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Utilisation du modèle de coculture cellules endothéliales humaines/P. falciparum pour l'analyse de la pathogénicité des isolats plasmodiaux

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Utilisation du modèle de coculture cellules endothéliales humaines/P. falciparum pour l'analyse de la pathogénicité des isolats plasmodiaux - Conférence de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Fousseyni TOURE - CIRMF, Franceville, Gabon - fousseyni@yahoo.fr

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Utilisation du modèle de coculture cellules endothéliales humaines/P. falciparum pour l'analyse de la pathogénicité des isolats plasmodiaux

  1. 1. Utilisation du modèle de co-culture cellules endothéliales/Plasmodium falciparum pour l’étude de lapathogénicité des isolats plasmodiaux CIRMF & INSERM 511Fousseyni Touré-Ndouo, A Siau, O Oukem, U Bisvigou, O Moussa, S Bisser, D Mazier
  2. 2. Interactions hôte-Plasmodium falciparumPf Foie Hématie Cytoadhérence, Séquestration Cellules endothéliales vasculaires Lars Hvid et al. 2005 (modifié)
  3. 3. Séquestration au cours du neuropaludisme Flux sanguinAutoagglutination des HP 1 2 1 Blocage mécanique des capillaires Cytoadhérence des HP Rosette cytokines proinflammatoires (1), toxines (2). Modèle Lékana-Douki et al. 2003
  4. 4. ApoptoseP. falciparum 3D7 (souche de laboratoire)induit l’apoptose de la cellule endothélialepulmonaire humaine par contact physique(cytoadhérence) Pino et al. 2003
  5. 5. Objectif généralAnalyser le rôle des molécules de transduction du signal dans la pathogenèse du paludisme
  6. 6. Objectifs spécifiques• Analyser la capacité des isolats plasmodiaux à cytoadhérer et à induire des modifications (apoptose etc.) de la cellule endothéliale• Etablir une corrélation entre ces modifications et l’état clinique des patients• Identifier les ligands et récepteurs impliqués dans la pathogénicité pour la perspective vaccinale et/ou thérapeutique
  7. 7. Matériels et méthodesRecrutement de patients, collecte dedonnées cliniques et d’ isolats plasmodiauxCulture de cellules endothélialespulmonaires humaines (HLEC)Maturation des isolats P.fCo-cultures HLEC-Isolats P.fRéalisation des tests (cytoadhérence,ELISA apoptose, préparation des ARNm,DNA microarray ou Biopuce)
  8. 8. Collection des isolats plasmodiaux et formes sanguines Goutte épaisse A Goutte épaisse B680.000 anneaux / l de sang 250.000 trophozoïtes / l de sang
  9. 9. Maturation ex vivo (24 – 48 h) 12% Schizontes
  10. 10. Enrichissement en schizontes 80%
  11. 11. Co-culture: HLEC/ isolats Pf Suspension de schizontes 1 2 3 HLEC HLEC HLECCytoadhérence (1h) Apoptose (4 h) Contact (4h) collection ARNm
  12. 12. Cytoadhérence 5.619 PRBC/mm2 HLEC
  13. 13. Cytoadhérence 6000 5000 4000PRBC/mm2 HLEC 3000 2000 1000 0 D1 F17 F28 F3 F31 F33 F36 F39 F43 F45 F48 F50 F54 F59 F62 F64 F69 F37 F5 F52 F61 Isolats Pf
  14. 14. La cytoadhérence n’est pas associée à la charge parasitaire Isolats Pf Nombre de Cytoadhérence schizontes PRBC/mm2HLEC x 103 F3 4881 216 F31 23760 937 F69 27324 1686 F32 26080 5619 F37 26730 197 F42 13365 1561 F53 26730 592 F62 3960 437 F60 18810 5 F26 4703 230
  15. 15. ELISA apoptose (1)2,4002,200 *2,000 *1,8001,6001,400 DO échantillons1,200 DO GRS1,0000,800 * *0,600 * * * * *0,400 * * * *0,2000,000 D1 F1 F4 F7 F9 F16 F18 F21 F26 F30 F31 F33 F36 F38 F49 F51 F54 F55 F56 F59 F61 F63 F67 F69
  16. 16. ELISA apoptose (2) N = 45 P.f Paludisme malaria 35Uncomplicatedsimple 35 Paludisme10 sévère 10 5 5 apoptotiques 4 apoptotiques 20% d’isolats apoptotiques
  17. 17. L’apoptose n’est pas associée à lagravité du paludisme (p=0,11)Les isolats apoptotiques se rencontrentaussi bien dans les cas simples quedans les cas sévères
  18. 18. L’apoptose est associée aux signes neurologiques Fisher exact test p= 0,02Isolats Pf Apoptose Critères de sévérité (OMS 2000) F3 + Prostration F31 + Prostration F69 + Coma F32 + Hyperparasitémie F37 - Hyperparasitémie F42 - Hyperparasitémie F53 - Hyperparasitémie F62 - Prostration F63 - Hyperparasitémie F26 - Anémie
  19. 19. HypothèseL’apoptose pourrait être impliquée dans les dommages causés à la barrière hématoméningée au cours du neuropaludisme
  20. 20. Apoptose CE et barrière hématoméningée Modèle Bisser et al. 2006
  21. 21. Relation entre cytoadhérence et apoptose 25 20 HLEC apoptose 15 10 5 0 1 10 100 1000 10000 Cytoadhérence PRBC▲ Paludisme sévère avec signes neurologiques (prostration ou coma); Paludisme sévère sans signes neurologiques (anémie et hyperparasitémie) Paludisme simple
  22. 22. Transcriptome associé à l’induction de l’apoptose 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
  23. 23. Recherche PlasmoDBCes gènes codent en grande majoritépour des antigènes de surface dont certains sont impliqués dans la cytoadhérence
  24. 24. Résumé• Environ 20% des isolats plasmodiaux de Franceville (Gabon) induisent l’apoptose de la cellule endothéliale• L’apoptose est associée aux signes neurologiques• 23 gènes associés à la pathogénicité des isolats plasmodiaux ont été identifiés
  25. 25. Perspectives• Expression d’antigènes recombinants correspondant à certains de ces gènes• Analyses immunologiques (recherche de candidats vaccins potentiels)• Co-culture cellules endothéliales cérébrales/P. falciparum
  26. 26. Remerciements (1)• Patients et leurs parents• Hôpital AMISSA BONGO• CIRMF• INSERM 511
  27. 27. Remerciements (2)• Directeur de l’Institut Pasteur de Madagascar• Initiateurs et organisateurs de l’Atelier Paludisme• Peuple Malgache
  28. 28. Merci

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