3 gen 2 76

14,380 views

Published on

0 Comments
16 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
14,380
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
349
Comments
0
Likes
16
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

3 gen 2 76

  1. 1. Mutation&DNA repairการกลายพันธุ์(Mutation) หมายถึง ภาวะทีมีการเปลียนแปลงของสารพันธุกรรม ทําให้สิงมีชีวิตมีลักษณะแตกต่างจากเดิม ข้อดีของmutation คือ การวิวัฒนาการ/การกลายพันธ์ทําให้เกิดสิงมีชีวิตชนิดใหม่ ข้อเสีย คือการทําให้เกิดโรคและความผิดปกติของร่างกายMutation แบ่งตามระดับการเปลียนแปลงของจีน ได้ 3 ระดับประเภทของการกลายพันธุ์ กลไกทีทําให้เกิดการกลายพันธุ์ ตัวอย่างการเปลียนแปลงGenome mutation(ผิดปกติทีจํานวนChromosome)Chromosome missegregation AneuploidyPolyploidyChromosome mutation(ผิดปกติทีรูปร่างChromosome)Chromosome rearrangement TranslocationGene mutation(ผิดปกติระดับของลําดับเบส)Base pair mutation Point mutationซึงในบทนีจะกล่าวถึงเฉพาะ gene mutationGene mutationคือการเปลียนแปลงของลําดับเบส ซึงจะส่งผลถึงลําดับของ mRNA และลําดับของกรดอะมิโน ซึงอาจะมีผลต่อการทํางานของโปรตีนทีเซลล์สร้างขึน เราสามารถแบ่งชนิดของ Gene mutation ตามการเกิดได้ 2 แบบคือ การทีเบสเดิมถูกแทนทีด้วยเบสอืนซึงอาจะเป็นชนิดเดียวกันหรือต่างชนิดกันก็ได้ (purine,pyrimidine)การเกิด mutation แบบนี จะทําให้ reading frame (กรอบในการอ่านลําดับเบสบนDNAโดยอ่านทีละ3ตําแหน่ง)ไม่มีการเปลียนแปลง จึงก่อให้เกิด mutation เฉพาะจุด เรียกว่า point mutationเราสามารถจําแนกการเกิด point mutation ออกเป็น 2 แบบ ได้แก่1. Transition คือการเปลียนเบสไปเป็นเบสใหม่ทีอยู่ในกลุ่มเดียวกัน คือ purine (A G) , pyrimidine (C T)2. Tranversion คือการเปลียนเบสไปเป็นตัวใหม่ทีอยู่คนละกลุ่ม purine pyrimidineผลกระทบจากการเกิด point mutation สามารถแบ่งได้เป็น 4 แบบ ได้แก่1) Silent mutation คือ การเปลียนลําดับเบส โดยทีไม่ทําให้กรดอะมิโนเปลียนไป มักเกิดกับเบสตําแหน่งสุดท้ายของ reading frame เนืองจากเป็นตําแหน่งทีมักมี wobble-base pairing เช่น เปลียนจาก AUG UUU CCCเป็น AUG UUC CCC ก็ยังจะได้ลําดับอะมิโนออกมาเป็น Met-Phe-Pro เช่นเดิม เนืองจากทัง UUU และ UUC เป็นcodonของ Phenylalanine ทังคู่1.การแทนทีเบส (Base substitution)General Principle 2
  2. 2. 2) sense mutation คือ การเกิดเป็นโปรตีนปกติในร่างกายเช่นเดิม ความผิดปกติจากการเกิด3) missense mutation คือ การเกิดไม่สามารถกลับมาทํางานได้เหมือนเดิม4) nonsense mutation คือ การเกิดโปรตีนสายสันกว่าปกติ5) regulatory mutation คือการเกิการสังเคราะห์โปรตีนมากขึน หรือน้อยลง หรือสังเคราะห์ไม่ได้เลย6) RNA processing mutationการเปลียนลําดับเบสบริเวณทีจําเพาะต่อการตัดคือ การทีมีเบสบนสาย DNA เพิมขึนมา หรือหายไปให้ reading frame บริเวณหลังต่อจุดเกิด mutationทังหมด เรียกว่า frameshift mutationRegulation of gene expression- โครงสร้างของโครโมโซม คือ ChromatinProtein ทีชือว่า Histone (ซึงเป็นโปรตีนทีมีประจุบวก ทําให้ยึดเกาะกับได้ดี) เกาะกันเป็น Nucleosome และพันกันเป็น2. การเพิม/ขาดหายของลําดับเบสคือ การเกิด point mutation แล้วทําให้กรดอะมิโนเปลียนไป แต่ยังสามารถทํางานได้เป็นโปรตีนปกติในร่างกายเช่นเดิม ความผิดปกติจากการเกิด sense mutation จึงน้อยหรือแทบไม่มีคือ การเกิด point mutation ทีทําให้กรดอะมิโนของโปรตีนเปลียนไป แล้วโปรตีนคือ การเกิด point mutation ทีทําให้เกิด stop codon(UAA,UAG,UGAคือการเกิด point mutation ของgene ทีบริเวณ promoter และ Enhancerการสังเคราะห์โปรตีนมากขึน หรือน้อยลง หรือสังเคราะห์ไม่ได้เลย6) RNA processing mutation คือ การเกิด point mutation ทีส่งผลต่อกระบวนการตัดแต่งการตัด RNA (RNA splicing) ทําให้ได้สาย mRNA ทีผิดปกติเพิมขึนมา หรือหายไป 1 ตัวหรือมากกว่า การเกิด mutation ตามกลไกนีจะทําmutation เลือนไปทังหมด จึงเกิดกรดอะมิโนหลังตําแหน่ง mutationChromatin ซึงประกอบด้วย DNA กับซึงเป็นโปรตีนทีมีประจุบวก ทําให้ยึดเกาะกับDNAและพันกันเป็น Chromatinขาดหายของลําดับเบส (Base insertion/deletion)แล้วทําให้กรดอะมิโนเปลียนไป แต่ยังสามารถทํางานได้ทีทําให้กรดอะมิโนของโปรตีนเปลียนไป แล้วโปรตีนUAA,UAG,UGA) จึงได้Enhancer ทําให้มีทีส่งผลต่อกระบวนการตัดแต่ง mRNA เช่นตามกลไกนีจะทําmutation ผิดไป
  3. 3. - ขนาดของโครโมโซมนันสําคัญหรือไม่ ?มากกว่าเรา แต่เรามีวิวัฒนาการสูงกว่าพืช- จีนของยูคาริโอตนันจะอยู่กันเป็นส่วนๆ ได้แก่คือ ส่วนทีเราใช้เราพบว่า- เราcodeเป้าหมาย- ในการควบคุมการแสดงออกเราต้องรู้จัก1. Promoterบนupstreamของ DNA ซึงบริเวณนันมีรหัสgene transcription ลดลง2. Enhancer: บริเวณบน DNA ทีจับกับTranscription factor3. Silencer: บริเวณทีตัว repressor มาจับการควบคุมการแสดงออกของจีนยูคาริโอตแบ่งเป็น1.การควบคุมระดับจีน1.1 การเพิมจํานวนจีน (Gene Amplification)1.2 การจัดเรียงตัวใหม่ของDNA (DNA Rearrangement)1.3 การเติมหมู่เมทิลของ DNAบริเวณทีมีเบส CpG จํานวนมากอยู่ตอนต้นของจีนโครงสร้างทีเรียกว่าแสดงออก โดยเมทิลจะไปยับยังการจับของคําตอบคือ ไม่เชิง เพราะพืชมีโครโมโซมใหญ่กว่าเรา และสร้างสารได้มากกว่าเรา แต่เรามีวิวัฒนาการสูงกว่าพืชจีนของยูคาริโอตนันจะอยู่กันเป็นส่วนๆ ได้แก่ Exons กับ Intronsคือ ส่วนทีเราใช้codeเป็น Protein, RNA แต่ส่วนทีเหลือเป็น introเราพบว่า Introns บางตัวมาควบคุมการแสดงออกของจีนเราจําต้องควบคุมการแสดงออกของจีน เพราะ การแสดงออกของจีนcode RNA หรือ Biologically Active Protein ออกมาเพือแสดงออําเป้าหมาย และเหมาะสม เพราะร่างกายทีควบคุมความผิดปกติไม่ได้ก็จะเในการควบคุมการแสดงออกเราต้องรู้จัก 3 ตัวนีPromoter: บริเวณที RNA polymerase และ Transcription factorซึงบริเวณนันมีรหัสATมาก จึงเรียกว่า TATA Box ถ้า Promoter ผิดปกติ เราจะพบว่าจํานวนTranscription factor แล้วเพิมระดับการถอดรหัสของจีนมาจับการควบคุมการแสดงออกของจีนยูคาริโอตแบ่งเป็น 3 ระดับ คือ(Gene Amplification)DNA (DNA Rearrangement)DNA (DNA Methylation) คือ การเติมหมู่เมทิลให้กับ Cytosine(C)จํานวนมากอยู่ตอนต้นของจีนโครงสร้างทีเรียกว่า CpG island ซึงจะทําให้จีนนันไม่ทํางานหรือ ไม่ลจะไปยับยังการจับของTranscription factorDNA Rearrangemen*Enhancer และ Silencer จะอยู่ใกล้กัน ไกลกัน หรืออยู่ในจีนทีมันควบคุมก็ได้คําตอบคือ ไม่เชิง เพราะพืชมีโครโมโซมใหญ่กว่าเรา และสร้างสารได้Introns ซึง Exonsintrons ซึงปัจจุบันการแสดงออกของจีนจะต้องแสดงออําให้ได้ตามร่างกายทีควบคุมความผิดปกติไม่ได้ก็จะเกิดโรคTranscription factor มาเกาะเราจะพบว่าจํานวนCytosine(C) ทีC5ซึงจะทําให้จีนนันไม่ทํางานหรือ ไม่DNA Rearrangementจะอยู่ใกล้กัน ไกลกัน หรืออยู่ในจีนทีมันควบคุมก็ได้
  4. 4. 2.การควบคุมระดับการถอดรหัสโดยปกติเราจะมีการถอดรหัสในระดับตํา เพราะเซลล์เก็บ DNA ไว้ในรูป Nucleosome ซึงปิด Promoter ไว้ไม่ถอดรหัส ดังนันการถอดรหัสจังต้องเป็นแบบ Positive Regulation คือ ต้องมีตัวกระตุ้นจึงจะเกิดการถอดรหัส เช่นTranscription factor protein (TAP), ตัวเพิมประสิทธิภาพ (Enhancer)2.1 การควบคุมการถอดรหัสโดยโครงรูปโครมาตินโครมาตินจะถูกเก็บไว้ 2 แบบ คือHeterochromatin Chromatin จะอยู่กันอย่างหนาแน่น บริเวณนีมีการถอดรหัสEuchromatin บริเวณนีอยู่กันอย่างหลวมๆ โดยอาจพบNucleosomeน้อยหรือไม่พบเลย ซึงบริเวณนีมีการถอดรหัสสูงนอกจากนียังมีการดัดแปลง Histone (HIstoneModification) จะมีผลต่อการถอดรหัสด้วย เช่น(1) Histone Acetylation คือ การเติมหมู่Acetyl ให้กับHistone โดยใช้เอนไซม์ Histoneacetyl transferase (HAT) เพือทําให้ Histoneกลายเป็นAcetylhistone ซึงปกติ Histone มีประจุบวกและจับกับ DNA แต่ Acetylhistone เป็นNeutral และไม่จับกับ DNA (เพราะ DNA มีประจุลบจากฟอสเฟต) ทําให้เกิดการแสดงออกได้หลังจากเราแสดงออกแล้ว Acetylhistone จะถูกเปลียนกลับมาเป็น Histone โดยใช้เอนไซม์Histone deacetylase(2) Histone Methylation จะทําให้Histoneรวมตัวกันหนาแน่นมากขึน ทําให้กระบวนการถอดรหัสเกิดขึนได้ยาก2.2 การควบคุมโดยโปรตีนกระตุ้นกระบวนการถอดรหัส(Transcriptional Activator Protein:TAP)โปรตีนนีจะทําหน้าทีกระตุ้นกระบวนการสังเคราะห์ mRNA (DNA Transcription) จะมีองค์ประกอบสําคัญ 2ส่วน คือ ส่วนทีจับกับสายDNA (DNA binding domain) กับส่วนทีกระตุ้นกระบวนการสังเคราะห์RNA โดยโปรตีนTAPจะช่วยให้RNA polymeraseจับกับPromoterได้ดีขึน และทําให้DNAคลายตัวจากHistone ทําให้transcription complexสามารถเข้ามาจับกับPromoterได้ โดยเราสามารถจําแนกTAPตัวคุณสมบัติและลําดับของกรดอะมิโนของส่วนทีจับกับดีเอ็นเอได้หลายชนิด เช่น Helix-turn-helix, Zinc finger และ Leucin zipper
  5. 5. ตัวอย่าง TAP3.การควบคุมระดับแปลรหัสการควบคุมในระดับนีเป็นการควบคุมทีให้ผลเร็วกว่าการควบคุมในระดับอืนๆ โดยมีอายุเฉลียและความเสถียรของ mRNAเป็นตัวควบคุมอัตราเร็วและปริมาณการสังเคราะห์โปรตีนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ (DNA replication)- เกิดที nucleus มีเอนไซม์ทีใช้ในการสังเคราะห์ คือ- โดยเริมทีตําแหน่งจําเพาะทีเรียกว่า Origin of replicationเกลียวออกได้ในสองทิศทาง (bidirect- จะมี single-strand DNA-binding proteinกันอีก- และะมี enz DNA gyrase (DNA topoisomerase II)การควบคุมในระดับนีเป็นการควบคุมทีให้ผลเร็วกว่าการควบคุมในระดับอืนๆ โดยมีอายุเฉลียและความเป็นตัวควบคุมอัตราเร็วและปริมาณการสังเคราะห์โปรตีน(DNA replication)มีเอนไซม์ทีใช้ในการสังเคราะห์ คือ DNA polymeraseOrigin of replication โดยจะมี enz helicase เข้ามาแยกสายดีเอ็นเอให้คลาย(bidirection) ของจุดเริมต้น โดยมีจุดแยกสายทีเรียกว่า replicaton forkbinding protein (SSB) มาเกาะกับดีเอ็นเอสายเดียวทังสองสาย เพือไม่ให้กลับมาเข้าคู่enz DNA gyrase (DNA topoisomerase II) ช่วยให้ดีเอ็นเอเกลียวคู่ทีพันกันแน่นคลายตัวออกการควบคุมในระดับนีเป็นการควบคุมทีให้ผลเร็วกว่าการควบคุมในระดับอืนๆ โดยมีอายุเฉลียและความเข้ามาแยกสายดีเอ็นเอให้คลายreplicaton forkมาเกาะกับดีเอ็นเอสายเดียวทังสองสาย เพือไม่ให้กลับมาเข้าคู่นคลายตัวออก
  6. 6. - จากนัน DNA สายเดียวจะมี enz primase สร้าง RNA primer มาเกาะ เพือเป็นจุดเริมต้นให้ DNA polymerase IIIสังเคราะห์ DNA โดยจะเคลือนไปในทิศ 3’ ไป 5’ ของสาย template (5’ ไป 3’ ของสายใหม่) จะได้ทัง leadingstrand และ lagging strand (Okazaki fragment)- เมือสร้างสาย DNA มาถึง RNA primer ทีอยู่ข้างหน้า DNA polymerase III จะแยกออกเพือให้ DNA polymeraseI มาจับแทนเพือตัด RNA primer และสร้าง DNA แทนที RNA primer ก่อนทีจะแยกตัวออกแล้วให้ DNA ligaseมาเชือมต่อสาย DNAการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอ (RNA transcription)- เกิดที nucleus การสังเคราะห์ RNA จะใช้ DNA เป็นแม่แบบและใช้ Enz RNA polymerase สังเคราะห์ RNA ในทิศ 5’ ไป 3’ โดย RNA polymerase จะไม่มี Proofreading activity เหมือน DNA polymerase- ต้องการ DNA เพียงสายเดียวเป็นแม่แบบ เรียกสายทีเป็นแม่แบบว่า template strand ส่วนอีกสายเรียกว่า non-template strand หรือ coding strand เพราะมีการเรียงลําดับเบสเหมือน mRNA ทีสังเคราะห์ขึนมา- การเข้าคู่กันของ template strand และ RNA nucleotide A-U,T-A,C-G,G-Cตัวอย่าง DNA template 5’-TACGGCAATCT-3’จะได้ mRNA 3’-AUGCCGUUAGA-5’- หลังจากได้ mRNA แล้วจะต้องผ่านการตัดแต่ง (post-transcriptional RNA processing มีอยู่ 3 ขันตอน คือ1.การเติม 5’cap คือการเติม 7-methylguanosineเข้าทีปลาย 5’ ของ mRNA2.การเติม 3’tail ทีปลาย 3’ ของ mRNAประกอบด้วย poly A tail (มี enzriboendonuclease ตัด mRNA บริเวณทีจะเติมpoly A tail (มี AAUAAA เป็น cleavage signal)แล้วเติม poly A เข้าไป เชือมด้วย enzpolyadenylate polymerase)3.RNA Splicing ปกติ mRNA ทีถอดรหัสมาจะปกด.ส่วนทีถูกแปลรหัสเป็นโปรตีน เรียกว่า Exon และส่วนทีไม่ถูกแปลรหัสเป็นโปรตีน เรียกว่า intron โดยกระบวนการ splicing จะตัด intron ออก แล้วนํา exon มาเชือมต่อกัน จะได้ Mature mRNAเพิมเติม RNA polymerase I สร้าง rRNARNA polymerase II สร้าง mRNA ถูกยับยังโดย alpha-amanitin พบในเห็ด amanita ทําให้เกิด liver failure ได้RNA polymerase III สร้าง tRNA
  7. 7. การสังเคราะห์โปรตีน (Protein translation)- เกิดใน cytoplasm โดย ribosome จะแปลรหัสลําดับเบสบน mRNAจาก 5’ ไป 3’ แล้วสังเคราะห์โปรตีนจาก N-terminal ไป C-terminal- โดยจะอ่านรหัสบน mRNA ทีละ 3 รหัส เรียกว่า codonStart codon AUG (Met)Stop codon UAA UAG UGA** ทุก codon จะให้กรดอะมิโนได้หมด ยกเว้น stop codon** ควรรู้... tryptophan (UGG) และ methionine (AUG)- tRNA จะจับกับ codon โดยมีเบสตรงข้ามกับ codon เรียกanticodon เป็นตัวกระตุ้นและนําพากรดอะมิโนชนิดต่างๆ- มี ribosome เป็นตัวทําหน้าทีสร้าง peptide bond และรองรับmRNA และ tRNAกระบวนการสังเคราะห์โปรตีน มี 3 ขันตอน1. Initiation - initiation factors นํา 30s ribosome มาจับกับ mRNA บริเวณ Shine-Dalgarno sequence- start codon (AUG) จะอยู่ที P-site ของไรโบโซม และมี fMet-tRNA มาเกาะที start codon โดยนํา Methionineติดไม้ติดมือมาด้วย- 50s ribosome มาจับกับ 30s ribosome& fMet-RNA กลายเป็น 70s initiation complex2. Elongation – จะมี tRNA ตัวทีสองเข้ามาที A-site ของไรโบโซม แล้วมีการสร้าง peptide bond เชือมระหว่างกรดอะมิโนที P-site และ A-site โดย enzyme peptidyltransferase3. Termination – จะสินสุดเมือถึง stop codon (UAA UAG UGA)
  8. 8. The genetic codeรหัสพันธุกรรมใช้สือความหมายระหว่างลําดับเบสใน mRNA กับลําดับกรดอะมิโนในสารพอริเพปไทด์ โดยใช้รหัสสามชุดหรือ codon โดยพบว่ากรดอะมิโน 1 ตัวต้องใช้เบส 3 หน่วยทีเรียงติดกันเป็นตัวกําหนด มีรหัส 64 รหัสเป็นรหัสของกรดอะมิโน 20 ชนิด ดังนันกรดอะมิโน 1 ชนิดอาจมีรหัสมากกว่า 1 รหัส โดยใน 64 รหัสเป็น start codon 1 รหัสคือ AUG ซึงเป็นรหัสของกรดอะมิโน Met มีรหัสหยุด 3 รหัสคือ UAA, UAG และ UGA ซึงไม่ได้เป็นรหัสสําหรับกรดอะมิโนชนิดใดเลย โดยมีกรดอะมิโนชนิดทีมีรหัสเพียงรหัสเดียวคือ methionine กับ tryptophan ในกรณีทีกรดอะมิโนชนิดนันๆมีรหัสมากกว่า 1 รหัส จะสังเกตได้ว่า รหัสเหล่านีส่วนใหญ่มีความแตกต่างต่างกันทีเบสตัวที 3 ดังนันเบส 2 ตัวแรกของรหัสจะเป็นตัวบ่งบอกความจําเพาะว่าเป็นกรดอะมิโนชนิดใดเดิมเชือว่ารหัสพันธุกรรมเป็นรหัสสากล ไม่ว่าจะเป็น Eukaryote หรือ Prokaryote ก็จะสือความหมายถึงกรดอะมิโนชนิดเดียวกัน แต่ต่อมาพบว่ารหัสบางตัวในไมโตคอนเดรียสือความหมายต่างจากพันธุกรรมสากลStructure & Function of tRNAtRNA เป็น RNA ทีมีขนาดเล็กทีสุด ประกอบด้วย RNAเพียง 1 สาย แต่บางส่วนเป็นองค์ประกอบของกันและกันทําให้เกิดเป็นเกลียวคู่ขึนในบางส่วนของโมเลกุล และทําให้ส่วนทีเหลือเปิดเป็นวงขึน และมองดูคล้ายใบClover โดยวงทีเกิดขึนมี 4 วง ประกอบด้วย DHU loop, anticodon loop,extra or variable loop และpseudouridine looptRNA ทําหน้าทีเป็นตัวพากรดอะมิโนมายังไรโบโซมเพือประกอบกันเป็นสารพอลิเปปไทด์ได้อย่างถูกต้อง tRNAแต่ละชนิดจะมีความจําเพาะต่อชนิดของกรดอะมิโนคือสามารถรับและพากรดอะมิโนได้เพียงชนิดเดียวเท่านันStructure & Function of RibosomeRibosome เป็นออร์กาแนล ทีประกอบด้วย rRNA 65% และโปรตีนชนิดต่างๆ 35% โดยส่วนของโปรตีนทําหน้าทีเกียวกับโครงสร้างและเป็นเอนไซม์ได้ ไรโบโซมของโปรคาริโอตและยูคาริโอตมีขนาดไม่เท่ากัน โดยribosomeของยูคาริโอตมีค่าสัมประสิทธิการตกตะกอนเท่ากับ 80S ประกอบด้วยหน่วยย่อย 40S และ 60S ส่วนไรโบโซมของโปรคาริโอตมีค่าสัมประสิทธิการตกตะกอนเท่ากับ 70S ประกอบด้วยหน่วยย่อย 30S และ 50S พบไรโบโซมอยู่ทังไซโทซอล ไมโทคอนเดรีย และในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม โดยเชือว่าไรโบโซมทีอยู่ทีเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม โดยเชือว่าไรโบโซมทีอยู่ทีเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมนีเป็นแหล่งผลิตโปรตีนเพือส่งออกไปใช้ทีอืนภายนอกเซลล์ ส่วนพวกทีอยู่ในไซโมซอลนัน ทําหน้าทีผลิตโปรตีนทีใช้ภายในเซลล์เอง
  9. 9. การทํางานของไรโบโซมในการแสดงออกของยีนไปสู่การสร้างโปรตีนเรียกทรานสเลชัน ไรโบโซมยังทําหน้าทีในการต่อกรดอะมิโนเดียวให้เป็นโพลีเปบไทด์ โดยต้องมีการจับกับ mRNA และอ่านข้อมูลจาก mRNA เพือกําหนดลําดับของกรดอะมิโนให้ถูกต้อง การนําโมเลกุลของกรดอะมิโนเข้ามาเป็นการทํางานของ tRNA ซึงจับอยู่กับโมเลกุลของกรดอะมิโนอยู่ก่อนแล้ว
  10. 10. Translation mRNA>>>Protein- mRNA- tRNA + amino acid (aminoacyl-tRNA)- rRNA + ribosome- Factor, Elongation factors (Tu,Ts ) , Initiation factors (IF I, IF II, IF III )ProcessingIF-3 + 30S ไปจับ Shine-Dalgano sequence AUG อยู่ตรง P siteใน Euc. ไม่มี fMet นํา fMet-tRNA มาที P site30S initiation complex70S initiation complexTu-GTP พา Aa-tRNA ไปจับที A siteสลาย GTPTu หลุดออกจากไรโบโซมTu + TsTu + Ts Tu-GTP + Tsสร้างพันธะ peptideTranslation *ribosome เลือน A site ว่าง เลือนไปถึง Stop codonRF I หรือ RF II + RF III-GTP จับกับ stop codonสาย Polypeptide หลุดออกจาก tRNA ที P site Polypeptide เป็นอิสระRF, +RNA, mRNA แยกตัวจาก ribosome30S กับ 50S แยกกัน+ 50Sระยะเริมต้นEukaryote ใช้Factor 9 ตัวระยะเริมยาวการสังเคราะห์ Aa-tRNAAmino acid + Enzyme + ATPEnzyme-(Aminoacyl – AMP) + PPi + tRNAAminoacyl-tRNA + AMP + EnzymeEnzyme = aminoacyl-tRNA synthetaseRF-1 + UAA, UAGRF-2 + UAA, UGARF-3 + GTPระยะสุดท้ายสรุป ใช้1ATP+2GTP / 1AaAMP2Pi
  11. 11. Regulation of translationProkaryote1. การควบคุมโปรตีนทีสังเคราะห์จาก Polycistronic mRNAในโปรคาริโอต mRNA 1 สาย สามารถสังเคราะห์ออกมาได้โปรตีนหลายชนิด และการสังเคราะห์ก็อาจเกิดขึนพร้อมกันหลายชุด ซึงทําให้โปรตีนแต่ละชนิดมีปริมาณเท่ากัน แต่ในความเป็นจริงกลับพบแตกต่างกันมาก โดยmRNA ของโปรตีนทีอยู่ในลําดับต้นๆจะถูกแปลเป็นโปรตีนมากกว่าทีอยู่ส่วนปลาย โดยขึนอยู่กับแรงยึดเหนียวระหว่างไรโบโซม mRNA และระยะห่างระหว่างรหัสหยุดของ mRNA รหัสแรก กับรหัสเริมของ mRNAรหัสถัดไปพบว่า ไรโบโซมส่วนใหญ่มักหลุดออกจากสาย mRNA เมือถึงรหัสหยุดของโปรตีนตัวแรก2. การควบคุมการสังเคราะห์โปรตีนแบบ Transitional grameshiftในการสังเคราะห์โปรตีนบางชนิด mRNA ของโปรตีนนันมีรหัสหยุดอยู่ในสายการสร้าง ถ้าในเซลล์มีโปรตีนชนิดนันมากก็จะหยุดการสังเคราะห์ทีรหัสหยุดนัน ทําให้โปรตีนทีสร้างออกมาไม่สมบูรณ์ แต่ถ้าโปรตีนนันขาดแคลนจะเกิดการอ่านข้ามเบสไป 1 ตําแหน่ง ทําให้การแปลรหัสในตําแหน่งถัดไปเคลือนไปจากเดิม เรียกว่าเกิด transitionalfreameshift พบมากใน retrovirus3. การควบคุมการสังเคราะห์โปรตีนโดย Transitional repressorเป็นการควบคุมการสังเคราะห์โปรตีน โดยโปรตีนตัวทีผลิตเป็นการควบคุมโดยการยับยังแบบย้อนกลับ โดยเกิดขึนกับ ribosomal protein โปรตีน Elongation factor EF-G และ EF-Tu เป็นต้น4. การควบคุมการสังเคราะห์โปรตีนโดย Antisense RNAAntisense RNA เป็นสายRNA สันๆทีสามารถจับจําเพาะกับ mRNA ทีปลาย 5’ ทําให้ขัดขวางการสังเคราะห์โปรตีนชนิดนัน เช่น ควบคุมการสังเคราะห์โปรตีน CAP ใน lac operon
  12. 12. Eukaryote1. การควบคุมอายุเฉลียและความเสถียรของ mRNAอายุเฉลียของ mRNA เป็นปัจจัยหนึงในการควบคุมปริมาณและอัตราเร็วในการผลิตโปนตีน ตัวอย่างเช่น การสร้างโปรตีนเส้นไหมของตัวไหม โดยจะสร้าง mRNA ของเส้นไหมให้มีอายุเฉลียยาวกว่าปกติ ช่วยลดเวลาในการสังเคราะห์เส้นไหม หรือการสังเคราะห์โปรตีนเคซีน (Casine) ในหญิงให้นมบุตร โดยฮอร์โมนโพรแลกติน จะช่วยให้ mRNA ของเคซีนมีความเสถียรมากขึน2. การควบคุมการแปลรหัสโดยการสังเคราะห์เป็นพอลิโปรตีนในยูคาริโอตจะมีการสังเคราะห์โปรตีนสายยาวทีเรียกว่า Polyprotein เป็นโปรตีนเริมต้น จากนันจึงมีกระบวนการตัดสายโปรตีนนีอย่างจําเพาะ ทําให้ได้โปรตีนหลายๆชนิด การผลิตโปรตีนโดยวิธีนี เป็นการควบคุมให้โปรตีนผลผลิตทีเกิดจากการตัดสายเริมต้นนีมีปริมาณเท่ากัน หรือใกล้เคียงกัน3. การควบคุมอัตรารวมของกระบวนการแปลรหัสเป็นกลไกควบคุมการผลิตโปรตีนโดยใช้สารทีจะมารวมตัวกันเป็นตัวควบคุม เช่น การสังเคราะห์โปรตีนโกลบินโดยจะมีฮีมเป็นตัวควบคุมการสังเคราะห์ ถ้ามีฮีมในเซลล์มาก ฮีมจะยับยังกระบวนการสังเคราะห์ฮีม และกระตุ้นให้มีการสังเคราะห์โปรตีนโปรตีนโกลบินเพิมขึน เป็นต้น4. การระงับการทํางานของ mRNA โดย RNA interferenceRNA interference เป็นกระบวนการทีชิน RNA ขนาดเล็กไปจับกับปลาย 3’ UTR ของ mRNA และยับยังการสังเคราะห์โปรตีน หรือทําให้เกิดการทําลายสายmRNAPost – translational Modification- จัดรูปร่าง- Inactive active- เติม Saccharides- เติม Substitute groups ex acetyl, phosphate, methyl, carboxyl- หลังและถูกกระตุ้นให้ทํางาน- สร้าง disulfide cross-links
  13. 13. การเติมโมเลกุลของคาร์โบไฮเดรต (glycosylationไกลโคโปรตีน (glycoprotein) เกิดจากการเติมสายคาร์โบไฮเดรตลงบนโมเลกุลของโปรตีน กรดอะมิโนในโปรตีนทีเป็นตัวเชือมต่อกับสายคาร์โบไฮเดรต ได้แก่ แอสพาราจีนสายคาร์โบไฮเดรตนีต้องอาศัยการทํางานของกลุ่มเอนไซม์ใหญ่ของคาร์โบไฮเดรตทีถูกนํามาเติม ได้แก่ แมนโนส(xylose) N-acetylglucosamine (NAcGlc) และ N-acetylneuraminic acid (Nglycosylation)เกิดจากการเติมสายคาร์โบไฮเดรตลงบนโมเลกุลของโปรตีน กรดอะมิโนในโปรตีนทีเป็นตัวเชือมต่อกับสายคาร์โบไฮเดรต ได้แก่ แอสพาราจีน (asparagine) เซอรีน (serine) และทรีโอนีน (threonineาศัยการทํางานของกลุ่มเอนไซม์ glycosyltransferase ซึงพบอยู่ในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม ส่วนใหญ่ของคาร์โบไฮเดรตทีถูกนํามาเติม ได้แก่ แมนโนส (mannose) กลูโคส (glucose) กาแลกโทส (galactoseacetylneuraminic acid (NAN) หรือ กรดเซียริก (sialic acid) เป็นต้นเกิดจากการเติมสายคาร์โบไฮเดรตลงบนโมเลกุลของโปรตีน กรดอะมิโนในโปรตีนthreonine) การเติมซึงพบอยู่ในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม ส่วนgalactose) ไซโลส
  14. 14. การเติมหมู่ฟอสเฟต (phosphorylation)ปฏิกิริยาการเติมหมู่ฟอสเฟตให้กับกรดอะมิโนบางตัวในสายพอลิเพปไทด์โดยเอนไซม์ protein kinase เป็นกระบวนการหนึงทีเซลล์ใช้ควบคุมหรือกําหนดการทํางานของโปรตีน กรดอะมิโนมักจะถูกเติมหมู่ฟอสเฟต ได้แก่ เซอรีน (serine) ทรีโอนิน (threonine) และไทโรซีน (tyrosine)Ex InsulinTranslation folding, oxidation, Signal peptide cleavage vesicle packaging ตัด C-ChainRibosome- Cytosol >>> โปรตีนทีใช้ในเซลล์- ER ER Lumen >> exocytosisER membrane >> Protein membraneInhibition protein synthesis- Puromycin : ไปจับกับ A site คล้าย A-tRNA- Tetracycline : จับกับ 30S ป้องกันไม่ให้ tRNA ไปเกาะ A site- Erythromycin : จับกับ 50S >>> translocation (เคลือนที) ไม่ได้- Chloramphenicol: สร้าง Peptide-bond ไม่ได้ใน bacteria mitochondria chloroplastblock peptidyl translation- Cycloheximide: Block peptidyl transfer of 50S- Streptomycin: ไม่ให้ fMet-tRMA จับ 30S และทําให้อ่านผิดด้วย- Diptheria toxin: ยับยัง IF II ใน Eukaryote- Ricin: จาก caster benan : ทําให้ 60s ไม่ทํางานสร้าง disulfideMature insulin
  15. 15. Protein degradationprotein degradetion เป็นกระบวนการย่อยสลายโปรตีนภายในเซลล์ อาจเป็นโปรตีนจากกระบวนการหรือโปรตีนทีไม่ได้ช้งานภายในเซลล์ แบ่งออกเป็นorganelle และCytosolic อาศัยproteasomes, multienzyme complexes--เป็นกระบวนการย่อยสลายโปรตีนภายในเซลล์ อาจเป็นโปรตีนจากกระบวนการหรือโปรตีนทีไม่ได้ช้งานภายในเซลล์ แบ่งออกเป็น 2 วิธี คือ LYSOSOMAL อาศัยเอมไซม์ Proteasesproteasomes, multienzyme complexes ใน cytoplasmเป็นกระบวนการย่อยสลายโปรตีนภายในเซลล์ อาจเป็นโปรตีนจากกระบวนการendocytosisProteasesใน acidic
  16. 16. การหาลําดับนิวคลีโอไทด์ (DNA sequencing)หรือการหาลําดับเบสของ DNA ซึงประกอบด้วย A G C T อาศัยปฏิกิริยาและเทคนิคต่างๆมากมาย ซึงเมือเราทราบลําดับเบสของ DNA ในสิงมีชีวิตต่างๆ จะทําให้เราเข้าใจพันธุกรรมของสิงมีชีวิตนันๆ และสามารถนําความรู้หรือลําดับเบสทีได้มาใช้หลายๆสาขา เช่น วินิจฉัยโรค,เทคโนโลยีชีวภาพ และนิติเวชศาสตร์ เป็นต้นปัจจุบันหลักการทีใช้ในการทํา DNA Sequencing ประยุกต์มาจากขันตอนวิธีของ Frederick Sanger นักวิทยาศาสตร์ชาวอังกฤษ จาก มหาวิทยาลัยแคมบริดจ์ โดยมีหลักการดังนี1. DNA Sequencing Reaction คล้ายกับการเริมต้นปฏิกิริยา PCR เพือเพิมจํานวน DNA โดยให้ความร้อนเพือให้DNA แยกเป็นสายเดียว จากนัน Primer ไปเกาะเพือเกิด elongation ของ DNA ต่อไปโดยใน substrate จะประกอบด้วย(1) DNA Template – ซึงเป็นสายคู่(2) free nucleotides – dATP,dGTP,dCTP,dTTP(3) DNA Primer ขนาดสันๆ(4) enzyme Taq polymerase เพือเร่งปฏิกิริยา polymerization(5) dideoxynucleotides(ddNTs) คือ NTs ทีไม่มีหมู่Hydroxyl ทีตําแหน่ง 3’ (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)เป็นส่วนสําคัญในปฏิกิริยาเพราะทําให้เกิด Chain termination2. ทุกๆ cycle ในการทําปฏิกิริยาเมือมี ddNTs ใน substrate จะมีโอกาสที ddNTsเข้าไปทําปฏิกิริยา elongation แต่จะทําให้ Taq polymerase หยุดทําปฏิกิริยาทันทีและสินสุดด้วย ddNTs นัน เรียกว่าวิธีการนีว่า Chain TerminationMethods3. เราจะพบว่า ddNTs ทีเข้าไปทําให้เกิด Chain Termination ได้ในทุกๆจํานวนเบสของ DNA Template นัน ทําให้ขนาดของชินส่วนหลังปฏิกิริยามีหลากหลายตามจํานวนเบสของ ชินส่วนนันๆ โดยตรวจสอบจากการทําGel Electrophoresis พบว่าชินส่วนทีอยู่ไกลสุดจากจุดเริมจะมีจํานวนเบสน้อยสุด และตรงกันข้าม (ในแต่ละ lane จะมี ddNTs เป็น terminator ต่างกัน)
  17. 17. 4.โดยElectrophoresisได้โดยใช้การอ่านเอง หรือใช้เครือง5.(Termination Methodใส่ไฟฟ้า จากนันจึงใช้เลเซอร์อ่านจากล่างขึนบนออกมาเป็นลําดับนิวคลีโอไทด์ซึงสามารถทําได้ทีละหลายๆ ตัวอย่างหากจะหาลําดับเบสของจีโนมมนุษย์ซึงมีมากกว่าและทรัพยากรมาก ซึงก็มีคนทําอยู่สองกลุ่มในการค้นหาลําดับเบสบนโครโมโซม1. Human Genome Project เกิดจากความร่วมมือระหว่างรัฐบาลสหรัฐและหBAC(Bacterial Artificial Chromosome)ประมาณ 300kb แล้วใช้เทคนิค Chain terminationผลออกมาเป็นลําดับเบสของ DNA ทังหมด2. Celera Genomics (Craig Ventor)เป็นบริษัททุนเอกชนทีหาลําดับเบสของมนุษย์ได้สําเร็จเป็นรายแรก โดยใช้เทคนิค Shotgun sequencing โดยนํา10kb แล้วหาลําดับเบสของแต่ละท่อน จากนันนําท่อนทีกระจัดกระจายมาต่อกันโดยใช้คอมพิวเตอร์คํานวณและให้ผลลัพธ์ออกมาเหมือน DNA ต้นแบบ ซึงทําได้ไวกว่าวิธีการข้างต้น4. เราสามารถทําปฏิกิริยาเพือให้เกิดพร้อมๆกัน โดย ใส่ ddNTsโดยติดฉลากเรืองแสงให้ต่างกัน เมือนํามาแยกขนาดโดย GelElectrophoresis แล้วเราจะอ่าน ลําดับนิวคลีโอไทด์ ได้จากล่างขึนบได้โดยใช้การอ่านเอง หรือใช้เครือง Automated DNA sequencer5. ในแลบขนาดใหญ่จะไม่ใช้ Gel แต่จะใช้วิธี Capillary electrophoresis(Dye-terminator sequencing) แทน โดยนําตัวอย่างมาทํา ChainTermination Method ดังกล่าวแล้วนําไปใส่หลอดขนาดเล็กแล้วแยกขนาดด้วยจากล่างขึนบนออกมาเป็นลําดับนิวคลีโอไทด์ตัวอย่างในเวลาเดียวกันลําดับเบสของจีโนมมนุษย์ซึงมีมากกว่า 3,000 ล้านเบส ซับซ้อนกว่าตัวอย่างทัวๆไป จึงคนทําอยู่สองกลุ่มในการค้นหาลําดับเบสบนโครโมโซม 23 คู่ ของคนเราดังนีเกิดจากความร่วมมือระหว่างรัฐบาลสหรัฐและหลายประเทศ โดยสร้างBAC(Bacterial Artificial Chromosome) หลายๆอัน ซึงเป็น vector เก็บ genomic DNA มนุษย์อยู่ ความยาChain termination หาลําดับเบส แล้วจึงหาส่วนทีทับซ้อนระหว่างชินทังหมดเป็นบริษัททุนเอกชนทีหาลําดับเบสของมนุษย์ได้สําเร็จเป็นรายแรก โดยใช้โดยนํา genomic DNA ของมนุษย์มาตัดโดยเอนไซม์โดยสุ่ม ให้มีขนาดเหลือแล้วหาลําดับเบสของแต่ละท่อน จากนันนําท่อนทีกระจัดกระจายมาต่อกันโดยใช้คอมพิวเตอร์คํานวณและต้นแบบ ซึงทําได้ไวกว่าวิธีการข้างต้นShotgun sequencingddNTs ทัง 4 ชนิดGelล่างขึนบน ซึงทําAutomated DNA sequencerelectrophoresisChainล้านเบส ซับซ้อนกว่าตัวอย่างทัวๆไป จึงต้องใช้ทุนของคนเราดังนีลายประเทศ โดยสร้าง Library เก็บมนุษย์อยู่ ความยาวหาลําดับเบส แล้วจึงหาส่วนทีทับซ้อนระหว่างชิน เพือแปลเป็นบริษัททุนเอกชนทีหาลําดับเบสของมนุษย์ได้สําเร็จเป็นรายแรก โดยใช้ให้มีขนาดเหลือ 2-แล้วหาลําดับเบสของแต่ละท่อน จากนันนําท่อนทีกระจัดกระจายมาต่อกันโดยใช้คอมพิวเตอร์คํานวณและ
  18. 18. ไวรัสของแบคทีเรีย (Bacteriophage)ไวรัสของแบคทีเรียหรือ phage เป็นไวรัสทีใช้เซลล์แบคทีเรียเป็นโฮสต์ ในการเจริญเพิมจํานวน การศึกษาเกียวกับ phage ทําให้ค้นพบเกียวกับโปรตีนและพบว่ากรดนิวคลีอิคเป็นสารพันธุกรรม (Hershey and Chase experiment)และมีการนํา phage มาใช้กันมากในการถ่ายทอดยีนโดยวิธี transductionรูปร่างและโครงสร้างของ phage1. Phage ทีมีส่วนหัวและส่วนหางส่วนหัว (head) มีรูปร่าง icosahedral เป็นโปรตีนทีหุ้มรอบจีโนมไว้ภายในส่วนหาง (tail) มีลักษณะเป็นท่อกลวงยาว (hollow tube) หุ้มด้วยเปลือก(sheath) ทีอาจยืดหดได้ และบางชนิดมีส่วนประกอบอืนด้วยคือ baseplate, fiber และ pin หรือ spike ความยาวของส่วนหางขึนอยู่กับชนิดของphage2. Phage ทีมีรูปร่างเป็นสายยาว (filamentous phage) มีการเรียงตัวของcapsidเป็นรูปบันไดวน (helical)ชนิดของ phage เมือแบ่งตามลักษณะการติดเชือในแบคทีเรีย1. Virulent phageคือพวกทีมีการติดเชือได้แบบเดียวคือแบบทีทําให้เซลล์แบคทีเรียแตกตาย ซึงเรียกว่า lytic infection หรือ productiveinfection อาจเรียก phage พวกนีว่า lytic phage, vegetative phage, virulent phage ก็ได้ วงชีวิตแบบนีเรียกว่า lyticcycle ตัวอย่างของ phage แบบนีเช่น T4 phage2. Temperate phagetemperate phage หมายถึง phage มีการติดเชือได้2 ลักษณะคือ1. lytic cycle แล้วทําให้แบคทีเรียแตกสลาย2. prophage cycle หรือ lysogenic infection ซึงไม่ทําให้เซลล์แบคทีเรียแตกสลายแต่จีโนมของ phage จะเข้าไปแทรกอยู่ใน DNA ของแบคทีเรีย เรียกว่าเป็นกระบวนการ lysogenizationวงชีวิตของ Bacteriophage มี 2 ลักษณะ1.Lytic pathway (Lytic-แตก)เป็นวงจรชีวิตของ Phage ทีเมือสารพันธุกรรมจาก phage ทีเข้าไปในแบคทีเรียแล้วจะจัดตัวเองให้อยู่ในรูปคล้าย plasmid แล้วดําเนินการเพิมจํานวนสารพันธุกรรม และสร้างโปรตีนต่าง ๆ ทีจาเป็นต่อการประกอบเป็นเซลล์ใหม่ เมือสร้างสารต่าง ๆ และประกอบตัวเป็นอนุภาคไวรัสทีสมบูรณ์แล้วจะปล่อย Lysozyme ย่อยเซลล์เจ้าบ้านเพือปลดปล่อยลูกหลานไวรัสออกมา2. Lysogenic หรือ Prophage pathway (Lyso-ซ่อนแฝง)เป็นวงชีวิตทีเพิมจํานวนสารพันธุกรรมของ Phage ผ่านการแบ่งตัวของแบคทีเรีย เพราะเมือPhage ส่งสารพันธุกรรมเข้าไปในแบคทีเรียแล้ว สารพันธุกรรมจะปรับให้สามารถเข้าไปแทรกอยู่ในโครโมโซมของแบคทีเรีย(อาศัยเอนไซม์ integrase) ซึงในระหว่างนัน
  19. 19. สารพันธุกรรมของ Phage จะไม่กําหนดการสร้างอะไรแต่จะฝังตัวนิงๆ อยู่ในโครโมโซมของแบคทีเรีย เพิมจํานวนไปพร้อม ๆ กับการเพิมจํานวนของแบคทีเรีย จนเมือถึง สภาวะทีเหมาะสมจึงหลุดออกจากโครโมโซมของแบคทีเรีย และจัดรูปแบบตัวเองเป็น plasmid ซึงทํา ให้กลับไปดํารงชีวิตในวงจร Lytic pathway ต่อไปกระบวนการในการเกิด lysogenizationเกิดจากจีโนมของ phage มีส่วนทีเรียกว่า repressor gene ซึงเมือเข้าไปในเซลล์แบคทีเรียจะทําให้มีการสร้างตัวยับยังเรียกว่า repressor protein ขึนเป็นจํานวนมาก ไปเกาะกับจีโนมของแบคทีเรีย ทําให้มีผลยับยังการทํางานของเอ็นไซม์ RNA polymerase ของแบคทีเรีย ทําให้ไม่เกิดการเข้าสู่ lytic cycle ถ้าตัวยับยังถูกทําลายลงเช่นถูกรังสี ultraviolet, X-ray สารเคมีหรือความร้อน prophage จะกลายเป็น virulent phage ทันทีbact ทีมี prophage(viral genome) แฝงอยู่จะเรียกว่า lysogen หรือ lysogenic bacteria และอยู่ในภาวะ lysogeniclysogenic bacteria นีมีความต้านทานหรือ immunity ต่อการติดเชือซําด้วย phage ทีทําให้เกิด lysogenization นันๆการเพิมจํานวนของ Phage1. การเกาะติด (Adsorption)phage จะใช้ส่วนผิวของมันในการเกาะกับ receptor บนผิวของเซลล์แบคทีเรีย- phage ทีมีหัวและหาง จะใช้ส่วนหาง (plate, fiber และ pin) เกาะกับผิวแบคทีเรีย- phage ทีมีรูปร่างเป็นท่อนยาว จะใช้ส่วนปลายทังสองข้างในการเกาะกับ sex piliของแบคทีเรีย- phage บางชนิดเกาะกับ flagella ของแบคทีเรียก่อนทีมันจะเลือนตัวเองลงมาเกาะกับผิวเซลล์โดยอาศัยการเคลือนไหวของ flagella receptor บนเซลล์แบคทีเรียอาจเป็น ผนังเซลล์ แคฟซูล(Vi antigen)หรือ sex pili ก็ได้แล้วแต่ชนิดของ phage ในขันตอนการเกาะติดของ phage มีความจําเพาะสูงมาก ถ้าแบคทีเรียมีการผ่าเหล่า เปลียนแปลงโครงสร้างของ receptor ไป phage จะไม่สามารถเกาะติดได้2. การเข้าสู่เซลล์ (Penetration)- phage ทีมีหางและ sheath จะหด sheath แทงท่อ (tube) ผ่านผนังเซลล์ แล้วฉีดจีโนมผ่านท่อเข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย ในกรณีทีมี phage จํานวนมาก อาจทําให้เกิดรูพรุนบนผนังเซลล์แบคทีเรีย และเซลล์แตกตายก่อนทีไวรัสจะเพิมจํานวน เรียกว่า “lysis from without”- พวก phage ทีมีรูปร่างเป็นสายยาวจะผ่านผนังเซลล์เข้าไปทังอนุภาค และฉีดจีโนมเข้าไปในไซโตพลาสซึมของแบคทีเรียและทิงCapsidไว้ที cell membrane เป็นส่วนใหญ่virulent phage จะเข้าสู่ขันตอนการเพิมจํานวนทันทีทีฉีด DNA เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย โดย Phage จะห้ามการสร้างโปรตีนทีเป็นของเซลล์ และจะย่อยทําลาย DNA ของแบคทีเรียเพือใช้เป็นสารตังต้นของการสร้างจีโนมของไวรัส3. การ transcription,translation และ การสังเคราะห์จีโนมของไวรัส (genome replication)มีขันตอนแตกต่างกันไปตามแต่ชนิดจีโนมของ phage ว่าเป็น DNA หรือ RNA และเป็นสายคู่หรือสายเดียว4. การประกอบตัว (assembly)เมือสร้างส่วนประกอบคือ จีโนมและโปรตีนต่างๆเช่น Capsid และหางแล้ว ก็จะมารวมตัวกันเป็น Phage ทีสมบูรณ์การรวมตัวนีเกิดขึนเองโดยอัตโนมัติ เป็นขันตอน phage ทีมีหัวและหางจะเริมประกอบส่วนหัวและส่วนหางแยกกันและบรรจุจีโนมเข้าไปในส่วนหัวแล้วส่วนหางจึงมาประกอบเข้าไป ส่วน phage ทีเป็นสายยาว จีโนมและCapsid จะประกอบตัวกันในขันตอนเดียว
  20. 20. 5. การออกจากเซลล์ (Release)Phage ส่วนมากจะใช้เอ็นไซม์ lysozyme หรือเอ็นซัยม์ holin ในการย่อยผนังเซลล์แบคทีเรีย ทําให้เซลล์ lysis และปล่อย phage ออกจากเซลล์ Temperate phage นอกจากจะมี lytic cycle ได้แล้วยังจะเข้าสู่ขบวนการ lysogenizationคือการทีจีโนม Phage เข้าไปแทรกตัวแฝงอยู่ในโครโมโซมของแบคทีเรียในรูป prophage ได้โดยไม่ทําให้เซลล์แบคทีเรียแตกสลาย และ prophage จะแบ่งตัวเพิมจํานวนไปพร้อมกับแบคทีเรียTransductionเป็นกระบวนการถ่ายทอดสารพันธุกรรมของแบคทีเรียโดยไวรัส เกิดขึนโดยมีการรวมชินส่วน DNA ของแบคทีเรียเจ้าบ้านเข้าไปในไวรัส เมือไวรัส infect แบคทีเรียข้างเคียง ทาให้แบคทีเรียทีสองนีมีชินส่วน DNA ของแบคทีเรียแรกเข้าไป1. Generalized transductionเกิดในระหว่าง lytic cycle ในวงจรชีวิตไวรัส ชินส่วนของ DNA แบคทีเรียได้เข้าไปอยู่ในอนุภาคไวรัสระหว่างการประกอบอนุภาคไวรัสใหม่ เมืออนุภาคไวรัสตัวนี infect แบคทีเรียตัวใหม่ ซึงไม่ทําให้เกิด lytic cycle ตัว DNA ทีเข้าไปนีอาจจะรวมเข้าเป็นส่วนหนึงของจีโนมของแบคทีเรียหรือไม่ก็ได้2. Specialized transductionเกิดเนืองจากความผิดพลาดใน lysogenic cycle ในวงจรชีวิตของไวรัส เมือprophage ถูกกระตุ้นให้เข้าสู่ lytic cycle โดยแยกตัวออกจากจีโนมของแบคทีเรีย แต่การแยกตัวนันไม่ถูกต้อง โดยมีการนําชินส่วนของจีโนมแบคทีเรียออกมาด้วย เมือเข้าเข้าสู่ lytic cycle อนุภาคไวรัสใหม่ก็จะมี DNAของแบคทีเรีย เมือไวรัส infect แบคทีเรียข้างเคียงก็จะทําให้แบคทีเรียได้รับDNA ใหม่เข้าไปการนําไปใช้ในงานพันธุวิศวกรรม1. ใช้ phage เป็น vector ในการนํายีนเข้าสู่เซลล์แบคทีเรียในการทํา DNA cloning เช่นทําโดยวิธี transduction โดยการนํา DNA สายผสมใส่เข้าในหัวของ phage ก่อน เรียกว่าin vitro packaging แล้วนําอนุภาคไวรัสนีไปติดเชือแบคทีเรียต่อไปlambda phage สามารถใช้เป็น vector นํายีนขนาด 15 kb ถ้าต้องการนํายีนขนาดใหญ่กว่าต้องใช้ cosmidเป็นยีนพาหะโดย cosmid มีลักษณะคล้าย plasmid สร้างจากการนํา DNA ของ phage lambda ส่วนปลายทีเรียกว่าcos (มาจาก cohesive end) ทีอยู่ทีปลายทังสองข้างมาต่อกับ DNA plasmid ของแบคทีเรียส่วน Ori (origin ofreplication) พร้อมทังมีส่วนทีควบคุมการดือยาและส่วนทีจะถูกตัดด้วย restriction endonuclease อยู่ด้วยcosmid สามารถนํามาใส่ในหัวของ phage lambda ได้ และสามารถนํายีนขนาด 35-45 kb ซึงใหญ่กว่ายีนที plasmidจะนําได้ (ขนาด 100-5,000 เบส) ในขณะทีปกติ transducing phage จะนํายีนขนาด 5-20 kb เท่านัน2. การนําไปใช้ทํา phage typingใช้ในการจําแนกสายพันธุ์ของแบคทีเรียโดยอาศัยความจําเพาะของชุด (panel) ของ phage กับแบคทีเรียใช้สืบสวนหาต้นตอการระบาดของโรค3. การ transductionขบวนการทีใช้ phage พายีนของแบคทีเรียผู้ให้ ไปยังแบคทีเรียผู้รับ Phage ทีทาให้เกิด transduction ได้เรียกว่า transducing phage
  21. 21. 4. การเกิด phage conversionเป็นขบวนการที lysogenic phage ทําให้แบคทีเรียมีคุณสมบัติแตกต่างไปจากเดิมทําให้ somatic antigenของ Salmonella เปลียนแปลงทําให้เกิดการสร้าง diptheria toxin, botulinum toxin, erythrogenic toxin โดยการทีlysogenic phage นํายีนสาหรับสร้าง toxin เข้าสู่แบคทีเรียGENE CLONINGเรียกอีกอย่าง พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) , เทคโนโลยีดีเอ็นเอสายผสม (Recombinant DNA Technology)พันธุวิศวกรรม หมายถึง กระบวนการเปลียนแปลงหรือดัดแปลงสารพันธุกรรมของสิงมีชีวิต โดยการถ่ายทอดยีนทีต้องการจากสิงมีชีวิตหนึง เข้าสู่อีกสิงมีชีวิตหนึง เพือสร้างสิงมีชีวิตชนิดใหม่ทีมี ลักษณะตามต้องการการตัดต่อดีเอ็นเอทีมาจากหลายต้นตอในหลอดทดลอง โดยอาศัยเอนไซม์ตัดจําเพาะ แล้ว เชือมต่อชินดีเอ็นเอเข้าไปในพาหะ ทําให้ได้ดีเอ็นเอโมเลกุลใหม่ทีใส่เข้าไปกับดีเอ็นเอพาหะ เรียกว่า ดีเอ็นเอสายผสม (Recombinant DNA )ขันตอนการทําพันธุวิศวกรรมอาจเรียกว่า gene cloning คือ การเพิมปริมาณกลุ่มของเซลล์ทีมีลักษณะทาง พันธุกรรมเหมือนกันซึงมียีนทีต้องการอยู่ในเซลล์ให้ได้จํานวนยีนและจํานวนเซลล์ในปริมาณมากพอทีจะนําไปใช้ ประโยชน์ต่อไปขันตอนการทํา Gene cloning1. การเตรียมชินส่วนของ DNA ทีต้องการ (Preparing DNA)2. การใช้เอนไซม์ตัดจําเพาะในการโคลนยีน (Restriction enzyme for gene cloning)3. การเลือกใช้พาหะหรือเวคเตอร์ (Vector)4. การถ่ายไฮบริดเวคเตอร์เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน เพือทํา Gene cloning (Transformation)5. การตรวจสอบ clone ทีต้องการ (Screening hybrid vector)6. การประยุกต์ใช้เทคนิคพันธุวิศวกรรม (Application)I. การเตรียมชินส่วนของ DNA ทีต้องการการเตรียมชินส่วนยีนหรือดีเอ็นเอทีน่าสนใจมีหลายวิธีดังนี1. การสกัดจากเซลล์หรือเนือเยือของสิงมีชีวิตทีต้องการศึกษา ซึงเป็นดีเอ็นเอทังหมดในจีโนมของสิงมีชีวิต ชนิดนันเรียกว่า genomic DNA2. การเตรียมดีเอ็นเอจาก mRNA– โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase– จะได้ดีเอ็นเอทีสังเคราะห์ขึนหรือลอกรหัสจาก mRNA เรียกว่า complementary DNA (cDNA)3. การสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยวิธีทางเคมี– สามารถสังเคราะห์ oligonucleotide ให้มีลําดับเบสทีต้องการโดยเครืองสังเคราะห์อัตโนมัติ– มี 2 วิธีทีใช้กันอย่างกว้างขวางคือ วิธี phosphate triester และวิธี phosphite triesterII. เอนไซม์ตัดจําเพาะในการโคลนยีนในการโคลนยีนต้องใช้เอมไซม์ตัดจําเพาะในการตัดสายดีเอ็นเอทีต้องการ จากนันนําไปเชือมต่อกับพาหะ (Vector) แล้วจึงพาหะถ่ายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (Host cell)
  22. 22. • เอนไซม์ตัดจําเพาะ(Restriction enzyme or restriction endonuclease)• แบบที 2 (type II) เป็นเอนไซม์ทีใช้กันมากในการตัดต่อยีน• ประกอบด้วยโพลีเพพไทด์เพียงชนิดเดียว• มีคุณสมบัติเป็นเอนไซม์ตัดจําเพาะเพียงอย่างเดียว ส่วนการเติมหมู่เมธิลอาศัยเอนไซม์อีกชนิดหนึง• การตัดดีเอ็นเอจะเกิดทีตําแหน่งจําเพาะในบริเวณจดจํา(recognition site)หรือจุดใกล้กับบริเวณจดจํา ทําให้ได้ชินขนาดดีเอ็นเอทีมีขนาดแน่นอนปัจจุบันเอนไซม์ตัดจําเพาะทีสกัดได้จากแบคทีเรียชนิดต่างๆ มีจํานวนมากว่า 400 ชนิด ซึงการเรียกชือใช้ระบบอักษรภาษาอังกฤษ 3 ตัว และพิมพ์ตัวเอน โดยอักษรตัวที1 คือ อักษรตัวแรกของชือ Genus ใช้เป็นตัวพิมพ์ใหญ่อักษรตัวที 2 และ 3 เป็นอักษร 2 ตัวแรกของชือ Species ใช้ตัวพิมพ์เล็ก ถ้ามีรหัสของสายพันธุ์ก็ให้ใส่หลังอักษร 3 ตัวแรก และสุดท้ายเป็นเลขโรมันซึงบอกถึงลําดับของเอนไซม์ทีสกัดได้จากแบคทีเรีย เช่นEcoRI สกัดมาจาก Escherichia coli RY13 แยกได้เป็นชนิดแรกHindIII สกัดมาจาก Haemophilus influenzae แยกได้เป็นชนิดที 3III. การเลือกใช้พาหะ (Vector) และการทํา Gene cloningVector คือ ดีเอ็นเอพาหะทีใช้ในการเพิมปริมาณชินดีเอ็นทีต้องการให้ได้ปริมาณมากๆ โดยนําชินดีเอ็นเอทีต้องการดังกล่าวมาเชือมต่อเข้าไปกับ DNA vector ได้ ดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA; rDNA)จากนันจึงนํา rDNA ถ่ายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (Host cell) โดยวิธีการ Transformation เพือเพิมปริมาณดีเอ็นเอทีต้องการ แล้วทําการคัดเลือกเซลล์ทีต้องการต่อไปปัจจุบันมีเวคเตอร์ต่างๆ มากมายทีใช้สาหรับ Gene cloning ซึงการเลือกใช้เวคเตอร์นันขึนอยู่กับวัตถุประสงค์ของการใช้งาน เช่นถ้าต้องการโคลนยีนในแบคทีเรีย อาจเลือกใช้เวคเตอร์ทีเป็น พลาสมิด (Plasmid) ฟาจ (Phage) และคอสมิด (Cosmid)คุณสมบัติของดีเอ็นเอพาหะ(vector) มีดังนี- มีส่วนของดีเอ็นเอทีเป็นจุดเริมในการจําลองตัว (origin of replication,Ori)- สามารถเพิมจํานวนตัวเองได้พร้อมๆกับดีเอ็นเอทีใส่เข้าไป- มียีนเครืองหมาย(marker gene) สาหรับใช้ในการคัดเลือก เช่น ยีนทีดือยาปฏิชีวนะ ยีนทีเกียวกับการสร้างหรือสลายกรดอะมิโนและนําตาลบางชนิด- มีบริเวณจดจําของเอนไซม์ชนิดใดชนิดหนึงหรือหลายชนิดเพียง ตําแหน่งเดียวในโมเลกุลของดีเอ็นเอพาหะ(unique or polylinker site)- ไม่อยู่ในบริเวณทีเป็น replicon- ควรอยู่ในยีนทีเป็น marker เช่น lac Z gene (b-galactosidase)- เมือนํา foreign DNA มาเชือมจะทําให้เกิดการทํางานของยีนดังกล่าวบกพร่อง เรียกว่า marker inactivation
  23. 23. IV. การเชือมชินดีเอ็นเอเข้ากับเวคเตอร์ หรือ Gene cloningGene cloning หมายถึง การนํายีนทีต้องการหรือยีนทีสนใจมาเพิมปริมาณให้ได้เพียงพอเพือใช้ในการศึกษา อาทิ การแสดงออกของยีน การผลิตโปรตีนหรือเอนไซม์ การถ่ายยีน การหาลําดับเบสของยีน เป็นต้น ซึงหลักการทํา Genecloning ก็คือ หลังจากได้ rDNA (recombinant DNA) แล้วก็นําไปถ่ายลงในเซลล์เจ้าบ้านเพือเพิมปริมาณ ซึง การทําrDNA นันสามารถทําได้หลายวิธี ดังนี1. การสร้าง DNA libraryคือ การนํา Genomic DNA ของสิงมีชีวิตมาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจําเพาะ แล้วนํามาเชือมต่อเข้ากับเวคเตอร์ซึงถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจําเพาะชนิดเดียวกัน จากนันจึงนําไปถ่ายในเซลล์เจ้าบ้านเพือขยายปริมาณชินดีเอ็นเอ แล้วเก็บเซลล์เจ้าบ้าน2. การเชือมต่อชินดีเอ็นเอทีต้องการเข้ากับเวคเตอร์สามารถแบ่งได้เป็น 2 วิธี ดังนี- การเชือมต่อดีเอ็นเอปลายเหนียว- การเชือมต่อดีเอ็นเอปลายทู่3.การเพิมปริมาณ DNA เป้ าหมาย หรือยีนในเซลล์ผู้รับหลังจากทีตัดต่อและถ่ายเข้าไปแล้ว ถ้าเป็นในเซลล์แบคทีเรีย สามารถทําได้โดยเลียงแบคทีเรียในอาหารเพาะเลียงเชือเพือให้ได้หลายโคโลนี และนําแบคทีเรียเหล่านันไปสกัดเอายีนทีต้องการหรือให้แบคทีเรียสร้างสารทีเราต้องการให้ bacteria สร้างสารทีเราต้องการ เพิมจานวนbacteria ทีมี recombinant gene อยู่
  24. 24. V. การตรวจสอบ clone ทีต้องการหลังจากใส่ชินดีเอ็นทีต้องการลงไปในเวคเตอร์ แล้วนําเวคเตอร์ดังกล่าวมา Transformation เข้าสู่ Host cell ในขันตอนนีจําเป็นมีวิธีการตรวจหาโคลนทีต้องการจากประชากรทังหมดของเซลล์เจ้าบ้าน แล้วคัดเลือกโคลนทีต้องการนันออกมา เพือเพิมจํานวนต่อไปการคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype)เป็นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครืองหมาย (marker gene) และมีการสร้างโปรตีนออกมาเช่น การสร้างเอนไซม์บางชนิดทีทําให้เกิด clear zone ในอาหารเลียงเชือทีมี substrate (IPTG) อยู่หรือพบลักษณะการดือยาในเซลล์ผู้รับทีได้รับมาจากพลาสมิดการคัดเลือกโดย DNA hybridizationอาศัยการจับคู่กันของสายดีเอ็นเอทีเป็นตัวติดตาม (probe) กับดีเอ็นเอเป้าหมายทีต้องการตรวจหาทีมีลําดับเบสคู่สมกัน บน membraneโดย probe จะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมูโนวิทยาทําได้เมือโคลนทีต้องการแสดงออกได้ โดยผลิตโปรตีน แต่โปรตีนไม่แสดงลักษณะหรือ phenotypeทีชัดเจน เป็นการตรวจสอบโปรตีนทีเซลล์ผลิตขึนโดยใช้แอนติบอดีทีจําเพาะกับโปรตีนทีต้องการนันการประยุกต์ใช้พันธุวิศวกรรมการวินิจฉัยโรคปัจจุบันมีการนําเอาเทคโนโลยีของDNAมาใช้ในการวินิจฉัยโรคทีเกิดจากการติดเชือต่างๆ เช่น เชือไวรัสโดยการใช้เทคนิคPCR เพือตรวจสอบว่ามีจีโมนของไวรัสอยู่ในสิงมีชีวิตนันหรือไม่ ซึงเป็นเทคนิคทีมีความไวสูงและสามารถตรวจพบได้โดยมีตัวอย่างเพียงเล็กน้อย เทคนิคนีได้นํามาใช้ในการตรวจวิเคราะห์การติดเชือ HIVเป็นต้นการบําบัดด้วยยีนจากความรู้เกียวกับความผิดปกติต่างๆในคนทีเกิดความบกพร่องของยีน หากสามารถใส่ยีนทีปกติเข้าไปในเซลล์ร่างกาย หรือเนือเยือทีแสดงอาการผิดปกติ แล้วทําให้ยีนนันแสดงออกเมือมีสารโปรตีนทีปกติในบริเวณดังกล่าวจึงอาจเป็นแนวทางหนึงทีจะช่วยทําให้บําบัดอาการบกพร่องทีเกิดขึนได้ ในปัจจุบันเทคนิคหนึงทีใช้ในการถ่ายยีนปกติเพือใช้ในการทํายีนบําบัด คือการใช้ไวรัสชนิดหนึงเป็นตัวนํายีนทีต้องการถ่ายเข้าสู่เซลล์คน ซึงยีนของไวรัสทีเป็นอันตรายต่อคนจะถูกตัดทิง แล้วใส่ยีนของคนทีต้องการเข้าไปแทนที ไวรัสทีสร้างขึนใหม่นีจะมียีนทีต้องการแทรกอยู่และจะมีความสามารถในการแทรกจีโนมของตัวมันเข้าสู่โครโมโซมคนได้ แต่ไม่สามารถจําลองตัวเองเองเพิมจํานวนได้เนืองจากยีนทีทําหน้าทีดังกล่าวทีมีอยู่เดิมในไวรัสได้ถูกตัดทิงไปการสร้างผลิตภัณฑ์ทางเภสัชกรรมการผลิตฮอร์โมนอินซูลิน เป็นตัวอย่างแรกทีทีนําเทคนิคทางDNAมาใช้ในการผลิตสารทีใช้เชิงเภสัชกรรมเพือรักษาโรคเบาหวาน ผู้ป่วยโรคเบาหวานจําเป็นต้องได้รับอินซูลิน เพือควบคุมระดับนําตาลจากการตัดและต่อDNAให้มียีนทีสร้างอินซูลิน แล้วใส่เข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย เพือให้เกิดการแสดงออกและสร้างพอลิเพปไทด์ทีต้องการ จากนันจึงนําเซลล์ไปเพือเพิมจํานวนยีนทีสร้างสายพอลิเพปไทด์ดังกล่าว และผลิตอินซูลินทีทํางานได้
  25. 25. การผลิตฮอร์โมนอินซูลินโดยใช้เทคนิคพันธุวิศวกรรมมีขันตอนโดยสรุป ดังนี1. การตัดชินส่วน DNA ของคนทีมียีนควบคุมการสังเคราะห์ฮอร์โมนอินซูลิน ต่อเข้ากับ DNA ของแบคทีเรีย จะได้ DNAโมเลกุลใหม่ เรียกว่า DNA สายผสม2. นํา DNA สายผสมใส่เข้าไปในเซลล์ของแบคทีเรีย ทีไม่สามารถสังเคราะห์ฮอร์โมนอินซูลิน ให้กลายเป็นแบคทีเรียชนิดใหม่ทีสามารถสังเคราะห์ฮอร์โมนอินซูลินได้3. คัดเลือกแบคทีเรียชนิดใหม่ทีสามารถสังเคราะห์ฮอร์โมนอินซูลินได้และนําไปเพาะเลียงให้มีเซลล์จํานวนมากเพียงพอแล้ว จึงสกัดฮอร์โมนอินซูลินไปใช้ประโยชน์ต่อไป
  26. 26. พืนฐานเบืองต้น (biology of cell)THE CELLCellProtoplasm Cell membraneCytoplasm NucleusOrganelle InclusionMembrane bound Non-membrane bound Exogenous EndogenousCell membraneประกอบด้วย Lipid = phospholipids(phosphoglyceride,sphingolipid), steroid(cholesterol)Protein = extrinsic(peripheral) และ intrinsic(integral)Carbohydrate = glycocalyx(cell coat) , glycolipid , glycoproteinเรียงตัวแบบ Fluid-Mosaic modelProtoplasmCytoplasmEctoplasm มี actin filament มากEndoplasm มี membrane bound organelle มาก จึงเรียกร่างแหทีพบใน endoplasmว่า Endoplasmic reticulumOrganelle1. Endoplasmic reticulum คือ membrane bound organelle ทีเป็นร่างแห่ของ vesicle , เยือหุ้ม ER เชือมต่อกับcell membrane , Golgi , nuclear membrane โดยหุ้มโพรงทีเป็นท่อ เรียก lumen หรือ ER cisternal spaceRER = ER ทีมี ribosome มาเกาะอยู่ หน้าที คือ การสังเคราะห์โปรตีน(Secretary protein)ของไรโบโซมทีเกาะอยู่ โดยมี Golgi body เป็นตัวสะสม หรือทําให้มีขนาดพอเหมาะ ทีส่งออกนอกเซลล์ ลําเลียงสาร ซึงได้แก่
  27. 27. โปรตีนทีสร้างได้ และสารอืนๆ เช่น ลิพิดชนิดต่างๆ. ในเซลล์ทีเกิดใหม่ พบว่ามี RER มากกว่า SER แต่เมือเซลล์มีอายุมากขึน พบว่า SER มากกว่า RER เชือกันว่า RER จะเปลียนเป็น SER เมือเซลล์มีอายุมากขึน พบในตับอ่อนลําไส้เล็ก ต่อมใต้สมองSER = ER ทีไม่มี ribosome มาเกาะ , พบ Mitocodria ทีมี tubular cistaeหน้าที 1. Lipid synthesis = มี Enz. ทีสําคัญในการสังเคราะห์ Lipid รวมถึง phospholipid และ Steroid2. Detoxification of drug and poison = Enz. ใน SER ทําให้สารพิษละลายนําได้เพือขับออกทางไต3. Calcium turnover = ควบคุมระดับ Ca2+ในเซลล์ โดยเฉาะการหดตัวของกล้ามเนือ4. Carbohydrate metabolism ในเซลล์ตับ SER เปลียน glucose phosphate ทีได้มาจาก glycogen ให้เป็นglucose เพือขับออกจากเซลล์ตับพบใน เซลล์ทีต่อมหมวกไต , Leydig’s cell ในอัณฑะ , เซลล์คอร์ปัสลูเทียมในรังไข่ และในเซลล์ของตับ2. Ribosome คือ non-membrane bound organelle เกิดจาก ribosomal RNA (rRNA) จับกับ ribosomal proteinเป็น ribosome subunit ขนาดเล็ก(30s,40s,50s,60s โดย 30s+50s = 70s และ 40s+60s = 80s). โดยทําหน้าทีสังเคราะห์โปรตีนในกระบวนการ Translation. Ribosome มี 3 form ได้แก่ free form , polysome , rER3. Golgi apparatus เกิดจาก Golgi cisterna หลายอันซ้อนทับกัน ซึงทางด้านโค้งเรียก cis face และทางด้านเว้าเรียก trans face.หน้าที 1. Protein maturation โปรตีนทีสร้างจาก RER เป็น immature ซึงจะทําให้เป็น mature ที Golgi2. Protein sorting การคัดแยกโปรตีนชนิดเดียวกันไว้ในถุงเดียวกัน3. Protein condensation การทีโปรตีนอืนไม่4. Membrane equilibrium เกิดตอนกระบวนการ exocytosis ทําให้ membrane เพิมขึนและ membrane ทีเพิมขึนนีก็จะถูกนํากลับไปให้ Golgi ด้วย endocytosis4. Lysosome คือ membrane bound organelle ทีเป็น digestive organelle ทําหน้าทีย่อยโดยใช้ Enz. (Hydrolase)ที active ในกรด (pH 5) ซึงควบคุมความเป็นกรดโดย Proton pump ทีอยู่บน membrane , ภายในบรรจุ Hydrolaseมากกว่า 40 ชนิด (ทีสําคัญคือ acid phosphate) , พบมากใน phagocyte5. Endosome คือ membrane bound organelle ทีได้จากกระบวนการ Endocytosis6. Proteasome คือ non-membrane bound organelle ทีประกอบด้วย protein complex(core protein + regulatoryprotein) โดยมีคุณสมบัติเป็น ATPase ทําหน้าที ย่อยโปรตีนในcytosol(proteolysis) และ subunitบางตัวทําหน้าทีจับกับ ubiquitin ทีตําแหน่ง ubiquitin recognizing site ของ regulatory protein , ubiquitin คือ โปรตีนขนาดเล็ก (76amino acid)7. Peroxisome มีลักษณะคล้าย Lysosome ภายในบรรจุ oxidizing enz. กว่า 40 ชนิด รวมทัง D-aminooxidaseและ catalase หน้าทีคือ detoxify toxic substance และ neutralizes free radical โดย oxidase8. Mitocondria คือ double membrane bound organelle โดยแบ่งเป็น inner และ outer ซึง

×