Tes protein urine penting untuk diagnosis dan prognosis gangguan ginjal. Terdapat berbagai metode untuk mengukur protein urine seperti metode colorimetric, turbidimetri, dan imunokimia. Hasil tes diinterpretasikan untuk mengetahui tingkat proteinuria dan penyakit ginjal yang mendasarinya.

1. TUTOR KIMIA KLINIKPEMERIKSAAN PROTEIN URINE dr. Sri Kartika Sari/dr. Leonita Anniwati, SpPK(K)

3. Secara normal, hanya sebagian kecil protein ada dalam urine. Dalam hal ini, faktor yang berperan adalah :

4. Filtrasi ginjal

5. Reabsorbsi protein oleh tubulus

6. Proteinuria :

7. Adanya protein dalam urine yang lebih dari 150 mg/hari

8. Patofisiologi :

9. Perubahan permeabilitas glomerulus

10. Gangguan reabsorpsi tubulus

11. Peningkatan jumlah low-molecular weight protein dalam serum

12. Sekresi dari uroepitel2

13. Mikroalbuminuria BM Albumin : kurang lebih 66 kD, normal sebagian difiltrasi oleh ginjal dan direabsorbsi kembali oleh tubulus Secara normal, walaupun BM albumin cukup kecil untuk melewati membran basalis glomerulus, namun adanya muatan negatif glikoprotein menghalangi transport albumin. Mikroalbuminuria indikator dini disfungsi glomerulus Mikroalbuminuria : UAE : 30-300 mg/24 jam Albumin Creatinine Ratio : 30-300 mg/g 3

14. Mekanisme albuminuria/proteinuria Keseimbangan elektrolit berubah Kerusakan membran radang Fusi foot processes Perlekatan oleh antibodi Muatan negatif berkurang Peningkatan tekanan pd membrana basalis Albumin loss Proteinuria non selektif 4

15. Klasifikasi proteinuria : Fisiologis Kurang dari 200 mg/hari Postural (ortostatik), latihan fisik berat Patologis : Glomerular proteinuria Tubular proteinuria Overflow proteinuria 5

16. PEMERIKSAAN PROTEIN URINE 6

17. Reaksi Heller dan Reaksi Robert Prinsip : Lapisan endapan akan terbentuk bila protein bereaksi dengan asam nitrat pekat (pada reaksi Robert asam nitrat dan magnesium sulfat), bila ditambahkan secara perlahan. 7

18. REAKSI HELLER Asam nitrat pekat ditambahkan perlahan melalui dinding tabung Terbentuk lapisan cincin putih diantara kedua larutan 3-5 ml urine jernih 8

19. REAKSI ROBERT Magnesium sulfat dan asam nitrat pekat dengan perbandingan 5 : 1 ditambahkan perlahan melalui dinding tabung Terbentuk lapisan cincin putih diantara kedua larutan 3-5 ml urine jernih 9

20. BENCE JONES PROTEIN BM rendah (< 44 kD) Imunoglobulin paraprotein (kappa/lambda monoclonal light chain type) Keadaan fisiknya dapat diubah oleh perubahan suhu mengendap pada suhu 45⁰– 60⁰ C dan larut pada suhu kamar dan suhu mendekati 100⁰ C Positif pada multipel mieloma, amiloidosis, makroglobulinemia. 10

21. BENCE JONES PROTEIN kekeruhan Jernih kembali 1,0 buffer acetat 4 ml urine jernih Waterbath 100⁰ C 3 mnt Waterbath 56⁰ C 15 mnt kekeruhan Ulangi lagi langkah 1-3 Waterbath 100⁰ C 3 mnt 11

22. CARIK CELUP Prinsip : Dalam suatu sistem buffer yang mempertahankan pH konstan, indikator warna dapat bereaksi dengan protein (utamanya albumin) sehingga terjadi perubahan warna kuning (pada pH asam) hijau. 12

23. Hasil 13

24. Sulfosalicylic Acid Test (SSA) Prinsip : Protein diendapkan oleh asam sulfosalisilat (suatu asam kuat) dan diamati secara visual. Interferences : 14

25. SSA 11 ml dari supernatan 3 ml reagen SSA 7 % Tutup tabung, bolak balik 2 x 12 ml aliquot urine disentrifuge 1500 rpm 5 mnt Bolak balik tabung 2 x lagi Lihat presipitasi yang terjadi Biarkan selama 10 menit 15

26. SSA 16

27. CARIK CELUP DAN SSA 17

28. PROTEIN REBUS Prinsip : Protein dalam suasana asam lemah, bila dipanaskan akan mengalami denaturasi dan terjadi endapan. Hasil : 18

29. PROTEIN REBUS 2-3 tetes asam asetat 6 % Baca hasil 3 ml urine yg telah disaring/disentrifuse Panaskan lagi sampai mendidih Panaskan sampai mendidih 19

30. TES MIKROALBUMIN Metode Imunokimia : Immunodip test Micral test strips Metode dye-binding CLINITEK microalbumin Multistix PRO 20

31. Immunodip test Prinsip : Albumin berikatan dengan antibodi yang dicoated dengan partikel blue latex. Saturated dan unsaturated albumin-antibody complexes diisolasi dan dipisahkan oleh migrasinya pada strip. Kadar albumin ditentukan oleh perbandingan intensitas dari 2 blue band tersebut. Interpretasi hasil : Stabil sampai 8 jam 21

33. Albumin berikatan dengan gold labeled antibody enzyme conjugate. Albumin-bound complexes bermigrasi ke detection pad, sehingga ikatan enzim mengubah substrat dalam pad menjadi merah. Intensitas warna meningkat seiring dengan peningkatan kadar albumin.

34. Hasil :

35. Dibandingkan dengan color chart yang ada pada container. Range : 0-100 mg/dL.

36. Detection limit : 15-20 mg/L22

38. Pada pH konstan, sulfonephthalein dye berubah warna jika berikatan dengan albumin.

39. Hasil :

40. Diinterpretasi dengan instrumen

41. Jika albumin (+) biru. (Range : hijau pucat sampai biru)

42. Detection limit : 20-40 mg/L

43. Terdapat pula reaction pad untuk menentukan kreatinin (semikuantitatif)23

44. Multistix PRO strips Prinsip : Sama dengan CLINITEK microalbumin Detection limit : 80-150 mg/L Hasil diinterpretasi dengan instrumen, bisa juga secara visual (membandingkan dengan color chart) 24

46. Aduk sampai rata

47. Ambil urine secukupnya  + asam cuka sampai pH  6  saring (Periksa dengan kertas pH ) Tutup dengan gabus  bolak balik  diamkan 24 jam R R U U Hasil dalam gram / L Isi tabung Esbach dengan urine sampai tanda U Tambah reagen Esbach sampai tanda R *Total protein dalam 24 jam = Vol. Urine 24 jam ( L ) X hasil (gram / L) = …….. gram / 24 jam.

48. Metode Turbidimetri dengan Asam Sulfosalisilat Prinsip : Protein diendapkan oleh asam sulfosalisilat (suatu asam kuat) dan kekeruhan yang terjadi sebanding dengan konsentrasi protein. Reagen : Larutan SSA 3 % Larutan HCl 1,25% 26

49. Cara pemeriksaan Turbidimetri SSA HCl 1,25% SSA 3 % Sentrifuse aliquot dari urine 24 jam, ambil supernatannya Aduk dan biarkan 5 menit Ukur absorbansnya pada 500 nm Baca hasil pada kurva standar. Bila lebih dari 140 mg/dL, maka diulang dengan pengenceran 1:10 (dgn normal saline) 27

50. Metode Biuret Prinsip : Ikatan peptida protein bereaksi dengan ion Cu membentuk kompleks yang berwarna ungu (purple). Reagen Biuret : 60 ml NaOH 10% dalam 100 ml akuades 0,3 g CuSO₄ 1,2 g Rochelle Salt Ditambahkan akuades hingga 200 ml 28

51. Metode Biuret 2,0 mg reagen biuret Diaduk rata Tunggu 60 menit urine 500 μL Ukur absorbans pada 540 nm. Baca pada kurva standar 29

52. Metode Folin Lowry Prinsip : Pada suasana alkali ion Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida, dimana ion Cu direduksi menjadi monovalen ion. Cu+ dan gugus radikal dari tirosin, triptofan dan sistein bereaksi dengan reagen Folin, menghasilkan senyawa tidak stabil yang tereduksi menjadi molybdenum/tungsten blue (biru tungsten). 30

53. Metode Folin Lowry Reagen fenol 2,5 mg reagen Copper alkali Tunggu 10 menit Diaduk rata urine 500 μL Tunggu 60 menit Ukur absorbans pada 750 nm Baca pada kurva standar 31

54. Metode Coomasie Blue/Bradford Assay Prinsip : Dalam suasana asam reagen, protein berikatan dengan coomasie dye, menyebabkan perubahan absorpsi maksimum panjang gelombang, dari spektrum merah/coklat (absorbans maksimum 465 nm) menjadi biru (absorbans maksimum 610 nm). Perbedaan terbesar terjadi pada panjang gelombang 595 nm, sehingga 595 nm merupakan panjang gelombang optimal untuk mengukur warna biru dari kompleks coomasie dye-protein. 32

55. Dye-Binding 33

56. Metode Coomasie Blue/Bradford Assay 34

58. PENUTUP Pemeriksaan protein urine penting untuk menegakkan diagnosa dan menilai prognosis gangguan ginjal. 36

59. TERIMA KASIH TERIMA KASIH 37

60. Metode Imunokimiauntuk mengukur kadar protein spesifik 38

61. Immunonephelometry 1 2 40 μL pure antiserum spesifik utk HSA 160 μL buffer tunggu 45 menit 150 μL standar/urine Baca absorbansnya pada 632,8 nm 39

62. 40

63. 41

64. 42

65. 43

66. Biuret Before After 44

67. Metode Biuret 60 mins later 45

68. Biuret Figure 6. Time course trace of the chromogenic reaction The absorbance became stable approximately after 60 minutes 46

69. Biuret Figure 7. Spectra of the HSA solution using the Biuret method after 60 minutes Biuret method determines the quantity by using the absorption maximum at 540 nm after reacting with the sample for 60 minutes 47

70. Kurva standar metode Colorimetric Biuret : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,0.25, 0.5, 1,5,9 mg/mL Lowry : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,2,20,50,100,200 μg/mL Coomassie Blue : BSA (Bovine Serum Albumin) : 0,1,2,4,6,8,10 μg/mL 48

71. Biuret test 49

72. Metode Lowry 60 mins later 50

73. Metode Lowry Figure 9. The time course trace of chromogenic reaction 51

74. Metode Lowry Figure 10. Spectra of HSA aqueous solution by Lowry method 52

75. Kurva standar turbidimetri SSA Menggunakan Bovine Albumin Standard/Versatol 7% Tambahkan 5 ml pada vial protein standar dan campur . Biarkan 30 menit, kemudian encerkan dengan 0,85% NaCl, hingga kadarnya 140 mg/dL Sediakan 7 tabung dan tambahkan sesuai dengan dibawah ini : 53

76. Tabel metode kuantifikasi protein 54

78. HT essential

80. mikroglobulinGlomerulus Selektif (terutama albumin) Peny.lesi minimal Non selektif DM, FSGS Diskrasia sel plasma Injuri tubulus HT GGK 55

81. 56

82. Metode Bichinionic Acid (BCA) 57