Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
Design of degenerated primers from bioinformatics
                 online software for putative ACE-1 transcription
Upcoming SlideShare
Loading in …5

Design of degenerated primers from bioinformatics online software for putative ACE-1 transcription factor in Peniophora sp.


Published on

  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

Design of degenerated primers from bioinformatics online software for putative ACE-1 transcription factor in Peniophora sp.

  1. 1. Design of degenerated primers from bioinformatics online software for putative ACE-1 transcription factor in Peniophora sp. Ana Belén Ramos Hryb1(1), María Isabel Fonseca(1), Laura Villalba(1), Pedro Darío Zapata(1). (1)Laboratory of Molecular Biotechnology, FCEQyN, Posadas, 3300, Misiones, Background Cellulose‐paper industries have high environmental impact, that is why there are efforts to reduce pollution. In this sense white rot fungi such as Peniophora sp (BAFC  633) present enzymes with wide degradative capacity, like Laccase (Lac) [1], with potential to alleviate environmental problems. Several cupper‐binding sites in Lac have  been discovered [2] and the presence of DNA sites coding transcription factor in response to Cu+2 (ACE‐1) in Phanerochaete chrysosporium (Genbank accession number  ABF60559.1)  has  been  demonstrated  [3],  which  could  activate  the  laccase gene  transcription  [4].  The  objective  of  this  study  was  to  define  conserved  regions  using  bioinformatics tools and to design degenerated primers to amplify a segment of a putative region coding ACE‐1 in Peniophora sp. genome. Key words: degenerated primer, score, ORF, motif, ACE‐1, transcription factor, Phanerochaete chrysosporium , Peniophora sp. Materials and methods Tables and figures The aminoacid sequence of ACE‐1 from Phanerochaete chrysosporium was  used  as  reference  contrasting  it  Table 1: Parameters adjusted for searching the primers on Primer3 and Fast PCR software. Table 2:  Sequence of forward and reverse primers wich were picked up and their respective against  database  published  on  BLASTp (Basic  local  degeneration percent. Alignment Search Tool protein) (see figure 2).Then, the  Minimus Maximus Optimus selected similar sequences were aligned using T‐Coffee  Tm 50 67 60 [5]  and  ClustalW2  [6]  (see  figure  3),  in  order  to  %CG 40 60 50 determine  the  score.  The  Prosite [7],  was  used  to  Fragment lenght 100 determinate  if  the  conserved  regions  correspond  with  Primer lenght 18 24 20 functional  sites  of  protein.  In  order  to  design  degenerated primers, the highly conserved region was  selected,  the  selected  aminoacid sequence  was  decoded  with  Expasy [8],  then  we  search  the  ORF  of  the  aminoacid sequence  with  ORF  finder  from  NCBI  Figure 1:  The motifs of ACE‐1 related to copper‐fist DNA binding  domain found on PROSITE web site. (see figure 7), and the primers picked up were analized with Primer3 [9] (see table 1 and table 2) and Fast PCR  software.  The  sequence  fragment  obtained  was  analyzed again to confirm its validity in silica. Then we  added  a  restriction  site  to  Eco‐R1  enzymes  for  cloning  the fragment in the future, the obtained primers were  analyzed with NebCutter (see figure 6). Results It was found a conserved domain about 50 aminoacids from  about  80‐90%  of  similarity  on  alignment  with  T‐ coffee  and  Clustalw2.  It  could  be  observed  that  the  conserved  motif  codifies  a  copper‐fist  DNA  binding  domain (see figure 1). The score obtained with T‐Coffee  was  higher  than  the  score  given  by  clustalw2,  so  we  decided  to  use  the  first  software.  At  this  region  we  Figures 2 and 3: The picture on the left is a capture of results from aminoacid sequence of ACE‐1 from P chrysosporium contrasting against  Basidiomycete database  of  picked  up  the  primers  (see  figure  4  and  5).  We  used  PLASTp. And the picture on the right is a capture of sequence alignment of selected aminoacid sequence with ClustalW. wooble pairing  to  reduce  the  degeneration  percent  (about  50%)  of  the  primers,  to  which  we  included  the  restriction site to EcoR1 enzyme. Conclusion These  results  suggest  that  the  conserved  domain  we  found must be due to function similarities of the ACE‐1  with  related  proteins  and  the  difference  must  be  aminoacid synonymous  substitutions.  From  these  results  we  concluded  that  the  use  of  online  software  has  facilitated  and  has  accelerated  investigations  on  molecular biology research nowadays. Figures 4 and 5: The picture on the left is a capture of characteristics of the primers picked up with Primer3 softwares. and the picture on the right is a capture of characteristics of the primers pricked up with Fast PCR. Figure 6 and 7: The picture on the left is a capture of the result from cuting the primer (with restriction enzime site) with NEBcutter. And the picture on the right is a capture of result from searching of the ORF of the aminoacid sequence of ACE‐1.. Acknowledgements: The authors thank the Experimental Mycology Department at the University of Buenos Aires and the Culture Collection of the Faculty of Forestry Eldorado of the Universidad Nacional de Misiones for the kind fungi supply. Part of the experimental work was funded by the Fundación Banco Río and Secretaría de  Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional de Misiones, through the respectively grants for innovation projects. M.I. Fonseca has a fellowship for doctoral studies of CONICET, Argentina. References 1. Fonseca MI, Shimizu E, Zapata PD, Villalba LL: Copper inducing effect on laccase production of white rot fungi native from Misiones (Argentina), Enzyme and Microbial technology 2010, 46:534‐539. 2. Piontek K; Antorini M, Choinowski T: Crystal Structure of a Laccase from the Fungus Trametes versicolor at  1.90‐Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers. The Journal of Biological 2002, 40 (277): 37663–37669. 3. Polanco R, Canessa P, Rivas A, Larrondo LF, Lobos S, Vicuña R: Cloning and functional characterization of the gene encoding the transcription factor Ace1 in the Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biol Res 2006, 39: 641–648. 4. Álvarez JM, Canessa P, Rodrigo A, Polanco R, Santibáñez PA: Expression of genes encoding laccase and manganese‐dependent peroxidase in the fungus Ceriporiopsis subvermispora is mediated by an ACE1‐like copper‐fist transcription factor. Fungal Genetics and  Biology 2009, 46: 104–111. 5. T‐ Coffee Multiple sequence alignment [‐coffee/index.html?] 6. ClustalW2 Multiple sequence alignment [] 7. Database of protein domains, families and functional sites. [] 8.  Translate tools [] 9. WWW Primer tools []