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Image J を用いた組織像の定量解析

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How to use the Image J for quantification of histological sections such as Oil red O & Hematoxylin staining.

Published in: Technology
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Image J を用いた組織像の定量解析

  1. 1. Image J を用いた Oil Red O & Hematoxylin 染色等の 染色像の定量解析 東京理科大学大学院 薬学研究科 薬科学専攻 東京理科大学 総合研究院 戦略的環境次世代健康科学研究基盤センター 小野田 淳人 (3b13624@alumni.tus.ac.jp) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Oil red O Hematoxylin Areaµm2
  2. 2. 組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも 有効な解析手法の一つです A B C D ほんまに? よぅわからへんなぁ 演 者 聴 衆 D 群は、A 群とC 群に比べて 脂質蓄積量(赤)が増加したんやで ※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています
  3. 3. D 群は、A 群とC 群に比べて 脂質蓄積量(赤)が増加したんやで ほんまや! よーさん増えとるやんか! 演 者 聴 衆 A B C D 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 A B C D Red Areaµm2 組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも 有効な解析手法の一つです ※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています ※著作権の関係上、グラフの数値は適当です では、どのようにすれば定量化ができるのか、Image Jを例に見ていきましょう。
  4. 4. 染色像の定量化までの流れ I. Image J の基礎(参考資料) II. Scale の単位変換 III. 三原色の分離: Split Channels IV. 赤色の輝度から青色の輝度を引く V. 測定領域の指定:閾値の決定 VI. 測定領域の定量化 今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に 2色ある染色像の定量方法を述べていきます。 また、単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、 同様の手法を適用することができます。
  5. 5. Image J の基礎:他力本願 http://www.slideshare.net/nmaro/imagej20116 バイオイメージング研究のためのImage J によるデジタル画像解析入門 朽津 夏麿(東京大学大学院) http://seesaawiki.jp/w/imagej/d/ImageJ%A5%DE%A5%CB%A5 %E5%A5%A2%A5%EB%A1%A7%A5%C1%A5%E5%A1%BC%A5 %C8%A5%EA%A5%A2%A5%EB%A4%C8%BC%C2%CE%E3 Image J マニュアル:チュートリアルと実例 インストールから実例まで、これらの資料を読めば、 たいていのことはできるようになります。
  6. 6. Image J の基礎:組織解析の注意点 組織切片における定量評価では、 絶対的な定量値にさほどの価値はありません。 大切なのは、対照群との比較解析です。 比較解析では、 染色効率が各切片で同一であることを前提にして成り立ちます。 そのため、 ① 組織固定の不十分など、変性による artifact がない切片 ② 染色態度を左右する固定時間、切片厚等が同一である切片 ③ 基本的に、同一試薬を用いて、同じ操作で、同時に染色した切片 ④ 同じ設定の同じ顕微鏡で撮影した画像* *③を満たしている場合に限る これらの条件を満たしていることが、 染色像の定量解析には必須となります。
  7. 7. Scale の単位変換 最終的に定量化するときは、基本的に『m』単位を用いますが、 Image J の初期設定では『pixel』になっています。 Image J の初期設定
  8. 8. Scale の単位変換 1.Image J を起動 起動直後の画面→ 2.”File” → “Open” を選択し、解析対象の画像を開く 3.虫眼鏡のマークを選び、 画像を拡大する
  9. 9. Scale の単位変換 4.Straight line selections を選択する 5.画像のスケールバーに合わせて、線を引く(黄色) 6.”Analyze” → “Measure” をクリックするとResultsウィンドウが出てくる 7.この場合、50 µmが 293.750 pixelである ことを示している。
  10. 10. Scale の単位変換 8.”Analyze” → “Set Scale” をクリックするとSet Scaleウィンドウが出る 9.Distance in pixels に先ほど測定したpixel数を、 Known distance にスケールバーの長さを、 Unit of length にスケールバーの単位を入力する 10.OKをクリックして、 Scaleの単位設定を終了する ※この時の値(○○ pixels/µm など)を メモしておくと、後で楽になる
  11. 11. 三原色の分離: Split Channels 11.再度、解析対象の同じ画像を開きなおす 12.”Image” → “Color” → “Split Channels” を選択 13.Red, Green, Blue に分かれた3つの画像が表示される Red Green Blue初期画像 例えばRedの画像なら、赤の色調(波長)を多く含むところほど輝度が高く、 赤の色調(波長)が少ないところほど輝度が低く示される 低 高 まず、各色の輝度を抽出するために、色の分離を行います。
  12. 12. 赤色の輝度から青色の輝度を引く 14.今回用いた Oil red O & Hematoxylin 染色は、 赤色と青色の色調が強いため、 Redの画像とBlueの画像を残す 15.”Process” → “Image Caluculator” を クリックして開く 16.Redの画像からBlueの画像が 減算(Subtract)されるように設定する 17.OKをクリックすると 赤の波長の強いところが白色になり、 それ以外は黒色になった画像が入手できる (場合によっては、さらに Green を減算することもある) Red - Blue 18.”File” → “Save as” で 任意のフォルダに保存する 定量したい色の輝度から不要な色の輝度を減算します。
  13. 13. 赤色の輝度から青色の輝度を引く:簡単な原理 Blue Red Red-Blue 初期画像 Split Subtract 赤(Oil red O) 青(Hematoxylin) 白(血管腔) 赤の波長が強い赤色と白色の輝度が高い 青の波長が強い青色と白色の輝度が高い 赤の輝度大ー青の輝度小= 輝度大(白で示される) 赤の輝度小ー青の輝度大= 輝度は負の値(黒) 赤の輝度大ー青の輝度大= 輝度小(黒) 赤の輝度ー青の輝度= 減算後の輝度 結果的に、減算後の画像では赤色の部分だけが高い輝度(白色)で示される
  14. 14. 測定領域の指定:閾値の設定 19.減算によって得られた画像を開く 20.”Image” → “Adjust” → “Threshold”を クリックして開く 21.閾値となる値を設定する(次スライド参照) ※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて 同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。 22.値を決定した後、 Applyをクリックして適用する。 23. ”File” → “Save as” で 任意のフォルダに保存する ※この画像は 手法を示す際に、もとの画像と比較して 論文に使用されることが多い 数値化する領域を決定するために閾値を定めます。
  15. 15. 測定領域の指定:閾値の決定 21.閾値となる値を設定する ※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて 同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。 10 25 40
  16. 16. 測定領域の指定:閾値の決定 21.閾値となる値を設定する ※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて 同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。 重ね合わせた結果、25-255の値が実際の Oil Red O 陽性脂肪滴に近いため、 この画像をもとに定量することができる。この実験系の全ての画像に対して 25-255を適用しなければ、適切な比較解析はできない。
  17. 17. 測定領域の定量化 24.再び、減算後の画像を開く ※ “Threshold” 後の画像を 利用してもよいが、使いにくい 25.再び ”Image” → “Adjust” → “Threshold”を クリックしてThresholdを開く 26.決定した閾値を入力する 27.指定した部分が赤くなる 28. ”Analyze” → “Set Scale” を開いて スケールを確認する ※場合によっては、 最初にメモした値を入力し直す 指定した領域を定量化します。
  18. 18. 測定領域の定量化 29. ”Analyze” → “Set Measurement” を クリックして、測定項目と範囲を選択する 30.まずは、画像全体の面積を測定するため、 “Area” のみにチェックを入れる 31. ”Analyze” → “Measure” をクリックすると 指定した範囲の面積が示される ※この場合は画像全体の面積が示される
  19. 19. 測定領域の定量化 32. ”Analyze” → “Set Measurement” を クリックして、測定項目と範囲を選択する 33.指定した領域の面積を測定するため、 “Area” と ” Limit to Threshold” に チェックを入れる 34. ”Analyze” → “Measure” をクリックすると 指定した範囲の面積が示される ※この場合は指定した領域(赤い部分)の 面積が示される 35.研究内容に応じて、定量値をそのまま、 あるいは面積比を算出して用いる。
  20. 20. ちなみに:各閾値の場合の定量値 10 25 40 22074.669 12056.887 6793.291 同じ画像からでも閾値に応じて異なる結果が得られるので、 細心の注意をはらって閾値を決定する
  21. 21. 測定領域の定量化 36.Resultsのウィンドウを消去する際に保存するか問われるため “Yes” を選択する 37.保存されるファイルは .xls 形式なのでエクセルとして使用可能 38.得られた数値をもとにFigure、あるいはTableを作成し、 論文に用いる 39.Accept される
  22. 22. おわりに 今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に 2色ある染色像の定量方法を述べましたが、 単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、 同じ手法を適用することができます。 また、 3種以上の色が存在する場合、 黄色や緑、茶色等、原色から遠い色を定量化する場合など、 条件が厳しい画像の際、Image J による定量化の前に Photoshop を用いて画像編集を施すことで 定量化が可能になる場合があります。 そちらの方は、またの機会にお話しできればと思います。 何か、ご質問等のある方はこちらまで連絡を下さい。 → 3b13624@alumni.tus.ac.jp

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