1. DIAGNOSTICO MOLECULAR
DE LAS ENFERMEDADES
ADRIANA MARIA GIL ZAPATA
Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
2. VENTAJAS DE LAS TECNICAS
DEL ADN
• La identificacion por ADN no es muy conocida
por los delincuentes.
• El ADN esta presente en todas las celulas
vivas, y es el mismo independiente de la celula
que se trate.
• Marcadores geneticos siguen las leyes de
Mendel, es posible establecer relaciones de
parentesco.
• Determinar el sexo de la persona.
3. SNP Databases
Database Total SNPs Nº Validados Comentarios
Nuevas entradas de SNPs: approx.
11.170.620 2.034.130
NCBI dbSNP 100.000 / mes
(Humanos)
“Allele Frequency Project“
1.255.326 55.018
The SNP publicado en Genomics Agosto
(Allele frequency (Allele frequency 2005
Consortium project) project)
Todos los SNPs han pasado a
Celera CDS 4.802.233 3.388.791 dbSNP en septiembre 2005
36 Africanos, Europeaos &
ABI Assays on
2.000.000 1.500.000 Asiáticos (validación)
Demand
45-60 Africanos, Europeos &
Chinos & Japoneses usados en
Phase I 500.000
Hapmap Todos validados validación.
Phase II 4.600.000
Sequenom Parte del “online assay design
400.000 220.000
RealSNP service”
4. MARCADORES ASOCIADOS A
ENFERMEDADES
• Signos y síntomas, historia clinica
• Análisis clínicos
• Análisis molecular
- Análisis geonómico y proteomico
Origen de diversas enfermedades, cáncer,
diabetes, hipertension y patologias
cardiovasculares.
5. DOGMA DE LA BIOLOGIA
MOLECULAR
Flujo de la información puede ir DNA al RNA y
de regreso.
Información puede ir de una molécula del DNA a
otra sin relacionarse con reproduccion sexual.
La Biotecnología manipula DNA y RNA y
desarrolla los principios en que se basan las
tecnicas de biologia molecular.
6. DIAGNOSTICO MOLECULAR
• La biología molecular estudia al DNA y
RNA:
- Estructura
- Función.
Diagnostico molecular: determina las
alteraciones en la estructura o secuencia
de los ácidos nucleicos.
7. PROBLEMA DIAGNOSTICO
MOLECULAR
• Definir cual es la secuencia de ADN que
representa la población sana, debido a
que existe un gran numero de variantes
de la secuencia normal, que no tiene
consecuencias patológicas o fenotipicas y
solo habla del origen étnico y se les
denomina Polimorfismos.
8. CODIGO GENETICO
• Es degenerado.
• El codon AUG:
metionina.
• Codones de
parada:
UUA,UAG,UGA.
• Isoleucina:
AUU,AUC.
9. SECUENCIACION
• La técnica mas importante del diagnostico molecular.
• Es el estándar con el que se compara las demás
tecnicas.
• Tiene un marcaje fluorocromo.
10. SECUENCIACIÓN
• Identificación de la
secuencia de bases de
un determinado
fragmento de ADN.
• Confirma mutaciones
detectadas
con otras técnicas
(RFLPs)
12. CRITERIOS PARA EL
DIAGNOSTICO MOLECULAR
• Distinguir entre cambios de secuencia con
consecuencias funcionales y las que no las
tienen.
• El cambio en la secuencia será claro cuando
la alteración sea homocigota.
• Los heterocigotos presentarán mezcla 1:1
• En muestras de tejido la frecuencia con que
se encontrara la variante es proporcional a la
cantidad de células portadoras que se hallan
tomado
13. TECNICAS PARA ESTUDIO DE
CROMOSOMAS
Obtención de cromosomas en metafase a
partir de una célula a los cuales se les
realiza tinción con diversos colorantes
para generar patrones de bandeo cuya
intensidad y distribución son únicas para
cada cromosoma
14. FISH
• Hibridación con sondas marcadas
fluorescentes (fluoresceína, Yoduro de
propidio)
• Determinar la posición física d un gen o
de un marcador genetico a lo largo del
cromosoma.
16. DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD
GENETICA
Mutaciones puntuales
Cambio en la secuencia de nucleótidos del ADN original,
que no se corrige y por tanto queda incorporado de
forma permanente
17. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
También conocidas como endonucleasas, son
enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del
ADN a partir de una secuencia que reconocen
(palindrómica).
Son extraídas de organismos procarióticos
(bacterias), donde actúan como un mecanismo de
defensa, para degradar material genético extraño
que entre en la célula.
18. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Tipo I:
• Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación
(metilan).
• Cortan lejos de la secuencia de reconocimiento.
• Necesitan ATP para moverse a través de la molécula
de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el
sitio del corte.
Tipo II:
• Sólo tienen actividad de restricción.
• Cortan dentro de la secuencia que reconocen.
• No necesitan ATP.
•
19. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Tipo III
• Tienen actividad de restricción y metilación.
• Cortan de 5-8 bases antes o despúes de la
secuencia que reconocen.
• Necesitan ATP para moverse a través de la molécula
de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el
sitio del corte.
21. POLIMORFISMO DE CADENA
SENCILLA DE ADN (SSCP)
• Diferencias de secuencia en un fragmento
de ADN.
1. PCR con dNTP α radiactivo (33P)
2. Desnaturalización por altas temperaturas
3. Electroforesis de poliacrilamida.
4. Plegamiento de cadenas sencillas
(uniones AT y GC)
22. ESTUDIO DE REGIONES
PROMOTORAS.
• Ensayos de expresión con genes
reporteros:
La función de la región promotora se mide
valorando
• La cantidad de mRNA recién transcrito.
• La cantidad de proteína codificada.
1. Clonar la región reguladora de interés frente a
región estructural de genes proteínas
fácilmente detectables
23. ESTUDIO DE REGIONES
PROMOTORAS.
PROTEINAS REPORTERAS:
• Β-galactosidasa.
• Cloranfenicol-acil-transferasa
• Luciferasa
• Proteina verde fluorescente.
2. Cultivo celular
3. Medición de proteina.
4. Técnica SSCP
24. ADN RECOMBINANTE
• Permite modificar segmentos de ADN e
introducirlos en organismos utilizando vectores.
26. HETERODUPLEX
• Mezcla de ADN control y de ADN estudio
• Desnatluralización por calor y a reacoplamiento
(reannealing)
1. Si no existe mutación sólo se producen homodúplex
(cadenas que emparejan todos sus nucleótidos)
2. Si existe la mutación se producen tanto homodúplex
como heterodúplex (cadenas que no emparejan 100%
puesto que algunos de sus nucleótidos son distintos).
• Los homodúplex y los heterodúplex tendrán distintas
movilidades electroforéticas.
• Se realiza en geles no desnatluralizantes
27. MÉTODO DE LA ROTURA
ENZIMÁTICA. (EMC)
• Los heterodúplex ADN:ADN se exponen a una
endonucleasa tras lo cual los fragmentos se
analizan por electroforesis en gel.
• Nucleasas de la haba mung y S1, pero este
método es muy dependiente de la secuencia y
no detecta muchas mutaciones.
28. MÉTODO DE LA ROTURA QUÍMICA.
(CCM)
• Los nucleótidos desemparejados en los heterodúplex
ADN:ADN o ADN:ARN son modificados por agentes
químicos (hidroxilamina y tetróxido de osmio
,carbodiimida) que no afectan a los nucleótidos
emparejados.
• Luego los heterodúplex son expuestos a piperidina que
los rompe en los sitios donde hay modificación química.
• La localización de la mutación puede deducirse del
tamaño de los fragmentos obtenidos.
• Se puede detectar mutaciones en fragmentos de ADN de
hasta 1499 bp de longitud, con un 90 a 95% de eficiencia.
30. GENERACION DE UNA SONDA
TIPOS DE MARCAJE
1. Radioactiva:
• dNTPs marcados en posición g con 32P/33P
• muy sensible
• contaminante
• vida media del isotopo
2. No radioactiva:
• dNTPs marcados con biotina o digoxigenina
menor sensibilidad
menor razón señal/ruido
• dNTPs marcados con compuestos fluorescentes
31. SOUTHERN BLOT
• Transferencia de un DNA denaturado desde un
gel a un soporte de filtro donde puede ser
hibridizado con una sonda de ADN
complementaria
• Identificar genes o fragmentos genéticos de un
tamaño anormal o ausentes
• Identificar mutaciones puntuales
32. SOUTHERN BLOT
– Restricción para generar diferentes
fragmentos
– Electroforesis en geles de agarosa
– Denaturación para permitir la union
a la membrana nitrocelulosa ( UV,
NaOH).
– Transferencia al papel de filtro por
capilaridad
– Hibridización con sonda especifica
– Lavados
– Visualización de la sonda
34. MICROARRAYS
Analiza varios SNPs al tiempo
1. Microarrays de cDNAs:
DNAs (cDNA o productos de PCR 0,6-2,4 Kb) son inmovilizados
en una superficie solida (nylon o vidrio).
Contienen cientos-miles de sondas.
Baja densidad de las sondas inmovilizadas.
La muestra a hibridar es marcada con radioactividad.
2. . Microarrays de oligonucleotidos:
Oligonucleotidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de
vidrio o plástico.
Contienen 40.000-60.000 sondas.
Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de
siembra).
36. MICROARRAYS
1. Aislar RNA (total o mRNA) a partir de una muestra
biológica.
2. Convertir el RNA en cDNA utilizando una
transcriptasa reversa.
3. Marcar el cDNA con nucleotidos radioactivos o
fluorescentes
4. Hibridar el cDNA marcado en el array.
5. Detectar y cuantificar la fluorescencia o la
radioactividad. utilizando un confocal laser scanner o
un phosphoimager.
6. Analizar los resultados.
38. ESTUDIO DE RNA
Cambios en la secuencia genética influye:
Capacidad de transcripción de un gen.
Disminución de la vida media del mRNA
mRNA mas cortos (defecto de splicing)
Permite detectar la presencia
de un transcrito.
Proporciona información de NORTHERN BLOT
su tamaño y procesamiento.
39. NORTHERN BLOT
1. Extracción del RNA 4. Generación de una sonda cDNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Electroforesis del RNAs
5. Hibridación
6. Visualización
mRNA
silvestre
3. Transferencia a membrana
Luz UV, calor
40. NORTHERN BLOT
ELECTROFORESIS DEL RNA
En geles de agarosa
En condiciones desnaturalizantes(formaldehido/formamida)
28S
4,8 Kb
18S
1,8 Kb
• El gel es teñido con bromuro de etidio y el RNA visualizado en un
transiluminador UV
• Integridad del RNA: presencia y proporcion de los RNA (28 y 18S)
• Concentración del RNA: A260 x dilución x 40 = mg/mL
42. LIGAMIENTO GENETICO
• Permite identificar el sitio cromosómico donde
reside el gen causal de la enfermedad.
• Seguir la segregación de un marcador
(microsatélites) con localización conocida e
identifica la cosegregación de determinado alelo
con el padecimiento.
• Definir si un gen conocido es el causante de la
enfermedad genética.
43. INESTABILIDAD DE
MICROSATELITES
• Tamizaje de individuos con cáncer
• Evalúa la variación de tamaño de
secuencias microsatélites
• utiliza muy poca cantidad de ADN
• Tiene una alta resolución
• Es muy reproducible
45. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
• La manipulación genética de
proteínas implica la manipulación
de DNA
• En general, podemos modificar
genéticamente una proteína:
• i)cortándole un trozo,
ii)añadiéndole un trozo,
• iii)fusionándola con otra
• proteína,
• iv) cambiándole específicamente
unos cuantos residuos
aminoacídicos.
46. Daría todo lo que sé,
por la mitad de lo que ignoro.
René Descartes