Variabilité génétique de Plasmodium: implications pour le développement de vaccins et le diagnostique - Présentation de la 8e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - MOYA ALVAREZ Violeta et SIRIBIE Mohamadou

1. Variabilité génétique de Plasmodium:
implications pour le développement de
vaccins et le diagnostique
Physiopathologie, Immunologie et Génétique
25/ 3/2011
Moya Alvarez Violeta
Siribié Mohamadou

2. PlanPlan
I. Introduction
• Définitions: variabilité et polymorphisme génétique.
II. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le diagnostic
• Le Test de Diagnostique rapide: bases et limites.
• Caractéristiques et variabilité de HRP-2.
• Implications de la variabilité génétique de HRP2 pour le diagnostique d’infection par
Plasmodium falciparum.
III. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le
développement de vaccins
• Carte des antigènes parasitaires et implications pour le développement des vaccins.
• Polymorphismes génétiques et cibles des vaccins: CSP, MSP-1, 3 et Pfs25.
• Vaccins contre Plasmodium dans ses différents stades parasitaires.
• Perspectives sur le développement de vaccins.
IV. Conclusion
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3. PlanPlan
I. Introduction
• Définition: variabilité et polymorphisme génétique.
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4. • Polymorphisme: séquences d’ADN différentes au
sein du même allèle.
• Variabilité génétique: ensemble des versions
d’un gène résultant des différentes forces
évolutives:
I. DI. Dééfinitions et dfinitions et dééterminants de lterminants de l’é’évolutionvolution
ggéénnéétiquetique
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mutation
migration
dérive
sélection

5. PlanPlan
II. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le diagnostic
• Le Test de Diagnostique rapide: bases et limites.
• Caractéristiques et variabilité de HRP-2.
• Implications de la variabilité génétique de HRP2 pour le diagnostique d’infection par
Plasmodium falciparum.
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6. IIII. Le Test de Diagnostic Rapide I. Le Test de Diagnostic Rapide I
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• Importance significative pour l’amélioration du diagnostic en
termes de santé publique.
• Dispositifs d'immunochromatographie à flux latéral.
• La plupart détectent
des protéines spécifiques de P. falciparum: PfHRP2, Pf-pLDH.
antigènes de P. falciparum et antigens pan-spécifiques: aldolase ou
pan-malaria pLDH.

7. • Performance du test diagnostic dépend de :
• Dégré de variation antigénique limité pour l’aldolase et la pLDH.
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IIII. Le Test de Diagnostic Rapide II. Le Test de Diagnostic Rapide II
HRP-2

8. IIII. Caract. Caractééristiques de HRPristiques de HRP--22
• HRP-2: Histidin Rich Protein 2.
• Spécifique de Plasmodium falciparum.
• Demi-vie de 10 jours.
• Exprimée lors des stades asexués.
• Variabilité des gènes qui la codifient
variabilité protéique de HRP-2
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Problématique: en quelle mesure la variabilité de HRP-2 influence la détection de
Plasmodium falciparum avec les tests de diagnostic rapide?

9. IIII. Principes de l. Principes de l’’immunochromatographieimmunochromatographie dede
flux latflux latééralral

10. IIII. Variabilit. Variabilitéé de HRPde HRP--22
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• Au laboratoire, différences significatives entre les épitopes reconnus par les 4
différents anticorps présents dans les TDR et des anticorps « candidats » pour être
inclus dans les TDR.
Y-a-t-il des différences entre la séquence du gène codifiant pour le HRP-2?

11. IIII. Etude de la variabilit. Etude de la variabilitéé de HRPde HRP--22
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•Au laboratoire, 75 clones et isolats de Plasmodium falciparum de 19 pays différents
sont analysés.
•Amplification du gène codifiant pour la HRP-2 de Plasmodium falciparum par PCR.
•Les cultures de Plasmodium falciparum sont diluées dans du sang non-parasité ayant
un hématocrite de 40%.
•9 suspensions à des densités erythrocytaires croissantes 65-100000 cellules/ μl sont
analysées avec deux TDR standard.
•Analyse statistique des différentes séquences pour établir leur analogie.
•Modèle logistique de prédiction de la positivité du test à partir des séquences
retrouvées.

12. IIII. R. Réésultats de lsultats de l’é’étude de la variabilittude de la variabilitéé de HRPde HRP--22
• Sources de variation en HRP2:
Différences dans la séquence des bases
Différence dans le nombre de répétitions de paires de bases
Délétion du gène dans 1 cas(absence).
• 56 séquences différentes, dont 43 uniques.
• 14 aminoacides différents
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Genetic Diversity of Plasmodium falciparum Histidine-Rich Protein 2 (PfHRP2) and Its
Effect on the Performance of PfHRP2-Based Rapid Diagnostic

13. IIII. Diff. Difféérentes srentes sééquences gquences géénnéétiques codifianttiques codifiant
HRPHRP--22
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1: Séquences uniques retrouvées une seule fois.
Séquences retrouvées plus d’une fois. (Chaque couleur correspond à une
séquence différente).
• Certaines séquences retrouvées dans tous les gènes de HRP-2.
• A un risque α =5%,
Pas de différences significatives entre la séquence totale du gène en
fonction de l’aire géographique.
Différences significatives dans la répétition de certaines séquences.

14. IIII. Implications de la variation g. Implications de la variation géénnéétique pourtique pour
le TDRle TDR
• Tous les isolats cultivés in vitro sont détectés par les TDR à partir
d’une densité de 1000 érythrocytes/μl.
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15. IIII. Limites de l. Limites de l’é’étudetude
• Manque de terrain: étude réalisé à partir de
clones et isolats de laboratoire.
• Choix arbitraire des échantillons.
• Choix arbitraire des antigènes.
Manque de représentativité. Biais de
sélection.
• Modèle prédictif non représentatif et absence
d’analyse exploratoire.
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16. IIII. Perspectives pour une prochaine. Perspectives pour une prochaine éétude ettude et
applications sur les TDRapplications sur les TDR
• Réalisation de l’étude à partir de parasites de cas
incidents.
• Etude randomisée, multicentrique en aveugle avec une
couverture géographique maximale.
• Considérations éthiques.
• Possibilité de reconnaissance d’épitopes différents de la
part de l’anticorps « de reconnaissance » et de l’anticorps
« de signalement » ou application d’autres anticorps.
• Etude sur la « prospection évolutive » des mutations.
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• Besoin de réalisation d’une étude qui parte des conditions
réelles avant de tirer des conclusions sur l’effet de la
variabilité génétique de HRP-2 sur la sensibilité des TDR.
Jusqu’à présent, aucune étude n’a fait preuve d’un vrai
impact sur le terrain.

17. PlanPlan
III. Polymorphismes génétiques de Plasmodium : implications pour le développement
de vaccins
• Carte des antigènes parasitaires
• Polymorphismes génétiques: CSP, MSP-1 et Pfs25.
• Implication pour le développement Vaccins contre Plasmodium
• Perspectives - solutions
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18. 25/03/2011 Variabilité génétique de Plasmodium 18
Figure 1: Carte des antigènes parasitaires représentant une cible

19. Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène CSPne CSP
(1)(1)
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CSP: localisée sur la surface du sporozoïte mature
Locus polymorphe localisé sur le chromosome 3 des
parasites plasmodiaux gène
Figure 2: Organisation du gène codant la protéine circumsporozoïtaire
(CSP) de Plasmodium.

20. Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène CSP (2)ne CSP (2)
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Tableau I: Diversité nucléotidique au niveau de l’épitope Th2R du gène CSP dans
différentes localisations géographiques
(A A Escalante et al. 2002)
Localités n Th2R
µ Nhap Hapdiv
Kenya 51 0.09772(0.00525) 29 0.966
Gambie 17 0.08789(0.01110) 11 0.912
Sénégal 11 0.07446(0.01010) 7 0.909
Caméroun 9 0.07143(0.00875) 7 0.944
Brésil 9 0.02646(0.01956) 2 0.222
Vénézuéla 10 0.08466(0.00739) 6 0.867
Inde 11 0.01840(0.00686) 4 0.491
Thailande 24 0.03990(0.00873) 6 0.598
Séquences Totales 174 0.07917(0.00323) 50 0.937
n = Nombre d'échantillons des séquences par localité µ = diversité nucléotidique
Nhap= Nombre d'haplotypes Hapdiv = diversité des haplotypes

21. Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène MSP 1 (1)ne MSP 1 (1)
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Protéine est synthétisée sous forme d'un précurseur de
195 kDa présent sur le schizonte.
Locus polymorphe localisé sur le chromosome 9
Gène: 17 blocs comprenant 5 régions conservées + 5 semi-
conservées et 7 variables (Tanabe et al., 1987)
Figure 3 : Organisation du gène codant la protéine Pf MSP I.
SemiSemi--conservedconserved regionregion VariableVariable regionregion

22. Polymorphisme gPolymorphisme géénnéétique du gtique du gèène MSP 1 (2)ne MSP 1 (2)
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Tableau II: Fréquence des allèles du bloc 2 du gène MSP I selon les années dans des
souches péruviennes
Description allèle Nombre fréquence fréquence fréquence fréquence
1998-1999 2003-2005 2006
K1-126 67 0.4962 0.4898 0.5625 0.463
MAD20-144 49 0.363 0.4082 0.25 0.3889
K1-99 8 0.0593 0 0.1563 0.0556
K1-117 4 0.0296 0 0 0.0741
K1-117 5 0.037 0.0816 0 0.0185
MAD20-135 1 0.0074 0 0.0313 0
K1-81 1 0.0074 0.0204 0 0
K1 total allèle = 85 MAD20 total allèle = 50 (SM Chenet et al. 2008)
p-value testing year-study difference = 0,0167

23. Implication pour le dImplication pour le dééveloppement desveloppement des
vaccins(1)vaccins(1)
Vaccins pré – érythrocytaires: contre sporozoïtes et
schizontes hépatiques.
Exemples: Vaccins RTS,S/ASO2A (CSP+ AgS
Hb+ASO2A)
- réduit 34% risque de nouvelle infection sur 15
semaines chez les adultes (Bojang KA et al, 2001)
- Contre 45% de nouvelle infection, 30% accès
palustre et 57% formes graves chez les
enfants en Mozambique au cours des 6 1er
mois (Alonso PL et al, 2004) Phase IIb
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24. Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (2)veloppement des vaccins (2)
En Gambie et au Mozambique: efficacité égale entre
groupes des vaccinés et des contrôles en fin de suivi.
Hypothèse: une bonne partie de l’efficacité serait liée à
l’adjuvant plutôt qu’au CSP(G. Snounou et al. 2005)
Limite: vaccin ne permettrait pas d’induire une immunité
long terme et on suggère que son effet s’attenue
rapidement avec le temps
Explication possible: Une variation antigénique (JN
Waitumbi et al.2009).
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25. Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (3)veloppement des vaccins (3)
Vaccins contre stades sanguins asexués: contre les
mérozoïtes.
Vaccin recombinant B: RESA + MSP1 + MSP2 (allèle
3D7) + Adjuvant à base d’huile (B. Genton et al. 2001. Phase 1-
2b A phase 1–2b double-blind, randomized, placebo-controlled trial in 120
children (5–9 years old)).
Prévalence faible de parasites portant la forme
allélique 3D7-MSP2 (correspondant à celle dans le
vaccin) et une incidence plus élevée des épisodes
morbides associés à des parasites FC27-type.
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26. Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (4)veloppement des vaccins (4)
Limite: vaccin ne contenant qu’une seule version des allèles
naturellement exprimé par les parasites:
Protection contre les parasites portant cet allèle
+ sélection des parasites avec variant antigénique
FC27+ immunité réduite
Explications: polymorphisme allélique des Ag
Solution potentielle: rajouter l’allèle manquant dans le vaccin.
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27. Implication pour le dImplication pour le dééveloppement des vaccins (5)veloppement des vaccins (5)
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Figure 3: Courbe de survie de Kaplan-Meier comparant les épisodes positifs aux parasites de
types 3D7- and FC27 chez les sujets après le traitement avec le placebo ou le vaccin pré -
érythrocytaire recombinant.

28. PerspectivesPerspectives -- SolutionsSolutions
Recherche continue sur:
- polymorphisme génétique
- Nouveaux antigènes
Vaccins à base des zones non polymorphes (Ex: 19kDa PfMPS1)
et/ou vaccins polyvalents avec variants alléliques
(Vaccins multivalents)
Adjuvants puissants (pas trop réactogènes) pour
compenser la faible immunogénicité des Ag.
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29. PlanPlan
IV. Conclusion
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30. ConclusionConclusion
Grande variabilité génétique de HRP-2, mais pas d’études sur
le terrain sur son influence dans les TDR.
Polymorphisme génétique + variabilité antigénique =
difficultés difficulté de la mise au point des vaccins
Espoir +++: poursuite de l’effort
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31. MISAOTRAMISAOTRA
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32. BibliographieBibliographie
• AA Escalante, HM Grebert , R Isea et al. (2002). A study of genetic diversity in the gene encoding the circumsporozoite protein
(CSP) of Plasmodium falciparum from different transmission areas - XVI. Asembo Bay Cohort Project. Molecular & Biochemical
Parasitology 125 (2002) 83/90
• Baker, J. Genetic Diversity of Plasmodium falciparum Histidine-Rich Protein 2 (PfHRP2) and Its Effect on the Performance of
PfHRP2-Based Rapid Diagnostic Tests » Oxford Journals, J Infect Dis. 2005 Sep 1;192(5):870-7. Epub 2005 Jul 21.
• SM Chenet, OH Branch, A A Escalante et al. (2008). Genetic diversity of vaccine candidate antigens in Plasmodium falciparum
isolates from the Amazon basin of Peru. Malaria Journal 2008, 7:93 doi:10.1186/1475-2875-7-93.
• K.T Tanabe, M Mackay, M Goman,et al. (1987). Allelic dimorphism in a surface antigen gene of the malaria parasite Plasmodium
falciparum. J. Mol. Biol. 195, 273-287.
• KA Bojang, PJ Milligan, M. Pinder et al. Efficacy of RTS,S/ASO2A malaria vaccine against P.falciparum infection in semi- immune
adult men in the in the Gambia: a randomised trial. Lancet 2001; 358(9297): 1927-34
• PL Alonso, J Sacarlal, JJ Aponte et al. Duration of protection of with RTS,S/ASO2A malaria vaccine in prevention of P. falciparum
disease in Mozambican children: single – bling extended follow-up of a randomised controlled trial. Lancet 2005; 366
(9502):2012-8.
• Hartl, D; « The paradoxical population genetics of Plasmodium falciparum » TRENDS in Parasitology Vol.18 No.6 June 2002.
• Lee, N. Effect of Sequence Variation in Plasmodium falciparum Histidine- Rich Protein 2 on Binding of Specific Monoclonal
Antibodies:Implications for Rapid Diagnostic Tests for Malaria” JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2006
• G Snounou, AC Gruner, CD Muller-Graf et al. The P. falciparum sporozoïte survives RTS,S vaccination. Trends parasitol 2005;
21(10) : 456 -61.
• B Genton, I Betuela, I Felger et al. A recombiant blood-stage malaria vaccine reduces P. falciparum density and exerts selective
pressure on parasite populations in phase I – Iib trial in Papua New Guinea. J InfectDis 2002; 185 (6): 820-7.
• Y Wu, RD Ellis, Dshaffer et al. (2008). Phase 1 Trial of Malaria Transmission Blocking Vaccine Candidates Pfs25 and Pvs25
Formulated with Montanide ISA 51. PLoS ONE 3(7): e2636.doi:10.1371/journal.pone.0002636.
• Waitumbi JN, Anyona SB, Hunja CW, et al. (2009) Impact of RTS,S/AS02A and RTS,S/AS01B on Genotypes of P. falciparum in
Adults Participating in a Malaria Vaccine Clinical Trial. PLoS ONE 4(11): e7849. doi: 10.1371 /journal.pone.0007849
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