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生物10 25号

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生物10 25号

  1. 1. 谷氨酸菌的诱变 选育 生物 101 陈彬璇 25 号
  2. 2. 谷氨酸产生菌的主要特征1. α - 酮戊二酸氧化能力微弱 : α - 酮戊二酸脱氢酶 丧失或活性低 .2. 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以 及谷氨酸脱氢酶活性强 .3. 还原性辅酶Ⅱ ( NA D PH + H + ) 进入呼吸链能力缺 陷或微弱 .4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱 .5. 不利用谷氨酸 .6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. C O 2 固定能力强 .8 . 解除谷氨酸反馈抑制 .
  3. 3. • 谷氨酸产生菌中谷氨酸的生物合成途径如图所 示:其中的代谢途径包括糖酵解途径 (EMP) 、磷 酸己糖途径 (HMP) 、三羧酸循环 (TCA 循环 ) 、 乙醛酸循环、伍德 - 沃克曼反应 (CO2 固定反应 ) 等。葡萄糖经过 EMP( 主要 ) 和 HMP 途径生成丙 酮酸,其中一部分氧化脱羧生成乙酰 CoA 进入 TCA 循环,另一部分固定 CO2 生成草酰乙酸或 苹果酸,草酰乙酸与乙酰 CoA 在柠檬酸合成酶催 化下,所合成柠檬酸,再经过氧化还原共扼的氨 基化反应生成谷氨酸。• 关键酶: α- 酮戊二酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶
  4. 4. 出发菌株 菌悬液制备 原生质体制备 硫酸二乙酯诱变 紫外线诱变 单氟乙酸平板筛选 原生质体再生 高糖平板筛选香豆素和氯化锂平板筛选 高谷氨酸平板筛选 谷氨酸为唯一碳源平板筛选 摇瓶筛选 摇瓶筛选
  5. 5. 硫酸二乙酯诱变• 硫酸二乙酯成为 非常重要的植物 诱变剂用来培育 新的品种 , 快速而 且高效。• 制诱变悬浮液
  6. 6. 单氟乙酸 平板筛选 它是乌头酸酶的抑制剂抗单氟乙酸的菌株可增强酶活力 如三羧酸循环图示 浓度 0.5% 32ºC 避光 36~48h
  7. 7. 高糖和高谷氨酸平板筛选 1 、上一步骤中抗单菌株涂 在 25% 葡萄糖的平板上, 挑选生长良好的菌株 2 、再将此菌株涂布在 20% 谷氨酸平板上,挑选 生长良好的菌株。
  8. 8. 摇瓶筛选上述菌株接入摇瓶发酵培养基中进 行发酵,比较 各菌株的谷氨酸产 量,选出谷氨酸高产菌株。具体培养基成分,待老师给出吧。
  9. 9. 原生质体制备• 概念: G+ 菌经过溶菌酶或者青霉素(也可 用果胶酶以及纤维素酶)处理后,可完全 除去细胞壁,形成 仅由细胞膜包着细胞质 的菌体。• 具体操作看课本 P79
  10. 10. 物理方法诱变• 以上原生质体悬液放入培养皿进行紫外线 照射,绘制照射时间与致死率的曲线• 射线照射的目的是造成供体细胞染色体的 断裂,使其一部分或全部在发育过程中被 丢失,以达到只转移部分性状进入受体从 而得到非对称杂种或胞质杂种的目的。 那菌株会往哪个方向突变呢
  11. 11. 原生质体的 再生• 用高渗稳定液对原生质体悬液进行 稀释,再涂平板,计算原生质体再 生率
  12. 12. 香豆素和氯化锂平板筛选• 香豆素维 P 类,可以降低细胞的通透性 ,所以我们选育维 P 类衍生物,可以改 变细胞膜的渗透性,有利于谷氨酸从胞 内渗出,可以解除对谷氨酸脱氢酶的反 馈调节。• 当谷氨酸合成达到一定量时,谷氨酸 就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶,使 谷氨酸的合成停止,使代谢转向天冬氨 酸的合成。
  13. 13. 选育不利用谷氨酸 的菌株• 将上述抗维 P 类衍生 物的菌株接种在以谷 氨酸为唯一碳源的平 板上,培养后挑选生 长微弱或不生长的菌 株。
  14. 14. 摇瓶筛选经谷氨酸为唯一碳源平板筛选后,在进行 摇瓶筛选。上述菌株接入摇瓶培养基中进行发酵,比 较 各菌株的谷氨酸产量,选出谷氨酸 高产菌株。
  15. 15. • 工业上利用谷氨酸棒 状杆菌 大量累积谷氨 酸应采用的最好的 方 法是改变菌体细胞膜 的通透性。
  16. 16. sum up
  17. 17. 1. 切断或减弱支路代谢• ⑴ 选育减弱 α- 酮戊二酸进一步氧化能力的突变株 从谷氨酸生物合成的代谢途径可以看出,减弱 α- 酮戊二 酸脱氢酶复合体的活性,可以使代谢流向谷氨酸,从而 使谷氨酸得到积累。• ⑵ 选育减弱 HMP 途径后段酶活性的突变株 从葡 萄糖到丙酮酸的反应是由 EMP 途径和 HMP 途径组成的。 但是,通过 HMP 途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、 芳香族氨基酸、辅酶 Q 、维生素 K 、叶酸等物质。这些 物质的生成消耗了葡萄糖,使谷氨酸的产率降低。这可 通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长 的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素• ⑶ 选育不分解利用谷氨酸的突变株• ⑷ 选育减弱乙醛酸循环的突变株• ⑸ 阻止谷氨酸进一步代谢 由于细胞还可以谷氨酸 为前体继续向下合成谷氨酰胺等,应切断该过程
  18. 18. 2. 解除菌体自身的反馈调节• ⑴ 选育耐高渗透压突变株 要使 菌种能高产谷氨酸 , 首先要使菌种具备在 高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生 长、代谢的能力,即在高渗培养基中菌 体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影 响很小。• ⑵ 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶 反馈调节的突变株
  19. 19. 3. 增加前体物的合成• ⑴ 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸 到 α- 酮戊二酸代谢的突变株 这可通过 选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙 酸、氟化钠、重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突 变株来实现。 ⑵选育强化 CO2 固定反应的突变株
  20. 20. 4. 提高细胞膜的渗透性• ⑴ 选育抗 Vp 类衍生物突变株• ⑵ 选育溶菌酶敏感突变株。• ⑶ 选育二氨基庚二酸缺陷突变株。• ⑷ 选育温度敏感突变株
  21. 21. 5. 强化能量代谢• 谷氨酸高产菌的两个显著特点是 :α- 酮戊二酸继续向 下氧化的能力微弱和乙醛酸循环微弱,使能量代谢受阻, TCA 循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢可弥补上述 两点不足,使 TCA 循环前一段代谢加强,谷氨酸合成的速 度加快。• ⑴ 选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二 酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。• ⑵ 选育 ADP 磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育 2,4- 二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。• [3] 选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如 可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。
  22. 22. 乙醛酸循环• 在异柠檬酸裂解酶的催化下,异柠檬酸被 直接分解为乙醛酸,乙醛酸又在乙酰辅酶 A 参与下,由苹果酸合成酶催化生成苹果 酸,苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过 程。• CO2 固定反应:表面上是二氧化碳被固定 于丙酮酸生成草酰乙酸的反应。
  23. 23. 调控机制:• 一.谷氨酸比天冬氨酸优先合成,谷氨酸合成过量 后,谷氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反阻 遏,代谢转向合成天冬氨酸。• 二.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化 CO2 固定的关键 酶,受谷氨酸的反馈抑制。• 三.柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶,除受能荷 调节外,还受谷氨酸的反馈阻遏。• 四.谷氨酸脱氢酶受谷氨酸的反馈抑制和阻遏。
  24. 24. 温度• 谷氨酸菌体最适生长温度为 30-32℃ ;谷 氨酸最适合成温度为 34-37℃ ;发酵初期 温度提高可以缩短细胞生长时间,减少发 酵总时间;发酵中、后期的菌体活力较 强,适当提高发酵温度有利于细胞膜渗透 性和产酸,故温度应控制稍高一些。
  25. 25. 生物素添加量的不同• 生理作用:维生素 H 与酶结合参与体内二 氧化碳的固定和羧化过程,与体内的重要 代谢过程如丙酮酸羧化而转变成为草酰乙 酸,乙酰辅酶 A 羰化成为丙二酰辅酶 A 等 糖及脂肪代谢中的主要生化反应有关 生物素过量:菌体大量繁殖,不产或少产 谷氨酸。• 生物素不足:菌体生长不好,谷氨酸产量也低。   • 生物素亚适量:菌体生长,谷氨酸产量很高
  26. 26. the end ~

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