Colture amalia stud

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  • Vedi cap 5 Perry per le figure
  • Colture amalia stud

    1. 1. MICROBIOLOGIA Le Colture Porta Amalia
    2. 2. CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE QuickTime™ and a decompressor-Proteggere sia il are needed to see this picture.campione che l’operatore
    3. 3. Sterilità e lavoro al bunsen 30 cm 30 cmarea sterile intorno alla fiamma fiamma ossidante fiamma riducente (azzurra) (gialla)
    4. 4. Lavorare in condizioni sterili1. Pipette cotonate e NON pipettare MAI a bocca.3. Lavorare sotto cappa possibilmente con un bunsen da cappa a portata di mano.5. Mettere tutto il necessario dentro la cappa prima di cominciare. Tutti i movimenti perturbano flusso laminare, rendendo inefficiente la cappa.7. Tenere solo quanto necessario.
    5. 5. 2. Tenere le pipette in modo che puntino verso avanti e non verso loperatore. Evitare che la punta superi il piano forellato dove si crea la barriera daria.4. Richiudere le cose il piu presto possibile.• Non passare MAI sulle fiasche o sulle bottiglie aperte con le mani o con le braccia.• Apposito recipiente per materiale di scarto.• Passare alla fiamma del bunsen il materiale prima e dopo.• dopo passare etanolo al 70%.
    6. 6. CAPPE A FLUSSO LAMINAREFlusso d’aria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli che si muovono alla stessa velocità in tutti i punti creando una corrente d’aria omogenea senza turbolenzeSi ottiene combinando un filtro assoluto (HEPA) con una massa d’aria che lo attraversa alla velocità costante di 0,45 m/sec. Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) :• E’costituito da un sottile foglio a base di fibre di vetro submicroniche montato in un telaio di alluminio o di legno.• Ha un efficienza del 99.999% su particelle di 0,3 micron
    7. 7. TERRENI DI COLTURA In campo microbiologico e’ di primaria importanza riuscire a Coltivare e perpetuare i microrganismi Agar: polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse.•non tossico per microbi, o altre forme di vita.•si scioglie solo a 100ºC, ma solidifica a circa 45ºC•è fisiologicamente inerte
    8. 8. Fanny Angelina Eilshemius Walther Hesse1877 La Capsula Julius RichardPetri, assistente di Robert Koch. diametro tra i 50 e 100 mm e unaltezza di 15 mm.
    9. 9. PIASTRAMENTO ? Spatolamento Striscio Per Inclusione
    10. 10. Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1) Deporre con unapipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2) Immergere un’apposita bacchetta divetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarlaraffreddare. (4) Distribuire uniformemente, strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante labacchetta sterile. Incubare.
    11. 11. Spatolamento
    12. 12. StriscioKoch inventò l’ansa di platino
    13. 13. Colonie isolate
    14. 14. Per Inclusione
    15. 15. ColonieForma: Spessore: Margine:•Puntiforme •Piatto •Regolare•Circolare •Sopraelevato •Ondulato•Filamentosa •Convesso •Lobato•Fusiforme •Cupoliforme •Eroso•Irregolare •Umbonato •Filamentoso •Increspato
    16. 16. POPOLAZIONE MISTA COMUNITA’ MICROBICA condizione naturale di convivenza (es. nel suolo, nell’intestino..).Le varie procedure di arricchimento forniscono una miscela di specie Koch colonie tutte diverse Da una colonia: Colture AXENICHE O PURE • Colture che contengono 1 sola specie • Normalmente non uniformi geneticamente
    17. 17. COLTURE PURE• Colture Axeniche derivano da una cellula singola o da CFU – Colony-Forming-Unit• Ogni colonia e’ Geneticamente uniforme
    18. 18. Procedure asettiche che portano a COLTURE PURE• Sterilizzazione del terreno di coltura• Diluzione Seriale• Striscio su piastra• Diffusione su piastra• Inclusione in piastra
    19. 19. CONTA VITALE SU PIASTRA Modificato da ”Brock Biology of Microorganisms, 9th Ed.”, di Madigan, Martinko e Parker, Prentice Hall Diluizioni serialiPro: molto sensibile;titolazione selettiva inpopolazioni miste grow o/n calcolo del titolo in cfu (Colony Forming Units) / ml
    20. 20. Il campione originale èsottoposto a diluizioniseriali, in modo da ridurrein misura sufficiente ilnumero delle cellulemicrobiche presenti.Inclusione: diluizione piùalta in agar caldo, quindi inpiastre di petri. Le celluleisolate crescono formandocolonie e possono essereusate per costituire coloniepure. Le colonie insuperficie sono circolari,quelle al di sotto dellasuperficie in genere hannoforma lenticolare.
    21. 21. COLTURE PURE Inconvenienti della Diluzione Seriale• Costosa (mezzi di crescita e vetreria)• Molti pipettamenti, e• Non attendibile al 100%
    22. 22. COLTURE PURE Quadrant Streak Technique - Robert Koch in 1880• Richiede mezzi solidi• Diluisce la cultura iniziale in DUE DIMENSIONI
    23. 23. TERRENI Calssificati in base alla FUNZIONE ed alla COMPOSIZIONE:•Terreni per uso generico•Terreni arricchiti con particolari nutrienti•Terreni selettivi•Terreni differenziali (es. cromogeni).
    24. 24. Terreni cromogeniSostanze nutritive essenzialiCromogeni (cromoforo+zucchero) C Z
    25. 25. QuickTime™ e un Chromogenic E.coli O 157 agar: E.coli non O 157 (colonie porpora) decompressore TIFF (LZW)sono necessari per visualizzare questimmagine. Non E.coli (colonie blu) E.coli O 157 (colonie bianche) 18-24 ore/37°C Non fermenta il sorbitolo→ colonie bianche Test di agglutinazione al lattice
    26. 26. Metodi di conta microbica
    27. 27. Conta in piastraSi basa sulla produzione di CFU su terreniagarizzatiLe cellule devono essere vive e vitali Il terreno deve essere appropriato
    28. 28. Quantificazione spettrofotometrica Lo spettrofotometro è uno strumento che misura laassorbanza di un fascio di luce che attraversa uncampione in soluzione Relazione lineare tra assorbanza e concentrazionedi un soluto Densità ottica (1 OD600nm ≈ 8,0 x 108 cellule diE. coli)
    29. 29. Torbidità e misurazione dellamassa microbicaDeterminazione della massamicrobica tramite misurazionedell’assorbimento della luce. Alcrescere della popolazione, equindi della torbidità, aumentala dispersione della luce per cuiaumentano i valoridell’assorbanza forniti dallospettrofotometro.
    30. 30. MISURA DELLA TORBIDITA’ http://www.prenhall.com/brockLa torbidità è dovuta allarifrazione della luce da parte dellecellule presenti nella sospensione.La densità ottica (OD) misurata a600 nm con uno spettrofotometroè proporzionale al numero totaledi cellule (vive e morte).
    31. 31. COMPARTIMENTO CELLE• Le celle o cuvette sono di vario tipo a seconda dell’uso e del tipo di strumento.• Le celle di quarzo e di vetro sono utilizzate nel UV/Vis.• Sono utilizzate anche celle monouso di polistirene.
    32. 32. Miceli non spettrofotometro, peso secco
    33. 33. Conta delle celluleEmocitometri (conteggio al microscopio):piu’ lento e faticoso, ma ci permette di valutare lo stato di salute delle cellule.
    34. 34. Conta delle cellule Camera di Bürker QuickTime™ e un 2 identici ruled glass con 2 quadrati di decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine. 3 x 3 mm. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine.
    35. 35. Camera di BurkerEmocitometro che porta incisa sulla camera di conteggio questa griglia: Ogni griglia ha 9 quadrati grandi di 1 mm2 o QuickTime™ e un decompressore 16 quadrati piccoli. sono necessari per visualizzare questimmagine.
    36. 36. • wet the ridges of the hemocytometer. place a cover slip and press until you see • load it by capillarity. • allow cells to settle. QuickTime™ e un decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine. • to avoid evaporation, count within on minute: the light of the microscope heats the sample • count 4 squares located at the 4 corners.
    37. 37. Se consideriamo che lospessore verticale tra ilvetrino portaoggetto e il 1/10 1/250coprioggetto e’ di 0,1 mm,avremo che il quadratinopiccolo corrisponde ad unvolume di 1/250 dimicrolitro, mentre ilquadrato piu’ grandecorrisponde ad un volumedi 1/10 di microlitro.
    38. 38. Se contiamo le cellule che troviamo nel quadrato piccolo moltiplicheremo il risultato per 250 per avere le cellule per microlitro o per 250.000 per avere le cellule per mL.Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare per il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo diluito 1:1 con Trypan blu per evidenziare le cellule morte, dovremo moltiplicare per 2.
    39. 39. Dobbiamo contare le cellule che troviamo nel quadrato grande e moltiplicare per 10 per avere le cellule per microlitro o per 10.000 (104) per avere le cellule per mL.Se abbiamo diluito il campione dovremo moltiplicare per il fattore di diluizione: ad es. se abbiamo diluito 1:1 con Trypan blu per evidenziare le cellule morte, dovremo moltiplicare per 2.
    40. 40. Ovviamente dovremo fare una statistica, contando piu’ quadratiAttenzione alle cellule sui bordi, si devono contare solo quelle su due lati, per non correre il rischio di sovrastime o sottostime.
    41. 41. PROCEDURA PER LA CONTA CELLULARE- Si effettua una diluizione 1:10-Si carica la camera con 10 ul di sospensione cellulare- Si procede alla conta delle cellule in ciascuno dei 4 quadrati d’angolo C = n°x 10 x 104 x V C = cellule per mL n° = (n1+n2+n3+n4)/4 10 = fattore di diluizione 104 = fattore conversione V= volume sospensione cellulare
    42. 42. Altri tipi di camere hanno “griglie” che corrispondono a diversi volumi, ma sono ovviamente riportati dalle case venditrici.
    43. 43. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine. QuickTime™ e un decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine.
    44. 44. QuickTime™ e un QuickTime™ e un decompressore decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine. sono necessari per visualizzare questimmagine. QuickTime™ e un decompressore QuickTime™ e un sono necessari per visualizzare questimmagine. decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine. QuickTime™ e un decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine. QuickTime™ e un QuickTime™ e un QuickTime™ e un decompressore decompressore decompressore sono necessari per visualizzare questimmagine. sono necessari per visualizzare questimmagine.sono necessari per visualizzare questimmagine.
    45. 45. QuickTime™ e un decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine.
    46. 46. QuickTime™ e un decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine.
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    48. 48. QuickTime™ e un decompressoresono necessari per visualizzare questimmagine.
    49. 49. Osservare i Microbi• Batteri non-colorati non sono facilmente osservabili.• La colorzione é essenziale per un accurato studio morfologico.• Sono disponibili molti coloranti.
    50. 50. BatteriNon colorati
    51. 51. Osservare i Microbi Coloranti Acidi (anionici)• Molecole coloranti hanno una carica negativa;• Vengono a reagire con componenti cellulari carichi positivamente;• Buoni coloranti per eucarioti - legano istoni (proteine cariche positivamente)• Pessimi coloranti per batteri• I2KI, Eosin, Congo Red, Fuchsin
    52. 52. Osservare i Microbi Coloranti Basici (cationici)• Molecole coloranti hanno una carica positiva;• Reagiscono con componenti cellulari carichi negativamente (DNA, proteine);• Buoni coloranti per procarioti ed eucarioti• Methylene blue, crystal violet, gentian violet, safranin.
    53. 53. Osservare i Microbi Coloranti neutri• Molecole idrofobiche;• Legano componenti cellulari non carichi (depositi di grasso, PHB*)• Sudan IV, Sudan Black, etc. *Poly-b-Hydroxy Butyric Acid
    54. 54. Colorazione semplice
    55. 55. PROCEDURE di COLORAZIONE COLORAZIONE DIFFERENZIALE• Lo scopo è di colorare cellule in maniera diversa da altre.• Comprende l’uso di almeno 2 coloranti – Colorazione primaria – Colorazione secondaria• Tra le 2 colorazione c’è uno step di decolorazione per rimuovere il colorante primario da alcune cellule
    56. 56. Con il colorante Secondario
    57. 57. Hans Gram
    58. 58. PROCEDURE di COLORAZIONE GRAMa Stendere; air dry; fissare al caloreb Immergere in crystal violet (“colorante primario”) c Lavare, aggiungere I2KI (Mordente)d Decolorare con EtOH 95% (rimuove colorante primario dalle cellule G-)e Immergere in safranina “colorante secondario”f lavare, dry, osservare
    59. 59. SIGNIFICATO della COLORAZIONE GRAM• Representa una reale differenza tassonomica fra gruppi di batteri.• Largamente dovuto alla natura della parete cellulare (peptidoglicano).• Si pensa che il PG si “denaturi” nello step con EtOH, bloccando il CVI* all’interno delle cellule. *CVI = Crystal Violet Iodine Complex
    60. 60. RISULTATI GRAM STAIN‚ Cellule Gram positive sono VIOLA – Staphylococcus aureusƒ Cellule Gram negative sono ROSA – Escherichia coli„ Cellule Gram variabili sono miste VIOLA e ROSA - Bacillus subtilis… Cellule che non reagiscono al Gram sono senza colore – Mycobacterium tuberculosis
    61. 61. Solo colorante primario
    62. 62. DopoDecolorizazione
    63. 63. Con il colorante Secondario
    64. 64. GRAM VARIABILI

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