doble banda que ayuda a diferenciar falsas señales de la sonda de hibridación. Las fotografías se tomaron con una cámara digital Olimpus DP 12 acoplada al microscopio con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA). Se realizaron aproximadamente un total de 6.600 fotografías correspondientes a las 4 sondas que dieron una señal positiva en las 22 muestras hibridadas positivamente. La observación y toma de imágenes de cada pocillo duró aproximadamente 40 minutos, lo que supuso un total de 6.240 minutos equivalentes a 104 horas empleadas en la observación y captura de imágenes de las muestras.
  49. 49.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     33 Tras la captura de imágenes estas fueron tratadas con el programa Photoshop versión CS2 9.0, para eliminar falsas señales de la sonda de hibridación con el objetivo de que la cuantificación posterior fuera lo más precisa posible. Como se comentaba anteriormente la cuantificación fue realizada haciendo uso del software desarrollado por Borrás. Este software desarrollado para Matlab descompone las imágenes digitales tomadas en RBG a escala binaria para realizar el conteo de píxeles a partir del cual se calcularán los porcentajes de la población de bacterias. El algoritmo del programa permite con un simple ajuste eliminar las partes de la imagen que no son de interés mediante los parámetros Low_in y Gamma_in. Con el primero se consigue eliminar la parte de la imagen que representa la fluorescencia de fondo (background) y establece un valor de 0 a 1, por debajo del cual es un falso positivo (Borrás, 2008). El parámetro Gamma_in representa la forma de la curva que describe la relación entre los valores de intensidad de la imagen original y la nueva imagen. Cuando Gamma_in es menor a 1 la nueva imagen tendrá una intensidad más alta, es decir que será más brillante, si por el contrario este parámetro es superior a 1 la nueva imagen será más oscura (Borrás, 2008). El programa calcula el porcentaje y la desviación estándar del área ocupada por las bacterias nitrificantes en función del total de la comunidad bacteriana presente, así como el error de la medida. Este error es calculado dividiendo la desviación estándar por la raíz cuadrada de “n”, donde n es el número de campos examinados (Borrás, 2008). En la Figura 14 se muestra el flujo de procesos que realiza dicho software para la cuantificación.
  50. 50. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   34 Figura 14. Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias. Los resultados serán expresados tanto en porcentaje (%) como en miligramos de sólidos suspendidos volátiles en el licor mezcla por litro (mgSSVLM/L). 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO En el análisis estadístico se emplearon 35 variables (23 variables físico-químicas, 8 variables operacionales y 4 variables de bacterias nitrificantes) y 23 muestras. En la Tabla 10 se indica la nomenclatura abreviada que se ha utilizado para cada una de las variables analizadas en este estudio. Liz Avendaño Universidad Politécnica de Valencia 39 Figura 14 Flujo de procesos para la cuantificación de bacterias. 3.4. Análisis Estadístico. En el análisis estadístico se emplearon 86 variables medidas (63 variables físico-químicas, 8 variables operacionales y 15 protistas) y 24 muestras, dando lugar a una matriz semejante a la que se muestra en la Figura 15.
  51. 51.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     35 Tabla 10. Variables empleadas en el estudio y etiquetas Se realizaron 23 muestreos durante el período diciembre 2008-diciembre 2009. Las fechas de cada uno de los muestreos se indican en la Tabla 11. Tabla 11. Fecha de muestreos Para el análisis estadístico primeramente se realizó un resumen donde se tabularon los valores mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada una de las variables operacionales y físico-químicas.
  52. 52. MÁSTER  EN  INGENIERÍA  AMBIENTAL   36 Posteriormente se emplearon diferentes técnicas estadísticas complementarias para tratar de relacionar los cambios en la composición y abundancia de las BOA y de las BON con los parámetros físico-químicos y operacionales. Primero se realizó un análisis bivariante, que consistió en el cálculo de los coeficientes de Pearson y de Spearman. Seguidamente se realizó un análisis multivariante mediante la aplicación de un análisis de componentes principales (ACP) y un análisis de correspondencias canónicas (ACC). 3.6.1. TRATAMIENTO DE DATOS REALIZADO PARA DETERMINAR LAS CORRELACIONES DE PEARSON Y SPEARMAN Previamente a la determinación de las correlaciones de Pearson y Spearman se comprobó la distribución de la normalidad de los datos obtenidos de las distintas variables mediante los test de Curtosis y Asimetría. Las variables cuyos datos no siguieron una distribución normal se transformaron a través de un cálculo logarítmico (variable = Ln [variable + 1]) (Esteban et al., 1991). Las correlaciones de Pearson y Spearman se obtuvieron mediante el programa IBM SPSS Statistics versión 19. En este programa se introdujo una matriz con los parámetros operacionales y las especies de bacterias nitrificantes y se realizó un análisis estadístico correspondiente a las correlaciones de Pearson y Spearman. El programa genera como salida de este estudio una tabla con los valores de las correlaciones y los p-valores de cada una. Estos últimos indican la bondad estadística del modelo ajustado. Por ejemplo p-valores iguales o inferiores a 0,05 indican una relación estadísticamente significativa al 95%. 3.6.2. TRATAMIENTO DE DATOS REALIZADO EN EL ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES Para realizar el análisis de componentes principales se utilizó el programa IBM SPSS Statistics versión 19, donde se introdujo la matriz de datos y se especificaron las variables para realizar el análisis. La primera de las salidas del programa es la tabla que presenta la medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin y la prueba de elasticidad de Bartlett. La medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin contrasta si las correlaciones parciales entre las variables son pequeñas, tomando valores entre 0 y 1, e indica que el análisis factorial es tanto más adecuado cuanto mayor sea su valor. Mientras que la prueba de esfericidad de Bartlett contrasta si la matriz de correlaciones es una matriz identidad, lo cual indicaría que el modelo factorial es inadecuado. Este estadístico se obtiene a partir de una
  53. 53.  DINÁMICA  POBLACIONAL  DE  LAS  COMUNIDADES  DE  BACTERIAS  NITRIFICANTES   EN  UNA  EDAR  CON  SISTEMA  CONVENCIONAL  DE  FANGOS  ACTIVOS     37 transformación del determinante de la matriz de correlaciones y cuanto mayor sea, y por tanto menor el nivel de significación, más improbable es que la matriz sea una matriz identidad y más adecuado resulta el análisis factorial. Otra de las salidas del programa es la matriz anti-imagen, la diagonal de esta matriz presenta la medida de la adecuación muestral para cada una de las variables introducidas en el análisis. En el presente estudio se han descartado todas aquellas variables cuya medida de la adecuación muestral está por debajo de 0,5, de manera que la medida de adecuación muestral de Kaiser-Meyer-Olkin y la prueba de elasticidad de Bartlett dieran valores correspondientes que establecieran la adecuación del análisis. El descarte de las variables que no se ajustaban a estos criterios dio como resultado 4 ACP con las variables indicadas en la tabla Tabla 12 . Otra de las tablas que ayudan a establecer la adecuación del análisis es la de varianza total explicada, donde el porcentaje acumulado de la suma de las saturaciones al cuadrado de la rotación indica el porcentaje de la variabilidad de los datos que es explicada por los factores extraídos. En este estudio se han considerado adecuados los ACP con un porcentaje acumulado de varianza del 50%. A pesar de tener en cuenta estas deferencias hay que considerar que para que el ACP resulte significativo el número de observaciones debe ser superior a 50. En este caso para que las cargas factoriales fueran significativas deberían estar por encima de 0,75. Por tanto se tendrá presente durante la evaluación de los resultados que el análisis no es riguroso, sino exploratorio y será confirmado por otros métodos avanzados de ordenación ambiental. Tabla 12. Variables utilizadas para realizar el análisis de componentes principales La salida empleada para la interpretación de los datos serán el diagrama de dispersión biespacial y la matriz de componentes rotados, la cual indica la carga factorial que cada una de las variables estudiadas aporta a cada uno de los componentes principales.

×