Practicas microbiologia general

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Guión practicas de microbiologia

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Practicas microbiologia general

  1. 1. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL 2º de Grado de Biología Almudena Fernández Villadangos
  2. 2. PRÁCTICA 5: BIOENSAYO (análisis de resultados). 1. Medir el diámetro de cada halo (mm). 2. Hacer recta patrón representando diámetro de halo (abcisas; eje X) frente a log10 de la concentración de antibiótico (ordenadas; eje Y). 3. Estimar la concentración de la solución problema de penicilina G de forma gráfica o matemáticamente
  3. 3. PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados). 1.Medir el diámetro de cada halo (mm): >15 mm microorganismo sensible <13 mm microorganismo resistente Bacitracina (Gram+) Ampicilina (Gram + y algunas Gram -) Kanamicina (Gram + y -) E. coli (Gram -) B. subtilis (Gram +) Entre 13-15 mm: zona de incertidumbre (resultado no definitivo) RESULTADOS EN COMÚN! DISCUSIÓN!
  4. 4. PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados). El tamaño del halo puede estar influido por: (i)el medio de cultivo: composición; temperatura de incubación. (ii)la estabilidad del antibiótico; (iii)La difusión del antibiótico en medio: grosor; % agar; volumen de antibiótico; tamaño molecular. (iv)Microorganismo: cantidad de inóculo microbiano; sensibilidad al antibiótico.
  5. 5. PRÁCTICA 7: TITULACIÓN DE FAGOS (análisis de resultados). 1. Identificar los halos de lisis. 2. ¿Cómo ha sido la siembra? Homogénea, heterogénea,… 3. Elegir las placas de cultivo que tengan entre 30-200 halos para el análisis y contamos los halos. 4. Calcular los títulos de la solución problema del fago λ: Título viral (UFP/ml) promedio del número de placas de lisis (UFP) 0.1 ml x dilución= 5. Resultados en común y discusión: ¿Dónde hay más halos en LE392 + o -?
  6. 6. PRÁCTICA 8: PRUEBAS BIOQUÍMICAS Objetivos: - Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas. - Entender su utilidad. - Visualizar los distintos resultados. - Interpretar los resultados. - Identificar microorganismos con pruebas miniaturizadas. Pruebas bioquímicas: -Se utilizan para la identificación, principalmente, de enterobacterias (Gram -; de interés clínico) viendo una serie de pruebas fenotípicas y genotípicas y comprobando con las ya clasificadas. - En las reacciones bioquímicas se detectará la existencia de una enzima en concreto o una vía metabólica.
  7. 7. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons. INDOL Fundamento: detección de actividad triptofanasa (triptófano como funte de C o N) Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido “caldo Indol” (medio con peptonas y triptófano al 1%). Triptofanasa: Trp  piruvato + amoniaco + indol El indol se pondrá de manifiesto por la acción del reactivo de Kovacs [alcohol isoamílico, para-dimetilamino-benzaldehido (PDAB) y ácido clorhídrico]. Realización de la práctica: Añadir 6-8 gotas de reactivo de Kovacs para detectar la presencia de indol en el medio. Positiva: un producto coloreado (rosindol) se manifiesta como un anillo rojo en la superficie del caldo.
  8. 8. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons. RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer) Fundamento: detección de fermentaciones. Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido diferencial “caldo RMVP” (favorece los procesos fermentativos a partir de la glucosa; peptonas, glucosa, fosfato a pH7). Prueba Rojo de metilo: Detecta la realización de una fermentación ácido mixta (acidos: fórmico, acético, láctico y butírico); mediante la detección de ácidos. Prueba Voges-Proskauer: Detecta la realizacion de una fermentación butiliendiólica o butilenglicólica; mediante la detección de la producción de acetoína (intermediario de la fermentación butiliendiólica o butilenglicólica). La reacción positiva en una de estas pruebas implicará negatividad en la otra reacción para el mismo microorganismo.
  9. 9. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons. Realización de la práctica: RM Añadir 5-7 gotas de rojo de metilo (indicador de pH) para detectar el cambio de pH del medio. Positiva: el medio cambia de color a rojo. [Mediante el rojo de metilo se detectará la producción de ácidos (fermentación ácido mixta) que bajan el pH hasta 4] RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer) Realización de la práctica: VP Añadir 8-10 gotas de KOH 40% (para subir el pH) y 5 gotas de α-naftol 5%. Agitar suavemente. Positiva: el medio cambia de color a rosa-rojizo. (en alcalinidad y con oxígeno la acetoina se oxida a acetilo, el cual con α-naftol se observa con un tono rosa-rojizo)
  10. 10. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons. CITRATO Fundamento: detección de actividad citrato permeasa (capacidad de introducir el citrato al interior de la célula) y saber si utiliza citrato como fuente de carbono: Citrato  CO2 + AcetilCoA + NH4 Creceremos el microorganismo en estudio en un medio “agar citrato Simmons” (medio con citrato como única fuente de carbono, azul de bromotimol y fosfato amónico pH6.8). Realización de la práctica: Realizar una siembra en estría que cubra toda la placa a partir del eppendorf con E. coli o E. aerogenes. Crecer 30ºC 24 horas. Positiva: crecimiento y cambio de color a azul (se introduce el citrato en las células y se alcaliniza el medio: NH4). Negativo: no crecimiento y no cambio de color (verdoso).
  11. 11. Prueba de la CATALASA: Fundamento: detección de actividad catalasa. catalasa: H2O2  H2O + O2 Realización de la práctica: Forma I: 1.Coger 30 μl del eppendorf con E. coli o E. aerogenes y añadirlos en un porta. 2.Añadir una gota de agua oxigenada. Forma II: 1.Añadir 6-8 gotas de agua oxigenada sobre la placa petri donde se encuentra el miroorganismo Proteus mirabilis. Positiva: salen burbujas (liberación de oxígeno).
  12. 12. Prueba API20E: Fundamento: Es un sistema rápido de identificación de bacterias que consta de una serie de análisis bioquímicos equivalentes a los indicados anteriormente y muchos otros que se realizan de forma miniaturizada en cada uno de los pocillos de la tira de API. Sistema rápido, eficaz, permite hacer diferentes pruebas bioquímicas a la vez. Hay diferentes tipos de tiras API, por lo que necesitamos saber de antemano si el microorganismo a identificar es Gram + o -, y su grupo bacteriano.
  13. 13. Prueba API20E: Fundamento: El sistema API20E es específico para enterobacterias (gram-): con 20 microtubos o pocillos con sustratos deshidratados para 20 pruebas bioquímicas y E de Enterobacterias. El resultado genera un número (API Profile Index) de 7-9 dígitos que se incorpora a una base de datos que nos dará una identificación microbiológica. Number 1044552 --- Escherichia coli
  14. 14. Prueba API20E: Realización de la práctica: 1.Resuspender en 5ml de NaCl 0.9% una colonia de 2-3 mm: asa de siembra y mechero. 2.Rellenar los pocillos de la base del envase con agua sin que rebose (mantener humedad). 3.Rellenar con la suspensión microbiana todos los pocillos de izquierda a derecha, hasta la cúpula, sin que aparezcan burbujas. 4.Rellenar con la suspensión microbiana la cúpula de las pruebas CIT, VP y GEL. 5.Rellenar con aceite mineral las cúpulas de las pruebas ADH, 2DC, ODC, H2S y URE (condiciones anaerobias). 6.Cerrar, rotular e incubar a 37ºC 24 horas. Material: -Tubo 10ml. - Asa de siembra. -Solución salina. -Placa con colonias aisladas: E. coli, E. aerogenes o P. mirabilis. -Agua milli Q. -Aceite mineral.

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