Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Jh3

2,524 views

Published on

  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

Jh3

  1. 1. Journal Reading Hematology Full blood count and haemozoin- containing leukocytes in children with malaria: diagnostic value and association with disease severity Johanis / Yetti Hernaningsih 1
  2. 2. Latar belakangMalaria  anemia & trombositopenia.Impresisi perhitungan manual: - 100 sel : 1-12% - 10.000 sel : 4,6-5,4%Alat hitung darah lengkap (FBC) mutakhir: - presisi dan akurasi lebih baik - lebih cepat (30-60 detik) - keterbatasan penggunaan di wilayah endemis malaria karena kompleksitas dan harga . 2
  3. 3. Latar belakangHaemozoin (Hz): hasil akhir detoksifikasi haem yang difagosit oleh monosit dan granulosit.Beberapa penelitian: - hubungan Hz dengan diseritropoiesis dan anemia. - hubungan antara Hz-containing leukocyte (PCL) dengan beratnya malaria. 3
  4. 4. Latar belakangKeterbatasan penelitian (mikroskopik) sebelumnya: - impresisi tinggi  PCL relatif rendah dan pengamatan jumlah total leukosit rendah, - menghabiskan banyak waktu dan subjektif.PCL sangat berguna untuk mendiagnosis malaria.Cell-Dyn 3000® dapat mendeteksi sel yang mengandung Hz secara otomatis. 4
  5. 5. Metode• Penelitian dilakukan di Albert Schweitzer Hospital (HAS), Lambaréné, Gabon, tahun 2003 dan 2004.• Wilayah holoendemis malaria hutan hujan tropis.• Sampel darah diambil dari penderita anak yang didiagnosis sebagai malaria.• Hasil FBC anak-anak usia di bawah 12 tahun.• Data demografis dan beratnya penyakit berdasarkan kriteria WHO 2000. 5
  6. 6. MetodeMikroskopik Cell-Dyn 3000® - Hitung pigment- Σ lekosit/µl containing 120 µl diencerkan 78 µl dikalikan darah (1:51) dihitung 1.529 monocytes (dalam 1 (PCM) dalam eritosit & sampai jam setelah batas 100 monosit diambil) dilisiskan dianalisis 10.000 -Hitung pigment- containing granulocytes - 5 bagian hitung jenis lekosit (PCN) dalam - Prinsip multi-angle-polarized-scatter-separation (M.A.P.S.S.®) 200 granulosit - Setiap perhitungan, diperoleh 1 data di antara 256 saluran. -Pewarnaan Giemsa hapusan - Dataset disimpan sementara dalam daftar modus, diproses, didapatkan hasil FBC, dan ditampilkan dalam bentuk grafik di darah tebal. monitor. - Hanya menampilkan 5000 perhitungan pertama pada grafik. 6
  7. 7. Gambar , plot granularitas/lobularitas Cell-Dyn 3000®.Biru: limfosit, ungu: monosit, jingga: granulosit, hijau: eosinofil (atau "mis- classified” ganulosit yang mengandung Hz). 7
  8. 8. Metode• Area kiri dan atas yang biasanya merupakan area populasi eosinofil ternyata tidak mengandung eosinofil pada anak yang tidak menderita malaria. Sedangkan pada anak yang menderita malaria, area tersebut berisi titik hijau yang menunjukkan adanya PCN. 8
  9. 9. Metode• Derajat depolarisasi yang lebih tinggi disebabkan oleh banyaknya jumlah Hz yang difagosit atau kristal Hz yang lebih besar, kemungkinan berkaitan dengan beratnya penyakit. 9
  10. 10. Metode• Untuk uji hipotesa ini, dua indeks berat penyakit untuk mengukur derajat depolarisasi: (i) jumlah nilai sumbu y monosit dan granulosit yang mengandung Hz (ii) jumlah nilai sumbu y setelah perhitungan matematika (akar dan logaritma nilai sumbu y).• Indeks ini menjelaskan manfaat nilai cut-off untuk membedakan malaria yang berat dan tidak berat. 10
  11. 11. Metode• Data dianalisis dengan software SPSS 14.0.• Uji data kuantitatif menggunakan t-test sampel tidak berpasangan dengan varians tidak sama.• Uji data kualitatif menggunakan chi-square. 11
  12. 12. Hasil368 anak (54% , 46% )152 malaria falciparum (>88% >1thn)216 anak yang sehat atau menderita penyakit lain (99,1% <1thn)152 anak dengan malaria 48 malaria berat: a. 15 kasus anemia berat, b. 13 kasus hiperparasitemia, c. 3 kasus hipoglikemia, d. 17 kasus malaria serebral (3 kasus malaria serebral + anemia berat) 12
  13. 13. 13
  14. 14. 14
  15. 15. Kurva Receiver-Operator-Characteristic (ROC) :Area Under Curve (AUC) hitung trombosit (0,97), PCM (0,97), PCN (0,91) untuk diagnosis malaria (0,5-0,7:akurasi rendah, 0,7-0,9:akurasi sedang, >0,9:akurasi tinggi) 15
  16. 16. HasilCut-off 250.000 trombosit/µl: sensitifitas 92% dan spesifisitas 93%, cut-off 150.000 trombosit/µl: sensitifitas 66% dan spesifisitas 99%≥ 1 titik ungu (PCM) di atas garis ambang batas memberikan sensitifitas 96% dan spesifisitas 96%.Titik hijau (PCN) di area analisis memberikan sensitifitas 85% dan spesifisitas 96%.Kombinasi keduanya memberikan sensitifitas 97% dan spesifisitas 93%. 16
  17. 17. Mikroskopis: Pemeriksaan 200 granulosit dan 100 monosit dalam hapusandarah tebal pewarnaan Giemsa. Cell-Dyn 3000® mean analisis 4,175granulosit (rentang: 800–8.830) dan mean 1,364 monosit (rentang: 230–3.660).P = chi square test, NS: not significant (>0,05) 17
  18. 18. HasilKesulitan identifikasi PCL mikroskopis dengan hapusan darah tebal: sulit menentukan morfologi sel yang disebabkan oleh proses pewarnaan , sulit membedakan granulosit dan monosit.Tidak dimasukkan dalam analisis statistik: PCM: 4 kasus (PCM > 100)  malaria serebral (185), anemia berat (169), hipoglikemia (127), dan malaria tidak berat (109). PCN: 2 kasus (PCN > 50)  malaria serebral (66 dan 75 PCN). 18
  19. 19. Automated detection of Hz-containing leukocytes and disease severity. Scatterplotsof (a) purple coded events (PCM, Hz-containing monocytes) and (b) green coded events(PCN, Hz-containing granulocytes) distribution in children with non-severe and severemalaria (left two colums), and in three subgroups of severe malaria (severe anaemia,cerebral malaria and hyperparasitaemia, right three colums). Solid bar represents mean,dashed bars 95% confidence interval about the mean for the standard error. See text for19outliers that were removed.
  20. 20. Hasil• Perbedaan tingginya PCM pada malaria berat (mean: 25,4) dengan malaria tidak berat (mean: 19,3)  tidak signifikan (p = 0,14).• PCM pada kelompok anemia berat (mean: 39,9) > malaria serebral (mean: 23,3) dan hiperparasitemia (mean: 14,8). 20
  21. 21. Hasil• Pada PCN, terdapat perbedaan signifikan (p < 0,0001) antara kelompok malaria berat (mean: 15,7) dan malaria tidak berat (mean: 7,5).• Perbedaan sedikit lebih tinggi pada kelompok malaria serebral (mean: 18,0) daripada anemia berat (mean: 15,3) dan hiperparasitemia (mean: 16,3). 21
  22. 22. Hasil• Jumlah lekosit yang mengandung Hz: - distribusi lebar - tumpang tindih antara kelompok malaria berat dan tidak berat. - hasil kurva ROC komputer menunjukkan AUC untuk PCM sebesar 0,62 dan PCN sebesar 0,75 yang berarti akurasi uji (berat & tidak berat) tersebut rendah. 22
  23. 23. HasilDepolarisasi biru (limfosit):  77 dari 152 (51%) pada anak dengan malaria, mean: 4,2 (rentang: 3-24).  Lebih sering pada anak dengan anemia (11/14). 23
  24. 24. DiskusiPerbedaan usia• kelompok malaria (mean: 3,7 thn)• kelompok bukan malaria (mean: 0,6 thn)  Σ lekosit, limfosit, monosit pada anak <1thn lebih tinggi 24
  25. 25. DiskusiHb• Terendah: malaria berat, Lebih tinggi: malaria tanpa komplikasi, Tertinggi: bukan malaria. 25
  26. 26. DiskusiTrombositCut-off 150.000/µl  66% malaria teridentifikasi, spesifisitas 99%Kurva ROC: Cut-off 250.000/µl  sensitifitas 92%, spesifisitas 93%.Penelitian terbaru: Kecenderungan agregasi trombosit pada pasien malaria  trombosit terhitung rendah 26
  27. 27. DiskusiKekurangan identifikasi PCL dengan mikroskop• Hapusan darah tebal - sulit membedakan granulosit dan monosit - artefak cat  Hz kecil• Hapusan darah tipis - banyak sel  banyak waktu menghitung 27
  28. 28. DiskusiKelebihan CD 3000®• Cepat dan akurat (sensitifitas & spesifisitas >90%)• Deteksi pasien PCL positif lebih banyak daripada mikroskopik (terutama PCN). 28
  29. 29. 29
  30. 30. DiskusiJumlah PCM berbeda antara kelompok malaria berat dan yang tidak berat.PCN lebih banyak pada malaria berat terutama pada malaria serebral.PCN sebagai petanda malaria lebih inferior dibanding PCM, kemungkinannya: - titik granulosit, - waktu paruh hidup lebih pendek dari monosit, - Σ PCN < PCM (malaria tidak berat) 30
  31. 31. 31
  32. 32. DiskusiKeterbatasan• Perbedaan usia  sulit bandingkan parameter FBC.• Hanya menampilkan 5000 sel meskipun dapat mendeteksi PCL lebih banyak, karena: - batas 5000 sel pertama - hilang saat transformasi “screen shot”. 32
  33. 33. DiskusiKeterbatasan…• Faktor kehilangan ini sebesar 5 kali dengan 5000 perhitungan yang digunakan untuk membentuk grafik pada layar.• Diperlukan konfirmasi dengan anti-CD14 dan anti-CD16 antibodi. 33
  34. 34. DiskusiPenemuan baru• Adanya titik biru depolarisasi tinggi mirip limfosit.• Sel ini merupakan sel fagosit (lebih kecil, dengan rasio inti/sitoplasma >>, inti lebih bulat, seperti NK cell atau sel fagosit darah tepi).• Perlu penelitian lebih lanjut (flow cytometry) untuk penjelasan dan peranannya dalam patofisiologi malaria. 34
  35. 35. KesimpulanHitung jumlah trombosit baik untuk diagnosis malaria (kelompok usia).PCL lebih mudah dideteksi dengan laser- flowcytometry.Penemuan Hz untuk diagnosis dan penentuan berat penyakit. 35
  36. 36. KesimpulanKeterbatasan penentuan prognosis  tumpang tindih jumlah PCL malaria berat dan yang tidak berat; kemungkinan: - algoritma pendeteksian yang tidak sesuai, - hilangnya data saat proses. 36
  37. 37. Terima kasih Gabon 37
  38. 38. Pembentukan hemozoin plasmodium St.merozoit Monomeric α- Biokristalisasimencerna Hb hematin (toksik) Inert β-hematin Heme-polymerase crystal (hemozoin) Back 38
  39. 39. Figure. Plasmodium sp. infection generallyappears as intracellular merozoites,forming one to several rings within infectederythrocytes. Gametocytes (left margin)are seen infrequently. 39
  40. 40. Malaria is transfered bymosquitoesParasites invade red bloodcellsProliferation of parasites insidered blood cellsDegradation of hemoglobin tomalaria-pigment hemozoin(crystalline, birefringent)Destruction of red blood cellsand release of parasites release of hemozoin Development of Plasmodium vivaxUptake of hemozoin by white (Tropen und Reisemedizin, Jürgenblood cells: Knobloch, Gustav Fischer Verlag)neutrophilic granulocytes,monocytes 40
  41. 41. 41
  42. 42. Amberintracytoplasmichemozoin(arrows)visualizedby lightmicroscopy withinapolymorphonuclear cell in a case ofsevere malariawithhyperparasitemia Back 42
  43. 43. Microscopic bright field image of amonocyte with inclusion of malariapigment. Inset: polarisation - microscopicimage of the hemozoin - inclusion Back 43
  44. 44. Back 44
  45. 45. Siklus hidup plasmodium pada manusia Skizon hati (berisi Sporozoit Tropozoit hati merozoit) Merozoit Skizon eritrosit Tropozoit eritrosit menginfeksi(berisi merozoit) eritrosit Merozoit Sebagian menginfeksi membentuk eritrosit lain gametosit ( & ) 45
  46. 46. Hubungan Hz dengan anemia• Hz is intensely biologically active and catalyzes the formation of free radicals through repeated redox cycles initiated by the Fe (III) moiety. The effect of Hz may be reproduced by equivalent amounts of synthetic and hematin, and it seems likely that intracellular or membrane-bound Hz in contact with erythroid cells causes cellular dysfunction and oxidative damage (Abigail Lamikanra, Taco Kooij, and David Roberts, manuscript submitted). 46
  47. 47. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis dan anemia• Endoperoxides produced in HCMs may impair erythroid growth.• Hz directly inhibits erythropoiesis independently from TNF-α, and that Hz and TNF-α have additive effects on the development of erythroid cells.• Proinflammatory cytokines, in particular TNF- α, have been thought to be the major cause of bone marrow dysfunction. 47
  48. 48. TNF-α• Reseptor: TNFR-I (CD 120a), TNFR-II (CD 120b)• Merangsang: proliferasi sel, apoptosis, netrofil untuk memfagosit• Diproduksi oleh makrofag, monosit, limfosit, sel mast, netrofil, keratinosit, astrosit, mikroglia, otot polos, & sel tumor.• Berperan pada keganasan dan infeksi parasit. Back 48
  49. 49. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis dan anemiaThe proportion of monocytes that contain Hz probably reflects the total amount of Hz produced during infection, and may also reflect the degree of deposition of Hz in the bone marrow, stromal cells, and hematopoietic cells.The bone marrow sections from children who died with severe malaria show gross dyserythropoiesis. Significant association between the quantity of Hz and the proportion of erythroid cells that was abnormal. These findings are consistent with a direct inhibitory effect of Hz on erythropoiesis. 49
  50. 50. Representative sections of bone marrow from children with severe malarial anemia. (A-C) Highly abnormal erythropoiesis (irregular, bi-, and multinucleated erythroid cells) in association with Hz (arrows). (D) Hz predominantly inside myeloid cells (hematoxylin and eosin staining; original magnification, x 1000). Back 50
  51. 51. Hubungan Hz dengan diseritropoiesis dan anemia• Elevated nitric oxide production in children with Malaria Anemia is associated with decreased hemoglobin concentrations and that hemozoin can induce NO synthase 2 - derived NO formation in cultured blood mononuclear cells. Back 51
  52. 52. Trombositopenia pada malaria• The thrombocytopenia that complicates at least some malarial infections is caused by immune mechanisms; specific IgG binds to platelet-bound malaria antigen through the Fab portion of the immunoglobulin molecule.• Hipersplenism• Agregasi trombosit Back 52
  53. 53. The 2000 WHO criteriaSevere malaria is defined as: the presence of P. falciparum on thick smear and at least one of the following clinical or biological criteria : coma (Blantyre coma scale ≤ 2), impaired consciousness (Blantyre >2 and < 5), repeated convulsions (≥ 2/24 hours), prostration, respiratory distress, jaundice, metabolic acidosis (bicarbonates < 15 mmol/L), severe anaemia (Hb < 5 g/dL or Ht < 15%), hyperparasitaemia (parasitaemia > 4%), macroscopic haemoglobinuria, renal failure, collapse (TAS < 60 mmHg before 5 years of age), abnormal bleeding, or pulmonary oedema (X-ray criterion). Back 53
  54. 54. Blantyre coma scale (anak)Gerakan bola mata mata terarah 1 tidak terarah 0Respon verbal menangis normal 2 merintih 1 tidak terarah 0Respon gerakan respon lokal terhadap rangsang nyeri 2 menarik tungkai karena rangsang nyeri 1 non spesifik atau tidak ada reaksi 0 54
  55. 55. Pemeriksaan malaria• Mikroskop - ada tidaknya parasit - spesies & stadium plasmodium - kepadatan parasit: * semi kuantitatif * kuantitatif Σ parasit/1000 eri (persentase) x Σ eri (µl)  tipis Σ parasit/200 leko x Σ leko (µl)  tebal 55
  56. 56. Pemeriksaan malaria• Tes diagnostik cepat - HRP-2 (Histidine rich protein 2) - Enzim parasite lactate dehydrogenase (p- LDH) dan aldolase 56
  57. 57. 1. Focus Laser Beam (λ: 632,8 nm), 2. 0˚ Scatter (cell size), 3. 10˚ Scatter (cell complexity), 4. 90˚ Scatter (lobularity), 5. 90˚D Scatter (granularity) 57
  58. 58. Back 58
  59. 59. Microscopic images of cells (a,b: PCM; c: neutrophilic granulocyte) of a malaria patient sorted from the regionsdepicted in the bivariate side scatter plots (d,e). a– c: Birefringence of the dark hemozoin inclusions was proved by polarization microscopy and included as insets in each image. The corresponding area is indicated by a rectangle. f,g: Corresponding scatter plots of a blood sample of a malaria-negative person. Ly, lymphocytes; M, Back 59 monocytes; Gn, neutrophilic granulocytes; Ge, eosinophilic granulocytes.
  60. 60. Metode• Monosit dan granulosit yang mengandung Hz berupa titik plot pada grafik granular – lobular.• Bila tidak ada data daftar modus, maka menggunakan screenshot.• Wilayah plot granularitas/lobularitas diubah menjadi bitmap image dengan resolusi maksimal 140x140 piksel dan analisa dengan program ImageJ. 60
  61. 61. MetodePlot Granularitas/lobularitas Cell-Dyn 3000®:Plot lobularitas pada sumbu x dengan side-scatter 90°Plot granularitas pada sumbu y dengan depolarisasi scatter 90°Komputer pada alat membuat garis dinamis yang memisahkan antara granulosit (jingga) dan eosinofil (garis 1a).Area analisis monosit yang mengandung Hz: - Titik ungu diatas garis abu-abu (1a), - Titik ungu diatas garis abu-abu horisontal 5 piksel dari dasar (1b). Area analisis granulosit yang mengandung Hz: sekitar garis hitam (2) Area analisis kode-biru depolarisasi: di atas garis hitamGambar plot 10 piksel dari garis dasar (3). 61
  62. 62. Monocytes, which accumulated the birefringent, malaria pigment hemozoin, adegradation product of the parasites, are characterized by high intensity indepolarized side scatter. pigment-corrying monocytes appear in the regionindicated as PCM, Eosinophilic granulocytes and neutrophilic granulocytes aredesignated as Ge and Gn 62
  63. 63. Granularity-versus-lobularity plot of a Cell-Dyn 3000 series full-blood count analyzer. a: Patient without malaria. b: Patient withPlasmodiumfalciparum malaria showing the typical appearance of hemozoin-containing monocytes in the eosinophil area. Back 63
  64. 64. Malaria cerebral Diffuse encephalopathy where focal neurological signs are unusual Convulsions are usually generalised but are occasionally focal EEG has non-specific changes CT / MRI show mild cerebral swelling (cerebral oedema is rare) Un-arousable coma with the best motor response being non- localising (GCS M1-4) and the best vocal response being incomprehensible (V1-2) Mild neck stiffness Neck retraction Retinal haemorrhages but the pupils are normal Disorders of conjugate gaze are common Extensor posturing UMN or LMN lesions may be found. 64
  65. 65. Malaria cerebral in children Coma persists more than 30 minutes after a convulsion Convulsions can continue after the onset of coma Noisy and laboured breathing Cold, clammy skin with a core-to-skin temperature difference of >100C may be seen Shock, with the systolic pressure below 50 mm Hg Extreme opisthotonus (bent-like-a-bow) posture, mimicking either tetanus or meningitis. Symmetrical upper motor neuron and brain stem disturbances including disconjugate gaze, decerebrate and decorticate postures Corneal reflex and Dolls eye may be absent Bac k 65
  66. 66. Hasil• Nilai mean usia anak dengan malaria berat (3,8 thn) dan malaria tidak berat (3,4 thn) tidak berbeda signifikan (p=0,27)• Parameter FBC berbeda signifikan kecuali perhitungan eosinofil antara anak dengan malaria dan anak tanpa malaria.• Jumlah trombosit lebih rendah pada anak dengan malaria (65% < 150.000/µl) dan tumpang tindih di antaranya sangat kecil. 66
  67. 67. Hasil• Pada anak dengan malaria, jumlah lekosit sedikit lebih tinggi pada malaria berat• Perbedaan signifikan secara statistik hanya pada jumlah total lekosit dan jumlah netrofil• Hemoglobin lebih rendah pada malaria berat• Tidak ada perbedaan jumlah trombosit 67
  68. 68. Hasil• Tidak ada perbedaan signifikan antara dua garis batas (gambar 1, garis 1a dan 1b) dengan parameter PCM/PCN. Analisis semua bagian menggunakan garis horisontal (1b). 68
  69. 69. DiskusiTrombosit• Lebih tinggi terutama pada anak yang lebih muda namun interval antara nilai terendah dan tertinggi lebih lebar. 69
  70. 70. Back 70
  71. 71. Diskusi (metode)• CD 3000® berpotensi besar dalam kecepatan, keakuratan pendeteksian, enumerasi PCL untuk mengidentifikasi lebih banyak sampel PCL-positif dan presisi lebih baik daripada secara mikroskopis.• Sulit melakukan enumerasi PCL mikroskopik pada pewarnaan Giemsa hapusan darah tebal atau tipis.• Pewarnaan sering meninggalkan artefak yang mengganggu penglihatan dan mudah salah 71
  72. 72. Diskusi (metode)Pemeriksaan dengan mikroskop polar/lapangan gelap mudah dan tidak mahal namun sejauh ini tidak ada penelitiannya.Dengan hapusan darah tipis meghabiskan banyak waktu untuk menyaring setiap sel.Penelitian lain mengamati keterbatasan jumlah monosit dan granulosit untuk mengidentifikasi sel yang mengandung Hz dan menunjukkan hasil dengan impresisi yang signifikan pada hasil hitung jenis 100 sel secara manual. 72
  73. 73. Diskusi (PCL)• Granulosit akan aktif memfagosit pada malaria berat yang mengandung lebih banyak Hz; yang merupakan penjelasan PCN merupakan petanda inferior malaria, dimana jumlahnya pada malaria yang tidak berat lebih sedikit daripada PCM.• Pengamatan ini pernah dikemukan pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan metode mikroskopis, namun hasilnya sangat berbeda. 73
  74. 74. Diskusi (PCL)• Persentase pasien malaria berat pada penelitian sebelumnya, variasi PCM: 65-85% , PCN: 37-85%• Dapat disebabkan: - perbedaan populasi penelitian, - sulitnya memberikan hasil yang baik dengan mikroskop cahaya. 74
  75. 75. Diskusi (PCL)• Penelitian lain melakukan hitung PCL berdasarkan asumsi hitung lekosit 7.500 atau 8.000/µl sedangkan pada penelitian ini, rata- rata perhitungan lekosit antara malaria berat dan yang tidak berat berbeda lebih dari 2.000/µl, dan hasil perhitungan absolut akan sangat berbeda bila perhitungan lekosit yang asli dikerjakan. 75

×