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Endoglin negatively regulates transforming growth factor β1 induced

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Endoglin negatively regulates transforming growth factor β1 induced

  1. 1. Expositor: Ana María Rincón G. <ul><li>P.R.O Connell </li></ul><ul><li>ENDOGLIN NEGATIVELY REGULATES TRANSFORMING GROWTH FACTOR β 1-INDUCED PROFIBROTIC RESPONSES IN INTESTINAL FIBROBLASTS </li></ul>
  2. 2. INTRODUCTION
  3. 3. INTRODUCTION <ul><li>TRANSFORMING GROWTH FACTOR β 1: </li></ul><ul><li>Transforming growth factor beta 1 or TGF-β1 is a polypeptide member of the transforming growth factor beta superfamily of cytokines. It is a secreted protein that performs many cellular functions, including the control of cell growth, cell proliferation, cell differentiation and apoptosis. </li></ul>
  4. 4. INTRODUCTION <ul><li>In humans, TGF-β1 is encoded by the TGFB1 gene. </li></ul><ul><li>Fibroblasts from fibrotic tissues for example show an increased expression of TGF-β1, which mediates process such as the excessive production of collagen as well as its regular contraction. </li></ul>
  5. 5. INTRODUCTION <ul><li>ENDOGLINS: </li></ul><ul><li>Endoglin is a type I membrane glycoprotein located on cell surfaces and is part of the TGF beta receptor complex. It is specifically the type III TGF-β receptor that negatively regulates certain aspects of cellular responsiveness to TGF-β1. </li></ul>
  6. 6. INTRODUCTION <ul><li>The protein consists of a homodimer of 180 kDA with disulfide links. It has been found on endothelial cells, activated macrophages, fibroblasts, and smooth muscle cells. </li></ul>
  7. 7. INTRODUCTION <ul><li>CROHN ¨S DISEASE (CD): </li></ul><ul><li>Disease that results from a complex interplay between genetic, immunological and microbial factors. </li></ul><ul><li>It is characterized by segmental transmural chronic inflammation of the intestine, sometimes granulomatous. </li></ul>
  8. 8. INTRODUCTION <ul><li>In the course of the disease may occur also extraintestinal lesions: uveitis, sclerosing cholangitis and amyloidosis. </li></ul><ul><li>Crisis evolves by diarrhea, fever and abdominal pain. </li></ul>
  9. 9. INTRODUCTION <ul><li>RELAY BETWEEN TRANSFORMING GROWTH FACTOR β 1, ENDOGLING AND CD: </li></ul><ul><li>Crohn disease is characterized by a recurrent intestinal strictures formation. The cytokine, transforming growth factor (TGF- β1 ) is critical to this process, because it is overexpressed in the intestinal fibroblasts and produces excess collagen and improves the ability to contract and reorganized collagen. </li></ul>
  10. 10. INTRODUCTION <ul><li>Endoglin is a TGF-β1 receptor and it is over expressed too and normally cause a negatively regulation on certain aspects of cellular responsiveness to TGF-β1, therefore the control role of regulation the fibrosis process is decreased so there is the strictures formation. </li></ul>
  11. 11. GENERAL OBJECTIVE <ul><li>The aim of this study was characterize endoglin expression in fibroblasts present in areas of strictured bowel in patients with CD and to explore the function of endoglin on TGF- β1 –mediated intestinal fibroblast activation by using plasmid-mediated overexpression and interference RNA-based approaches. </li></ul>
  12. 12. MATERIALES Y METODOS
  13. 13. MATERIALES Y METODOS <ul><li>CULTIVO: </li></ul><ul><li>Los cultivos de fibroblastos intestinales fueron establecidos usando una técnica primaria de explante en 18 pacientes con Enfermedad de Crohn y en pacientes control. </li></ul><ul><li>La biopsia fue tomada de sitios estenoticos y de otros sitios adyacentes macroscópicamente normales. </li></ul><ul><li>Las células confluentes fueron caracterizadas por sus características morfológicas y propiedades inmunohistoquimicas de tinción. </li></ul>
  14. 14. MATERIALES Y METODOS <ul><li>EXPRESION DE PROTEINAS: </li></ul><ul><li>Una vez confluentes los fibroblastos fueron aislados por tripsinizacion y la expresión de endoglina fue evaluada usando la técnica de citometría de flujo, utilizando como marcador un anticuerpo anti-endoglina. </li></ul>
  15. 15. MATERIALES Y METODOS <ul><li>WESTERN BLOT: </li></ul><ul><li>Es una técnica mediante la cual las proteínas procedentes de extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según su tamaño, utilizando SDS previamente para su disolución. </li></ul>
  16. 16. MATERIALES Y METODOS <ul><li>Tras la electroforesis las proteinas se transfieren a un filtro q se incuba con anticuerpos que reaccionan con la proteina de interes, permitiendo esto la identificacion de la proteina buscada. </li></ul>
  17. 17. MATERIALES Y METODOS <ul><li>CRISTAL VIOLETA: </li></ul><ul><li>Fibroblastos de control intestinal se cultivaron en placas de 24 a 70% de confluencia, se privaron de suero por 24 horas y luego se incubaron con TGF- β1 por 24 horas. </li></ul><ul><li>Se lavaron posteriormente y se incubaron con cristal violeta, se solubilizaron y se analizo su absorbancia. </li></ul>
  18. 18. MATERIALES Y METODOS <ul><li>MICROSCOPIA CONFOCAL: </li></ul><ul><li>La microscopia confocal es una técnica de imagen óptica utilizada para aumentar la resolución óptica y el contraste de una micrografía utilizando una iluminación de punto y un agujero espacial para eliminar de foco de luz en los especímenes que son más gruesas que el plano focal . </li></ul>
  19. 19. MATERIALES Y METODOS <ul><li>LUCIFERASA: </li></ul><ul><li>Celulas CCD-18Co. </li></ul><ul><li>El promotor-reportero del elemento de fijacion a SMAD fue transfectado. </li></ul><ul><li>La luciferasa-reportero fue cotransfectada para corregir la variacion por la transefeccion. </li></ul><ul><li>Las celulas fueron tratadas con TGF- β1 . </li></ul>
  20. 20. MATERIALES Y METODOS <ul><li>TRANSFECCION: </li></ul><ul><li>La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas para la transferencia. </li></ul><ul><li>Utilización de si ARN y plásmido para el análisis de la expresión de endoglina. </li></ul><ul><li>El si ARN disminuye la expresión de endoglina. </li></ul><ul><li>El plásmido hace una mediación de up regulation en la expresión de endoglina </li></ul><ul><li>Celulas CCD18Co tratadas con ADN plasmidico. </li></ul>
  21. 21. MATERIALES Y METODOS <ul><li>COLAGENO: </li></ul><ul><li>La adición de colágena tipo I a los fibroblastos flotantes libres permite observar el efecto del plásmido y el SBE en la función del TGF- β1 , el cual normalmente aumenta la contracción del gel de colágena mediada por fibroblastos. </li></ul>
  22. 22. RESULTADOS
  23. 23. RESULTADOS
  24. 24. RESULTADOS
  25. 25. RESULTADOS
  26. 26. RESULTADOS
  27. 27. RESULTADOS
  28. 28. DISCUSSION AUTOR OPINION SI NO Leask A et al ¨A number of reports have identified a negative regulatory role for endoglin in TGF- β1 signalling¨ Perez-Gomez E et al ¨Knock of endoglin in keratinocytes enhances smad-2 and smad-3 phosphorilation¨
  29. 29. CONCLUSION <ul><li>This kind of estudies are so important to detect which factores worse the condition of specific disease. </li></ul><ul><li>Determinating the molecules that interfere positively in crisis process of diseases, the molecular biology could look for a way to stimulate specific molecules for a new treatment. </li></ul>
  30. 30. CONCLUSION <ul><li>Inhibiting the role or harmful molecules in some process, science could avoid many traumatic effects implicated in specific diseases. </li></ul><ul><li>Molecular biology methods are so importants and useful in the detection of key steps in the pathophysiology of many diseases. </li></ul>

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