Jin1

1,030 views

Published on

  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

Jin1

  1. 1. JOURNAL READINGIndian Journal of medical Microbiology, (2009) 27 (4): 341-7<br />CHARACTERIZATION AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA ISOLATED FROM BLOODSTREAM INFECTIONS OF CANCER PATIENTS ON CHEMOTHERAPY IN PAKISTAN <br />RobiulFuadidr/ I.G.A.A. Putri Sri Rejeki, dr. SpPK<br />1<br />
  2. 2. PENDAHULUAN<br />Kankermempengaruhisistemimunpasienbaiklangsungmaupuntidaklangsung, sehinggarentanterhadapinfeksi<br />Bloodstream infection (BSI) merupakanpenyebabutamamorbiditasdanmortalitaspasienkanker<br />BSI olehbakteribatang Gram negatifbanyakterjadipadapasienkankerselamaterapiagresif.<br />2<br />
  3. 3. Di Eropadan USA, enterobacteriaceaemerupakanpenyebab 65-80% infeksi Gram negatifpadapasienkanker<br />Pseudomonas aeruginosaberhubungandenganmorbiditasdanmortalitaspadaimmunocompromised host<br />Insidensiresistensiantibiotikpadabakteribatang Gram negatifmeningkat<br />3<br />
  4. 4. Tujuanpenelitian:<br /><ul><li>Menentukantingkatfrekuensi BSI olehbakteri Gram negatif, sepertiPseudomonas aeruginosadanenterobacteriaciae, padapasienkanker
  5. 5. Menentukankepekaanantimikrobaterhadapbakteri yang diisolasi</li></ul>4<br />
  6. 6. BAHAN DAN METODE<br />Seleksipasien:<br />PenelitiandilakukandiLaboratoriumMikrobiologi Institute of Nuclear Medicines and Oncology, Lahore selamajuli 2006-januari 2007<br />Subjekpenelitian:<br />Semuapasienkanker yang dirawatinapdanmenjalaniterapi anti kanker, dandicurigaimengalami BSI<br />Kriteriaeksklusi:<br />Pasien yang telahmendapatterapiantibiotik, dandemambukankarenainfeksi<br />5<br />
  7. 7. Media Kultur<br />Nutrient broth<br />Nutrient agar<br />Blood agar<br />Muller Hinton broth<br />MacConkey agar<br />Brain Heart infusion broth<br />6<br />
  8. 8. Identifikasi<br />Isolasidilakukandenganmenambahkan 5 ml darah vena pasienpadanutrient broth.<br />Inkubasi 37oC hingga 1 minggu<br />Untukmendapatkanwell-isolated colonies, inokulumdispreadpadapermukaanenriched agar plate dandiinkubasipada 37oC selama 24 jam<br />7<br />
  9. 9. Pemberiannamatiap strain berdasarkanmorfologikoloni, pengecatan Gram, dantesbiokimia<br />Tesbiokimia: tesoksidase, citrate utilization test, tesindol, tesurease,danKligler iron agar test<br />Didapatkan total 60 isolat Gram negatif<br />8<br />
  10. 10. Antimikroba<br />Dilakukanpada 3 kelompokantimikroba:<br /><ul><li>Carbapenem (meropenem, imipenem)
  11. 11. Cephalosporin (ceftriaxone, cefepime, dancefoperazone)
  12. 12. Aminoglycoside (tobramycin)</li></ul>Larutanantimikrobadengankonsentrasi yang berbeda-bedadisiapkanuntukMinimum Inhibitory Concentration (MIC) test<br />9<br />
  13. 13. TesKepekaanAntimikrobadanMinimun Inhibitory Concentration (MIC)<br />InokulumdisiapkandenganmenginokulasikankolonibakteridankontroldalamMuller Hinton Broth<br />Optical densitasnyadiukurdenganspektrofotometerpadapanjanggelombang 546 nm<br />Densitasinokulumdiadjustpada 105 Colony forming Unit (CFU)/ml dandigunakanuntukmenentukan MIC<br />10<br />
  14. 14. MIC ditentukanpadaMuller Hinton Broth yang mengandungantimikroba yang diencerkandua kali lipatsecara serial, suspensibakteri yang diinokulasi 105 CFU/ml<br />MIC adalahkonsentrasiantibiotikterendahtanpaterlihatpertumbuhanisolat<br />MIC50 dan MIC90didefinisikandengankonsentrasiantibiotik minimal yang menghambat 50% atau 90% isolat<br />11<br />
  15. 15. 12<br />
  16. 16. Table 1. The susceptible and resistant breakpoints of all antibiotics according to National Committee for Clinical and Laboratory standards Institute (NCCLS,2000) in Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa<br />13<br />
  17. 17. Deteksi Extended Spectrum beta-Lactamase (ESBL)<br />Disk yang mengandungcefotaximedanceftazidine 30µgdiletakkan di media yang telahinokulasibakteri, dengansalahsatusisinyadiletakkan disk yang mengandung amoxicillin danclavulanate (20 plus 10 µg) denganjarak 25-30 mm<br />Media yang telahdinokulasidiinkubasi 18-24 jam padasuhu 37oC<br />Produksi ESBL ditentukanolehadanyazonainhibisipada cephalosporin yang diperluasolehclavulanate<br />14<br />
  18. 18. Analisis data<br />Data dianalisadandievaluasiberdasarkannilai rata-rata danpersentase<br />Hasildipresentasikandalambentuktabeldangambar<br />15<br />
  19. 19. HASIL<br />60 bakteri gram negatif:<br /><ul><li>Pseudomonas aeruginosa38%
  20. 20. E.coli 25%
  21. 21. Klebsiella 20%
  22. 22. Proteus 10%
  23. 23. Shigella 7%</li></ul>16<br />
  24. 24. 17<br />
  25. 25. Table 2: Minimal Inhibitory Concentration (MIC), percentage and susceptibility of different antimicrobial agents againtsPseudomonas aeruginosaisolated from BSI of cancer patients<br />Note: MIC50 and MIC90 (Minimum Inhibitory Concentration) at which 50% and 90% of the isolates, respectively, were inhibited. The unit for all MICs microgram per mililiter (NCCLS 2000). %R shows the resistance according to NCCLS 2000. % S shows the susceptibility according to NCCLS 2000<br />18<br />
  26. 26. 19<br />
  27. 27. Table 2: Minimal Inhibitory Concentration (MIC), percentage and susceptibility of different antimicrobial agents againtsEnterobacteriaceaeisolated from BSI of cancer patients<br />Note: MIC50 and MIC90 (Minimum Inhibitory Concentration) at which 50% and 90% of the isolates, respectively, were inhibited. The unit for all MICs microgram per mililiter (NCCLS 2000). %R shows the resistance according to NCCLS 2000. % S shows the susceptibility according to NCCLS 2000<br />20<br />
  28. 28. 21<br />
  29. 29. Figure 1: Multi drug resistance in Gram-negative bacterial strains againts different antimicrobial agents. CSP: cephalosporin, FQL: fluoroquinolones<br />% age of resistant isolates<br />Antibiotics used<br />22<br />
  30. 30. Figure 2: Gram-negative bacterial strains showing cross resistance against cefoperazone, ceftriaxone, and cefepime CFZ : cefoperazone, CFP: Cefepime, CTX: ceftriaxone<br />% age of resistant isolates<br />Antibiotics used<br />23<br />
  31. 31. Figure 3: Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae strain showing cross resistance against imipenem and meropenem IMP: imipenem MEM: meropenem<br />% age of resistant isolates<br />Antibiotics used<br />24<br />
  32. 32. Figure 4; Antibitic Resistance and sensitifity of E. coli and K. pneumoniae against cefoperazone, ceftriaxone and cefepime CFZ: cefoperazone, CFP: cefepime, CTX: ceftriaxone<br />% age of resistant isolates<br />Antibiotics used<br />25<br />
  33. 33. ResistensiAntimikrobaolehPenghasilbeta Laktamase<br />Sebanyak 20 % Klebsiella, dan 25% E. coli ditemukansebagaipenghasilbeta Laktamasepadapenelitianini<br />26<br />
  34. 34. DISKUSI<br />Pseudomonas aeruginosamerupakan strain bakteri paling seringmenyebabkan BSI padapasienkanker<br />Laporan SENTRY for laboratories di USA, Kanada, Amerika Latin, danEropamenunjukkanE.coli, Kliebsiella, danP.aeruginosamerupakanbakteripenyebab BSI yang paling seringresisten<br />27<br />
  35. 35. ResistensiP.aeruginosaterhadap ciprofloxacin sebesar 80%, sedangkanenterobacteriaceae 88%<br />Resistensitinggibakteribatang gram negatifterhadap cephalosporin generasi III dan ciprofloxacin diAmerika, Kanada, danAmerika Latin<br />Resistensipatogen gram negatifrendahdiInggrisdanIrlandia(2001-2002),dimanaresistensiP.aeruginosaterhadap ciprofloxacin danceftazidimeantara 4-7%<br />28<br />
  36. 36. 74% strain P.aeruginosaresistenterhadapfluoroquinolonedancephalosporin,sedangkanenterobacteriaceae79%<br />Menurutlaporan SENTRY (1997-2002) diAmerika, padaBSIterdapatmultidrug resistance untukP.aeruginosadenganprevalensi yang tinggi<br />29<br />
  37. 37. Padapenelitianpenulis, tingkatresistensibeta laktam<br /><ul><li>Klebsiella88%
  38. 38. E.coli87%
  39. 39. Proteus 58%
  40. 40. Shigella 55%</li></ul>30<br />
  41. 41. Kesimpulandan Saran<br />Dibutuhkanpengawasandalampenggunaanantimikrobadirumahsakit, karenapolapemberianantibiotikberperandalamterjadinyaresistensi<br />Monitoring yang regulerpadatingkat regional maupunnasional, sehinggaklinisimendapatkaninformasi regimen terapipilihan yang empiris<br />Menjalankankebijakanpenggunaanantibiotiksecarabijaksanadansesuaiguideline<br />SkriningESBL sebagaiprosedurrutindilaboratoriumklinismemberikaninformasi yang berhargapadaklinisidalampemilihanantibiotik<br />31<br />
  42. 42. TERIMA KASIH<br />32<br />
  43. 43. TesOksidase<br />Digunakanuntukmembantuidentifikasispesies yang memproduksienzimoksidase<br />Prinsip<br />Sepotongkertassaringdibasahidenganbeberapatetesreagenoksidase. Jikaorganismememproduksioksidase, phenylenediaminepadareagenakanteroksidasimenjadiwarna deep purple.<br />Reagen yang dibutuhkan:<br />ReagenOksidase yang berisilarutan 10 g/l tetramethyl-p- phenylenediaminedihydrochloride<br />Ctt: reageninimudahteroksidasi. Jikareagentelahberwarnabiru, jangangunakan.<br />33<br />
  44. 44. Metode<br /><ul><li>Letakkankertassaringpadapetri disk yang bersih, tambahkan 2-3 ttsreagenoksidase
  45. 45. Denganbatangkaca, pindahkankoloniorganismetesdanoleskanpadakertassaring
  46. 46. Lihatperubahanwarnamenjadi blue-purple dalambeberapadetik</li></ul>Hasil<br />Warna blue purple (dalam 10 detik) positifmemproduksienzimoksidase<br />Warnabukan blue purple (dlam 10 detik) negatif<br />Ctt:abaikanwarna blue purple yang terjadisetelah 10 detik<br />Kontrolpositif: Pseudomonas aeruginosa<br />Kontrolnegatif: Eschericia Coli<br />34<br />
  47. 47. 35<br />
  48. 48. Citrate utilization test<br />Untukmembantuidentifikasienterobactericiaea. Tesiniberdasarkankemampuanorganismemenggunakansitratsebagaisumberkarbondan ammonia sebagaisumber nitrogen<br />Prinsip:<br />Organismedikulturpada media yang mengandung sodium citrate, garam ammonium, danindikatorbromothymol blue. Pertumbuhanpada media ditandaiolehkekeruhandanperubahanwarnaindikatordarihijauterangmenjadibiru, olehkarenareaksialkali,mengikutipemakaiancitrat<br />36<br />
  49. 49. Bahan yang dibutuhkan:<br /> Media Koser’s citrate (Simon citrate dapatdigunakantapilebihmahal)<br />Dengansterile straight wire, inokulasiorganismedi media kultur broth ke 3-4 ml media Koser’s Citrate<br /> (harushati-hati agar tidakmengkontaminasi media denganpartikelkarbon, sepertikawat yang terbakar<br />Inkubasipada 35-37oC, hingga 4 hari, periksatiaphariadanyapertumbuhan<br />37<br />
  50. 50. Hasil<br /><ul><li>Kekeruhandanwarnabiru, hasiltespositif,citrateterpakai
  51. 51. Takadapertumbuhan, tesnegatif, citrate tidakterpakai
  52. 52. Kontrolpositif : Klebsiellapneumoniae
  53. 53. Kontrolnegatif : Eschericia coli</li></ul>38<br />
  54. 54. CITRATE UTILIZATION TEST<br />Inkubasi<br />Positifnegatif<br />39<br />
  55. 55. 40<br />
  56. 56. Urease Test <br />Tesureasepentinguntukmembedakanenterobacteriaceaeberdasarkankemampuanmemproduksiurease.<br />Prinsip<br />Organismetesdikulturpada media yang mengandung urea danindikator phenol warnamerah. Jika strain memproduksiurease, enziminiakanmemecah urea menghasilkan ammonia dankarbondioksida. Denganmenghasilkan ammonia, media menjadi alkali yang ditunjukkanperubahanwarnamenjadimerahmuda<br />41<br />
  57. 57. Tesurease<br />Bahan yang dibutuhkan<br /> Media Motility Indole urea (MIU)<br />Metode<br />menggunakankawatsterillurus, inokulasi media pada media MIU<br />Tempatkanindole paper strip dilehertabung MIU diatas media. Tutuptabungdaninkubasipada 35-37oC semalam<br />Periksaproduksiureasedenganmelihatwarnamerahmudapada media<br />42<br />
  58. 58. Hasil<br /> Media merahmuda, positifmenghasilkanurease<br /> Media tidakmerahmudanegatifmenghasilkanurease<br />Kontrol<br />kontrolpositifurease : Proteus vulgaris<br />kontrolnegatifurease : Eschericia Coli<br />Motilitas<br />ditunjukkandenganadanyapenyebarankekeruhandarigaristusukan<br />43<br />
  59. 59. 44<br />
  60. 60. TesIndol<br />Tesproduksiindolpentinguntukidentifikasienterobacteriaceae. Kebanyakan strain dariE.Colimemecahasam amino tryptophan denganmenghasilkanindole.<br />Organismetesdikulturpada media yang mengandung tryptophan. ProduksiindoldideteksiolehreagenKovac’satau Ehrlich yang berisi 4 (p)-dimethylaminobenzaldehyde. Bahaninibereaksidenganindolsehinggamemproduksiwarnamerah<br />45<br />
  61. 61. Bahan<br /> media MIU<br />Kovac’s reagent strips<br />Hasil<br /> strip kemerahan, positifmenghasilkanindol<br />bukanwarnamerah, negatifmenghasilkanindol<br />Jikabelumjelas, tambahkan 1 ml reagent Kovacdanlihatadanyawarnamerahdalam 10 menit<br />46<br />
  62. 62. 47<br />
  63. 63. Kligler Iron Agar<br />MembantumengidentifikasiSalmonella, Shigella, bakterienterik yang lain.<br />PerbedaandenganTriple Sugar Iron agar adalahtidakadanyasukrosapada KIA<br />Reaksi KIA berdasarkanfermentasilaktosadanglukosasertaadanyaproduksi hydrogen sulphide.<br /><ul><li>buttdenganwarnakuning(produksiasam) danslopemerahmudamengindikasikanhanyamemfermentasiglukosa. ReaksiiniterlihatpadaSalmonelladanShigella
  64. 64. Retakandangelembungmengindikasikanadanyaproduksi gas darifermentasiglukosa. Gas diprodoksiolehSalmonella paratyphi</li></ul>48<br />
  65. 65. Slopewarnakuningdanbuttkuningmengindikasikanfermentasilaktosadanmungkinglukosa. TerjadipadaEscherichia coli<br />Slopedanbuttwarnamerahmuda, mengindikasikantakadafermentasiglukosamaupunlaktosa. Terlihatpadakebanyakan strain P.aeruginosa<br />Kehitamanpada area stabline, mengindikasikanproduksi H2S. MisalpadaSalmonella typhi(tipis), atauSalmonella typhimurium(luas)<br />49<br />
  66. 66. Formula danpersiapan media KIA<br />Oxoid dehydrated medium formula:<br />Lab-Lemco powder 3,0 g/liter<br />Yeast extract 3,0 g/liter<br />Peptone 20,0 g/liter<br />NaCl 5,0 g/liter<br />Laktosa 10,0 g/liter<br />Glukosa 1,0 g/liter<br />Ferric citrate 0,3 g/liter<br />Sodium thiosulpate 0,3 g/liter<br />Phenol red 0,05 g/liter<br />Agar 12,0 g/liter<br />50<br />
  67. 67. Media digunakanpadakonsentrasi 5,5 gram setiap 100 ml aquades<br />Panaskanpadasuhu 50-55o C, campurbaik-baik, danbagidalam 6 ml sejumlahtabung (sekitar 16x160 mm)<br />Sterilisasidengan autoclave<br />Siapkan media dalamposisi slope, dengankedlaman butt 25 mm, dan slope 25 mm<br />Simpanpadatempat yang dingindangelappada 2-8oC<br />51<br />
  68. 68. KIA (1)<br />sengkelit<br />Setelah inkubasi<br />Alkali <br />Asam<br />H2S<br /><br />52<br />
  69. 69. KIA (2)<br />Setelah inkubasi<br />Alkali<br />Asam<br />Gas<br />53<br />
  70. 70. 54<br />
  71. 71. Pseudomonas aeruginosa<br />Cultural features<br /> blood agar: large, flat, haemolitic colonies. Strict aerob. Most strain produce pyocyanin (yellow green in medium)<br />McConkey:non lactose fermenting colonies with yellow green in medium<br /> KIA: Pink-red slope and butt, gas (-), H2S (-)<br />identifikasi: gram negatif, oksidasepositif, citrate positif<br />MIU: Motility positif, indolnegatif, tesureasetergantung strain <br />55<br />
  72. 72. Eschericia coli<br />Cultures feature<br />McConkey agar: large 2-4 mm lactose fermenting colonies<br /> Blood agar: 1-4 mm colonies, may appear mucoid and some strains are haemolytic<br />Gram negatif, oksidasenegatif, citrate negatif<br />MIU: motilitaspositif, kebanyakanindolpositif, ureasenegatif.<br />KIA: slope kuning, butt kuning<br />56<br />
  73. 73. Klebsiella<br />Cultural feature: MacConkey agar most strain form large lactose fermenting mucoid colonies<br /> blood agar: large mucoid colonies<br />Gram negatif, oksidasenegatif, citrate positif<br />MIU: non motile, sebagianbesarindolnegatif, ureasepositif (slow)<br />KIA: slope kuning, butt kuning, H2S negatif, gas positif<br />57<br />
  74. 74. Proteus<br />Cultural features:<br /> Blood agar: most strains produce swarming growth<br />McConkey agar: non-lactose fermenting colonies formed<br /> Colonies have a distinctive smell<br />Gram negatif, oksidasenegatif, tes citrate tergantung strain<br />MIU: motilitaspositif, indoltergantung strain, urea positif<br />KIA: slope merah, butt kuning, H2S positif, gas tergantung strain<br />58<br />
  75. 75. Shigella<br />Cultural features<br />MacConkey: colourless colonies<br />Gram negatif, oksidasenegatif, citratnegatif<br />MIU: non motile, ureasenegatif, indoletergantung strain<br />KIA: pink-red slope, yellow butt, no blackening and most strains produce no crack in medium<br />59<br />
  76. 76. Densitas 105<br />Siapkanstandar 0,5 McFarland dengan Barium chloride 1% 0,05 ml dandan 1% sulfuric acid 1,0% 9,95ml<br />Siapkansuspensibakterisetaradengan 0,5 McFarland<br />Encerkan 1:7500 untukmendapatkansuspensi 2x105<br />Tambahkan 1 ml larutandiatasdengan 1 ml larutanantibiotik, sehinggadidapatkansuspensi 105<br />60<br />
  77. 77. MIC <br />antibiotika<br />=2 mg/L<br />Bakteridlm media + antibiotika<br />kontrol<br />16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12mg/L<br />Inkubasi semalam<br />MIC antibiotika -1 mg/L<br />16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12mg/L<br />Inkubasi semalam<br />MIC <br />antibiotika<br />=2 mg/L<br />61<br />
  78. 78. Antibiotik<br />Cephalosporin dancarbapenem : beta laktam, menghambatsintesisdindingsel<br />Aminoglycoside :menghambatsintesis protein<br />Fluoroquinolone: menghambatsintesisasamnukleat<br />62<br />
  79. 79. Bagaimanabakteribisaresisten?<br />Denganmutasigenetik, sehinggamengubah protein dankomponen lain bakteri yang digunakanantibiotikmelekat<br />contoh: aminoglycosides, lincomycin, erytromicin<br />Bakterimemproduksienzim yang merusakataumenginaktivasibakteri<br />contoh: beta laktamase; enzim acetylating, adenylating, danphosphorylatinginaktivasiaminoglikosid.<br />Bakterimengubahsistemmetabolisme, sehinggatidakdapatdipengaruhiolehantibiotik<br />Contoh: resistensiterhadapsulfonamid<br />Bakterimengubahpermeabilitasdarimembran, sehinggamenyulitkanmasuknyaantibiotik<br />Contoh: resistensiterhadappolymixindan tetracycline <br />63<br />
  80. 80. ESBL<br />64<br />
  81. 81. Identifikasi<br />+ : positif<br /><ul><li>: negatif</li></ul>+(-): kebanyakanpositif<br />-(+) : kebanyakannegatif<br />± : tergantung strain<br />M : merah<br />K : kuning<br />65<br />

×