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Tecnicas microbiologicas de agua

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Tecnicas microbiologicas de agua

  1. 1. TOMA DE MUESTRA Debe ser representativa del agua a analizar Frascos estériles de vidrio o plástico con un volumen entre 250 – 500ml ( no se llenan para poder agitar contenido) Para fijar cloro presente en agua ( agua potable) se añade tiosulfato sódico ( 1gota al 20%) Si en el agua hay presentes concentraciones de cobre, zinc o metales pesados hay que incorporar EDTA ( forma quelatos) Elementos: recipientes, hisopos estériles o sopletes de soldadura
  2. 2. Procedimiento 1.-Canilla:  se limpian la parte externa y la interna de la boca del grifo  Se deja salir chorro de agua fuerte durante 2 – 5 minutos para arrastrar suciedad en la cañería  Se esteriliza la boca  Se deja correr nuevamente agua  Se toma el frasco y se abre en este momento  Se procede al llenado
  3. 3. 2. Agua de río, arroyos, ríos : Lejos de la costa y a una profundidad media 3.-Natatorios: Cerca del borde y en zona de mayor profundidad  Siempre se sumerge el frasco dirigiendo la boca en sentido contrario a la corriente  Se rotulan y se envían
  4. 4. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN  Más rápido posible  Si no es así refrigerar inmediatamente  El transporte se realiza en envase aislante o en refrigerador  No pueden pasar más de 30 horas entre extracción y procesado de la muestra
  5. 5. TÉCNICAS
  6. 6.  RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES  RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES  RECUENTO DE COLIFORMES FECALES  RECUENTO DE ENTEROCOCOS  RECUENTO DE SEUDOMONAS  RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES
  7. 7. ELEMENTOS NECESARIOS  Pipetas: 1 ml y 10 ml-  Probetas graduadas-  Tubos de ensayo con tapas y Gradillas  Tubos de fermentación según Durham: para detección de la formación microbiana de gases  Placas de Petri: tamaño estándar de 9 cm de diámetro, de vidrio o descartables.  Ansas de inoculación: de 3 mm de diámetro, de acero inoxidable o platino  Frascos para la toma de muestras: de vidrio, con tapón esmerilado  Baño de agua para templar el agar a 44-46ºC -- Contador de colonias  Estufa de cultivo graduable a diversas temperaturas de incubación  Estufa de aire caliente para esterilización (160-180°C)  Autoclave: temperatura de esterilización 121°C  Balanza analítica -- pH-metro: para control de los valores de pH de los medios de cultivo.  Solución fisiológica o agua peptonda al 1% -- Matraz y/ o Erlenmeyer: para preparar medios de cultivo, soluciones, etc.  Medios de Cultivo: Agar para recuento en placa ( Agar plate count: APC) -- Caldo Mc Conkey o Lauril Sulfato -- agar Cetridime -- Agar SPS -- Azida glucosa caldo – Caldo verde de malaquita – Pseusomona P y F -
  8. 8.  Los materiales de vidrio, luego de la limpieza mecánica, se limpian con agentes de lavado, y posteriormente se lavan varias veces con agua de canilla, y seguidamente con agua desionizada o destilada (los residuos de agentes de lavado impiden el crecimiento microbiano). Luego se realiza el secado del material.  Los materiales de vidrio que se han utilizado para el análisis de aguas contaminadas deben someterse al autoclave antes de la limpieza (20 min, 121°C, 1 atm).  La esterilización de los aparatos de vidrio limpios se realiza en la estufa de aire caliente, por 2 horas a 160-180°C. LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL
  9. 9. EXAMEN BACTERIOLÓGICO: METODOLOGIA
  10. 10. Recuento de Aerobios Totales ( Método de recuento estándar en placa)
  11. 11. Técnica  Se realizan diluciones 1/10, 1/100 1/1000 …. Según tipo de muestra con solución fisiológica
  12. 12. Se agrega 1 ml de muestra + 9 ml de solución fisiológica
  13. 13. Muestra directa Dilución 1/10 Dilución 1/100 Dilución 1/1000
  14. 14. Se incorpora posteriormente el APC ( Agar Plate Count preparado con anterioridad ( según instrucciones del frasco deshidratado)
  15. 15.  Se mezcla rotando cada placa. Dejar reposar hasta solidificación.  Llevar a estufa aeróbica a 35-37ºC durante 24, o a 20ºC durante 48 hs.  Contar en las placas donde se visualicen aisladas perfectamente entre 30- 300 colonias  Se promedia multiplicando por la inversa de la dilución
  16. 16. Cuando se informa el recuento se expresa con dos dígitos significativos seguidos de tantos ceros como la inversa de las placas cuyas diluciones promedios se contaron las colonias ( notación científica Ej: 84000= 8,4 x 104 ) Informar recuentos por ml de muestra
  17. 17. Recuento de Coliformes Totales CARACTERÍSTICAS:  Son buen indicador microbiano de la calidad del agua potable.  Entre ellos se encuentran Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en características pequeñas  Las bacterias coliformes no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el suelo. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino  Por lo expuesto, la presencia de algunos organismos coliformes (1-10 coliformes en 100 ml) tiene poca importancia, siempre que haya ausencia de organismos coliformes fecal. Diferenciar el tipo fecal (E.coli) y el no fecal (A: aerogenes o Citrobacter)  Son bacterias aerobias o anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.
  18. 18. . DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) / 100 ml de bacterias de coliformes totales (Método de Wilson) o de Tubos múltiples  Ordenar 3 filas de 3 a 5 tubos de ensayo con campanas de Durham en una gradilla
  19. 19.  F1 10ml Medio de doble concentración + 10ml de muestra  F2 10ml Medio de concentración simple + 1ml de muestra  F3 10ml Medio de concentración simple + 1ml de muestra
  20. 20.  Incubar los tubos a 32 - 35 ºC durante 48 horas.  Determinar con los tubos positivos (ácido y gas) el NMP utilizando la tabla de Hoskins.(Mc Grady) La formación de gas a las 48 horas y/o viraje del indicador se consideran evidencias suficientes de la presencia de coliformes.
  21. 21. TABLA DE HOSKINS / MC GRADY 3 tubos de 10 ml 3 tubos de 1 ml 3 tubos 0,1 ml Índice del NMP/100 ml 0 0 1 3 0 1 0 3 1 0 0 4 1 0 1 7 1 1 0 7 1 1 1 11 1 2 0 11 2 0 0 9 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64 3 1 0 43 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150
  22. 22. RECUENTO DE COLIFORMES FECALES  Organismos coliformes fecales (termotolerantes)  Los organismos coliformes fecales son capaces de fermentar la lactosa a 44.0- 44.5°C.  Entre ellos se encuentra el género Escherichia y en menor grado algunas cepas de Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella. De todos estos microorganismos, solo E. coli tiene origen específicamente fecal.  Para que en un sistema de distribución se desarrollen organismos coliformes fecales deben existir suficientes nutrientes bacterianos, la demanda bioquímica de oxigeno (DBO) debe ser mayor de 14 mg/l, la temperatura del agua debe superar los 13°C, y no debe haber cloro libre residual. 
  23. 23. Investigación de Escherichia coli : (coliformes termotolerantes)  1. Escoger tubos gas positivos del caldo Mc Conkey o Lactosa bilis verde brillante (Brila) procedentes del recuento de bacterias coliformes (NMP/100ml) Paralelamente también se hace un repique a caldo EC  2. Inocular una ansada de caldo de los cultivos seleccionados positivos en tubos de Caldo Mc Conkey o Brila.  3. Incubarlos tubos a 44,5 ºC ± 0,5 ºC y ver si son positivos de formación de gas a las 24 hs. y a las 48 hs.Si presenten gas o viran color son positivos : organismos coliformes fecales ya que a esta temperatura solo el bacilo coli fecal produce ácido y gas.  4. Para determinar Escherichia coli , de los tubos positivos mediante un ansa de ojal se estría la superficie de una placa de EMB, se incuba a 37º C por 24 hs (Colonias específicas)  Se confirma su presencia por las pruebas bioquímicas correspondientes al INVIC, como mínimo.( Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato: ++-- para E.coli)
  24. 24. RECUENTO DE ENTEROCOCOS  Otros indicadores de contaminación fecal  Cuando existan dudas, sobre todo cuando se han encontrado organismos del grupo coliforme y hay ausencia de coliformes fecales, se pueden usar otros organismos que confirmen que la contaminación es de naturaleza fecal.  Entre estos indicadores secundarios están los estreptococos fecales o enterococos  Estreptococos fecales: se denominan así a los que se encuentran normalmente en las heces humanas y animales. Raramente se multiplican en el agua contaminada y pueden ser algo más resistentes a la desinfección que los organismos coliformes.
  25. 25. TEST CUALI- CUANTITATIVO  Se mezclan igual cantidad de muestra de agua que de medio: azida glucosa de doble concentración muestra caldo azida glucosa Sin Turbidez: reacción negativa Se incuba a 37ºC durante 24 hs. Turbidez por crecimiento: reacción positiva ( pruebas confirmatorias)
  26. 26. RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES  El recuento o conteo de bacterias anaerobias sulfito reductores de la clase clostridios se encuentran en heces, humus y aguas residuales.  Se lo utiliza como indicador de contaminación fecal  A una temperatura particular (por ser esporulados resisten un choque térmico.) y debido a sus formas permanentes resistentes pueden permanecer con vida más tiempo en el agua que las formas vegetativas  Se realiza tratamiento térmico necesario para destruir todas las células vegetativas : 80º C por 10 min.  Luego se colocan 100 ml con 100 ml de caldo diferencial de clostridios o se hacen diluciones en placa con agar SPS .  Se incuba 48hs. A 37ºC en forma anaeróbica  Reacción positiva: coloración negra del cultivo( sulfito pasó a sulfuro) Existencia de clostridios Reacción negativa: sin coloración negra
  27. 27. RECUENTO DE SEUDOMONAS  Se realiza enriquecimiento colocando 100 ml de muestra de agua en erlenmeyer con 100ml caldo verde de malaquita de doble concentración o caldo cristal violeta.  Reacción negativa: Sin turbidez, no se encuentra presente Pseudomonas aeruginosa. Se concluye el ensayo. Reacción positiva: Turbidez por crecimiento microbiano.  La muestra que presente turbidez, es repicada con ansa ojal sobre una placa o pico de flauta de Agar Cetrimide.  Se incuba 24hs. A 37ºC. Si se observa desarrollo y/o pigmentación se procede a efectuar las siguientes pruebas: Gram Oxidasa Reducción de Nitrato Gluconato Licuefacción de Gelatina Pseudomona aeruginosa - + + + +
  28. 28. De aquellas placas que presenten desarrollo de colonias con fluorescencia, se repicaran colonias aisladas en: ( piocianina o piorrubina) Agar P y F para Pseudomonas, en forma de estriá con el ansa para punción, durante 48 hs a 37 ºC. Agar P para Pseudomonas: a) Reacción positiva: colonias de color azul hasta verde o respectivamente rojo hasta pardo obscuro del medio de cultivo. b) Reacción negativa: desarrollo de colonias sin formación de color o de color amarillo. Agar F para Pseudomonas: a) Reacción positiva: Fluorescencia amarilla verdosa bajo lampara UV b) Reacción negativa: Ausencia de fluorescencia.

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