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Inmunocitoquímica

En este trabajo presentamos los métodos inmunocitoquímicos en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Protoclos, formatos de serotecas etc.

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Inmunocitoquímica

  1. 1. INVESTIGACIONES APLICADAS Dr. Aleida Villa Espinosa. www.aleidavillaespinosa.com
  2. 2. IntroducciónIntroducción La inmunocitología son los estudios que se realizan a nivel celular empleando laLa inmunocitología son los estudios que se realizan a nivel celular empleando la reacción antígeno- anticuerpo que se enmarcan en el ámbito de lareacción antígeno- anticuerpo que se enmarcan en el ámbito de la inmunopatología.inmunopatología. • Identificación morfológica de células eucariotas y protocariotasIdentificación morfológica de células eucariotas y protocariotas • Identificación y caracterización de células tumoralesIdentificación y caracterización de células tumorales • Estudios del ciclo celularEstudios del ciclo celular • Apoptosis celularApoptosis celular • Estudios del citoesqueletoEstudios del citoesqueleto • Estudios de organelosEstudios de organelos • Carga antigénica tanto propia como extrañasCarga antigénica tanto propia como extrañas • Estudios de citoquinas y otrosEstudios de citoquinas y otros En el campo de las enfermedades infecciosas constituye una herramienta útilEn el campo de las enfermedades infecciosas constituye una herramienta útil para el clínico y el epidemiologo ya que amplia las posibilidades de investigaciónpara el clínico y el epidemiologo ya que amplia las posibilidades de investigación y diagnóstico de los animales vivos con pequeñas muestras en corto tiempo.y diagnóstico de los animales vivos con pequeñas muestras en corto tiempo. Existe un gran número de moléculas para optimizar la detección de un analitoExiste un gran número de moléculas para optimizar la detección de un analito particular a nivel celular. En el mismo nivel se incluyen los fluorocromos, lasparticular a nivel celular. En el mismo nivel se incluyen los fluorocromos, las enzimas, la biotina y el oro entre otros.enzimas, la biotina y el oro entre otros. www.aleidavillaespinosa.cowww.aleidavillaespinosa.co mm
  3. 3. MuestrasMuestras • Fluidos corporales.Fluidos corporales. • Cepillados y raspados.Cepillados y raspados. • Hisopos con medio de transporte.Hisopos con medio de transporte. • Organos y fragmentos de tejidos.Organos y fragmentos de tejidos. • Biopsias por aspiración.Biopsias por aspiración. • LavadosLavados • Frotis e improntas superficiales.Frotis e improntas superficiales. • Extensiones sanguinéas.Extensiones sanguinéas. • HecesHeces • Sangre enteraSangre entera www.aleidavillaespinosa.com
  4. 4. Fluidos corporalesFluidos corporales – Cavidad pleural, peritonial pericardioCavidad pleural, peritonial pericardio – Fluidos fetalesFluidos fetales – Fluidos sinoviales y cerebro espinales.Fluidos sinoviales y cerebro espinales. – Semen, orina, leche y otrosSemen, orina, leche y otros - Los fluidos de cavidades corporales se aspiran con pipeta o jeringas y se ponen en un tubo con anticoagulante. - Para fluidos cerebroespinales y sinoviales es necesario PBS, o SSF. - El semen se remite fresco o congelado. Las células somáticas portadoras de Ag se extraen del semen mediante ISM - En las células somáticas de la leche podemos estudiar las infecciones que por esta vía se eliminan. La leche no debe tener conservantes ni colorantes. - En la orina podemos encontrar células inflamatorias, neoplásicas, decamación epitelial, microorganismos. Interesa sobre todo el sedimento. - Todas las muestras se deberán recoger estérilmente si se precisa aislamiento de microorganismos www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  5. 5. Cepillados, raspados e hisoposCepillados, raspados e hisopos con medios de transporte.con medios de transporte. • Son adecuados para las superficies planas y las estructuras tubulares como elSon adecuados para las superficies planas y las estructuras tubulares como el colon, el recto la pared vaginal y cervical, cavidad nasal y otroscolon, el recto la pared vaginal y cervical, cavidad nasal y otros • Los órganos revisados durante la necopsia pueden ser muestreados conLos órganos revisados durante la necopsia pueden ser muestreados con escobillones y cepillosescobillones y cepillos • Cuando se realizan con espátulas y cepillos citológicos, puede recogerse granCuando se realizan con espátulas y cepillos citológicos, puede recogerse gran cantidad de material que se debe transferir a frascos de pequeños volumenescantidad de material que se debe transferir a frascos de pequeños volumenes contentivos de SSF, PBS, Hank’s o similar.contentivos de SSF, PBS, Hank’s o similar. • Los escobillones que tienen medios de transporte no nececitan otroLos escobillones que tienen medios de transporte no nececitan otro conservante y son idóneos además para el aislamientode los microorganismosconservante y son idóneos además para el aislamientode los microorganismos www.aleidavillaespinosa.com
  6. 6. • Los órganos y fragmentos de tejidos se remiten al laboratorio refrigerados oLos órganos y fragmentos de tejidos se remiten al laboratorio refrigerados o congelados, y embalados individualmente en recipientes adecuados.congelados, y embalados individualmente en recipientes adecuados. • si los fragmentos de tejidos son muy pequeños deberán ponerse en un frascosi los fragmentos de tejidos son muy pequeños deberán ponerse en un frasco con tapa contentivo de PBS, SSF o similar, nunca en formalina.con tapa contentivo de PBS, SSF o similar, nunca en formalina. • Las biopsias por aspiración son adecuadas para masas de tejidosLas biopsias por aspiración son adecuadas para masas de tejidos debidamente localizadas y diagnosticadas en el animal vivo.debidamente localizadas y diagnosticadas en el animal vivo. • La biopsia por aspiración se realiza con agujas finas Nº 22 y jeringas de 5 ó 10La biopsia por aspiración se realiza con agujas finas Nº 22 y jeringas de 5 ó 10 ml. Debe aspirarse el material dentro de la aguja nunca en la jeringa.ml. Debe aspirarse el material dentro de la aguja nunca en la jeringa. Organos, fragmentos de tejidos yOrganos, fragmentos de tejidos y biopsias por aspiración.biopsias por aspiración. www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  7. 7. Lavados, frotis, improntas superficialesLavados, frotis, improntas superficiales y extesiones sanguíneas.y extesiones sanguíneas. • Las células pueden exfoliarse de superficies tales como la traqueobronqueal, cavidadLas células pueden exfoliarse de superficies tales como la traqueobronqueal, cavidad nasal, vagina , próstata y otros, mediante lavados con suero fisiológico estéril onasal, vagina , próstata y otros, mediante lavados con suero fisiológico estéril o similar, recogiéndose el líquido con pipetas, varillas o jeringas.similar, recogiéndose el líquido con pipetas, varillas o jeringas. • Los frotis de improntas superficiales son utiles para lesiones de tejidos blandos y laLos frotis de improntas superficiales son utiles para lesiones de tejidos blandos y la búsqueda de bacterias. Se debe escurrir el tejido sobre un porta objeto limpio, sebúsqueda de bacterias. Se debe escurrir el tejido sobre un porta objeto limpio, se dejan secar y se remiten al laboratorio envueltos individualmente.dejan secar y se remiten al laboratorio envueltos individualmente. • Las extensiones sanguineas pueden ser finas o gruesas, Las primeras se empleanLas extensiones sanguineas pueden ser finas o gruesas, Las primeras se emplean para estudiar los hematies, si se tiene práctica es ventajoso remitir los potaspara estudiar los hematies, si se tiene práctica es ventajoso remitir los potas realizados al laboratorio. Si se sospecha de hemoparásitos se realizan de la venarealizados al laboratorio. Si se sospecha de hemoparásitos se realizan de la vena marginal de la oreja preferentemente. Las extensiones gruesas sirven para estudiarmarginal de la oreja preferentemente. Las extensiones gruesas sirven para estudiar las pobaciones leucocitarias. La sangre necesita anticoagulante si no se realizan en ellas pobaciones leucocitarias. La sangre necesita anticoagulante si no se realizan en el acto de extracción.acto de extracción. www.aleidavillaespinosa.com
  8. 8. Sangre para cultivos de linfocitos y HecesSangre para cultivos de linfocitos y Heces • Los cultivos de células mononucleares son útiles para estudiarLos cultivos de células mononucleares son útiles para estudiar portadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otrosportadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otros • La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24 h. de extracción debe estar en el laboratorio.h. de extracción debe estar en el laboratorio. • Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos, microorganismos y detritus celulares. Para la recuperación ymicroorganismos y detritus celulares. Para la recuperación y concentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogenconcentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogen directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas. www.aleidavillaespinosa.com • Los cultivos de células mononucleares son útiles para estudiarLos cultivos de células mononucleares son útiles para estudiar portadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otrosportadores de infecciones, viremias, inmunidad celular y otros • La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24La sangre se recoge en tubos estériles con heparina y antes de las 24 h. de extracción debe estar en el laboratorio.h. de extracción debe estar en el laboratorio. • Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos,Las heces son una vía importante de eliminación de antígenos, microorganismos y detritus celulares. Para la recuperación ymicroorganismos y detritus celulares. Para la recuperación y concentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogenconcentración se emplea la ISM. Las muestras de heces se recogen directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.directamente del recto y se remiten en pequeños frascos o bolsas.
  9. 9. Localización de antígenosLocalización de antígenos intra y extra celularesintra y extra celulares Células presentadoras de antígenos. (CPA) Tipo celular Localización Monocitos Sangre Macrófagos Tejidos Zona marginal de macrófagos Bazo y ganglios linfáticos Células de Kupffer HígadoCPA fagocitos Microglia Encéfalo Células de Langerhans Piel CPA no fagocitos Células dendríticas interdigitating Tejido linfoide CPA linfocitos Linfocitos B y T Tejido linfoide y sitios de inmunoreacción Astrocitos Encéfalo Células foliculares Tiroide Células endoteliares Vascular y tejido linfoide CPA facultativas Fibroblastos Tejido conectivo. www.aleidavillaespinosa.cowww.aleidavillaespinosa.co mm
  10. 10. Localización de Antígenos intra y extra celularesLocalización de Antígenos intra y extra celulares Células diana de la infección. (CD)Células diana de la infección. (CD) • Son células diana de una infección aquellas donde seSon células diana de una infección aquellas donde se multiplican o replican o transportan los microorganismos.multiplican o replican o transportan los microorganismos. • La célula diana depende de la calidad y cantidad de losLa célula diana depende de la calidad y cantidad de los receptores específicos a un microorganismo dado o a susreceptores específicos a un microorganismo dado o a sus antígenos.antígenos. • El tropismo de un microorganismo por una célula dependeEl tropismo de un microorganismo por una célula depende del tipo celular, especie, edad, raza y especialización.del tipo celular, especie, edad, raza y especialización. • El nivel de detección de los antígenos microbianos enEl nivel de detección de los antígenos microbianos en células dianas está relacionado con el tipo de replicación océlulas dianas está relacionado con el tipo de replicación o curva de multiplicación, estructura antigénica, localización,curva de multiplicación, estructura antigénica, localización, formas clínicas y vías de eliminación.formas clínicas y vías de eliminación. www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  11. 11. Seroteca. Base de datos y paneles Anticuerpos monoclonales. (mAb) • Nombre completo incluido nº de referencia y autor • Centro proveedor e investigador de contacto • Denominación de hibridoma • Denominación del clón • Antígenos de reconocimiento: ( Género esp., Epítopos esp., Reacciones cruzadas) • Presentación: sobrenadante de cultivos o líquido ascítico • Purificación ( preferentemente por afinidad) • Concentración en mg/ml • Clase y subclase de Ig, si es la molécula completa, Fab', Fc • Vida media en la conservación • Guardar en alícuotas en volúmenes de 10 - 20 µl en crioviales y etiquetas propias • Certificación de análisis • Referencias bibliográficas www.aleidavillaespinosa.cowww.aleidavillaespinosa.co mm
  12. 12. Seroteca. Base de datos y paneles Anticuerpos policlonales • Nombre completo, incluido código y nº de producto • Centro proveedor e investigador de contacto • Huésped • Tipo de adsorción • Especificidad: monoespecífico, reacción cruzada • Purificación: preferentemente afinidad • Clase y subclase de Ig • Guardar en alicuatas por 10- 20 µl en crioviales bien identificados con etiquetas propias • Aplicaciones • Concentración en mg/ml • Vida media y forma de conservación • Certificado de análisis • Referencias bibliográficas • Validaciones periódicas con sistemas propios. www.aleidavillaespinosa.com
  13. 13. Ejemplo de información técnica en la Seroteca INVESTIGADORES DE CONTACTO. N.H.S. Swellengrebel. Laboratory of Tropical Hygiene. H. van de Kemp. Biomedical Research CENTRO PROVEEDOR Royal Tropical Institute and WHO/FAO Collaborating Centre for Reference and reserarch on Leptospirosis. MAb. Leptospira autumnalis Clone F65C3 Grupo específico: serovares:autumnalis,bangkinan g, bim, bulgaria, butembo, carlos, erinac.aur, fostbragg, lambwe, mooris,mujunkumi, weerasinghe, MAb. Leptospira canicola Clone F 152C8 serovar: canicola MAb. Leptospira icterohaemorrahagiae Clone F70C14 serovar: icterohaemorragiae MAb. Leptospira grippotyphosa Clone F71C3 serovar grippotyphosa MAb. Leptospira sejroe Clone F13A3 serovar hardjo MAb. Leptospira australis Clone F90C12 serovar bratislava MAb. Leptospira pomona Clone F43C9 Grupo específico: pomona, mozdok, proechimys, trópica www.aleidavillaespinosa.com
  14. 14. Anticuerpos monoclonales. Están disponibles en el mercado, La lista puede ser tan amplia como queramos ADV gE - gB BHV-1 gE - gB Campylobacter fetus Toxoplasma gondii Enterovirus Papilomavirus Parvo virus PRRS Pasterella toxigénica Rotavirus Influenza tipo A Coronavirus bovino Coronavirus respiratorio TGE PEDV Brachyspira hyodisenteriae Brachyspira pilosicoli Lawsonia intracelularis Chlamydia Leptospiras Neospora BRSV BVD p80; p80/125; gp57 PI3 Tuberculosis Encephalitrozoon RHD Visna Maedi /CAE Mixomatosis Adenovirus www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  15. 15. Anticuerpos policlonales Brachyspira spp Paratuberculosis Listeria monocitógenes Erysipelotrix rhusiopathiae Cándida albicans Clostridium novyi Clostridium sordelii Clostridium chauvoei Clostridium septicum Mycoplasmas:hyopneumoniae, hiorhinis, hyosinoviae bovis, agalactiae, ovipneumoniae arginini, capricolum, capri F38 mycoides sc y sl, putrefasciens Iowae, gallisepticum, synoviae Meliagridis, pulmonis www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  16. 16. ProtocoloProtocolo para lapara la identificaciónidentificación de Antígenosde Antígenos en células.en células. www.aleidavillaespinosa.com
  17. 17. Resultados de la preparación de célulasResultados de la preparación de células aisladasaisladas Monocapas de células Inmunoperóxidasa.Monocapas de células Inmunoperóxidasa. Controles negativosControles negativos www.aleidavillaespinosa.com www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  18. 18. • Unión inespecífica de las inmiunoglobulinas ( Ig ) a los receptores FCUnión inespecífica de las inmiunoglobulinas ( Ig ) a los receptores FC Los receptores FC son glicoproteínas de la membrana con alta afinidad por polímeros yLos receptores FC son glicoproteínas de la membrana con alta afinidad por polímeros y complejos inmunes de Ig. A veces se hace necesario bloquear los sitios reactivos de FC encomplejos inmunes de Ig. A veces se hace necesario bloquear los sitios reactivos de FC en los tejidos para impedir la unión inespecífica de las Inmunoglobulinas a los tejidos.los tejidos para impedir la unión inespecífica de las Inmunoglobulinas a los tejidos. SoluciónSolución: La mas frecuente es la utilización de suero norma l o emplear la fracción Fab` de: La mas frecuente es la utilización de suero norma l o emplear la fracción Fab` de las Ig y no las moléculas completaslas Ig y no las moléculas completas • Enzimas endógenasEnzimas endógenas La presencia de peróxidasa endógena es una causa frecuente de background.Los tejidosLa presencia de peróxidasa endógena es una causa frecuente de background.Los tejidos de mamíferos a veces exhiben actividad peróxidasa, particularmente las hemoproteínas.de mamíferos a veces exhiben actividad peróxidasa, particularmente las hemoproteínas. SoluciónSolución:: La destrucción enzimática ccon peróxido de hidrógeno.La destrucción enzimática ccon peróxido de hidrógeno. • Interacción hidrofóbicaInteracción hidrofóbica :: La hidrofobocidad es una propiedad que poseen muchas proteínas. Las inmunoglobulinasLa hidrofobocidad es una propiedad que poseen muchas proteínas. Las inmunoglobulinas son paticularmente hidrofóbicas sobre todo cuando se emplean fijadores que contienenson paticularmente hidrofóbicas sobre todo cuando se emplean fijadores que contienen aldehidos tales como la formalina y el glutaraldehido.aldehidos tales como la formalina y el glutaraldehido. SoluciónSolución:: Optimizar la fijación en tiempo,temperatura y pH. Emplear agentesOptimizar la fijación en tiempo,temperatura y pH. Emplear agentes bloqueadores antes del primer anticuerpo, buffer de baja fuerza iónica y detergentes.bloqueadores antes del primer anticuerpo, buffer de baja fuerza iónica y detergentes. Puntos críticos en la inmunotinciónPuntos críticos en la inmunotinción www.aleidavillaespinosa.comwww.aleidavillaespinosa.com
  19. 19. www.aleidavillaespinosa.com
  20. 20. Algunos EjemplosAlgunos Ejemplos Brachyspiras obtenidas por ISMBrachyspiras obtenidas por ISM e identificadas en IPXe identificadas en IPX con anticuerpos monoclonalescon anticuerpos monoclonales www.aleidavillaespinosa.com
  21. 21. EjemplosEjemplos www.aleidavillaespinosa.com Identificación de bacterias, levaduras y parásitosIdentificación de bacterias, levaduras y parásitos mediante IPX con anticuerpos monoclonales y policlonalesmediante IPX con anticuerpos monoclonales y policlonales
  22. 22. Algunos EjemplosAlgunos Ejemplos Localización de antígenos virales en diferentes tipos de célulasLocalización de antígenos virales en diferentes tipos de células mediante Inmunoperóxidasa con anticuerpos monoclonalesmediante Inmunoperóxidasa con anticuerpos monoclonales www.aleidavillaespinosa.com
  23. 23. Otros métodosOtros métodos Para el desarrollo de la inmunocitología estamos estudiando laPara el desarrollo de la inmunocitología estamos estudiando la fluorimetría y la citometría de flujo de barrido láser.fluorimetría y la citometría de flujo de barrido láser. www.aleidavillaespinosa.com

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