Investiga la vacuna de la malària

525 views

Published on

Seguint aquest protocol, els joves participen en la investigació per desenvolupar una vacuna contra la malària que, en combinació amb les mesures actuals, podria contribuir de manera significativa a controlar millor aquesta important malaltia causada per un paràsit. Els estudiants provaran diverses possibles vacunes mitjançant la tècnica anomenada ELISA, i decidiran quina és la més eficaç. El protocol de l’experiment és una oportunitat perquè els centres de ciències, els museus i les escoles simulin un experiment real realitzat en un laboratori de veritat per investigar la vacuna de la malària.

Published in: Education
0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
525
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
3
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Investiga la vacuna de la malària

  1. 1. Investiga la vacunade la malàriaTaller d’experimentacióPROTOCOL
  2. 2. IntroduccióLa malària és considerada la malaltia més binació de diferents mesures que inclouen laimportant del món causada per un paràsit i és utilització de mosquiteres impregnades d’insec-responsable de la mort de prop de 800.000 per- ticida, d’esprais insecticides, de tractaments desones cada any, especialment infants menors prevenció, la implantació de programes educa-de cinc anys i dones embarassades. Segons tius i intervencions ambientals, entre d’altres.l’Organització Mundial de la Salut (OMS), uns3.000 milions de persones corren el risc de ser La comunitat científica està treballant intensa-infectades, i l’any 2010 hi va haver 225 milions ment per desenvolupar una vacuna que es creude casos de malària al món, un 90% dels quals que, en combinació amb les mesures actuals,a l’Àfrica. podria contribuir significativament a un millor control de la malària. Actualment ja hi ha unaActualment la malària és endèmica a més de vacuna que es troba en fase d’estudi clínic i que100 països localitzats a l’Àfrica Subsahariana i serà efectiva en un 50% dels casos.a regions del sud de l’Àsia, de l’Amèrica Llatinai d’Oceania. Els últims informes indiquen quela meitat de la població mundial viu a àrees onexisteix risc de contraure aquesta malaltia ion, a part de les conseqüències en la salut dela població, la malària contribueix a debilitarencara més la situació econòmica de la zona. En aquest taller investigaràs ambPer tal d’eradicar la malaltia, a les zones amb diferents candidats a vacuna per decidiralt risc de transmissió s’estan duent a terme quin pot ser el més eficaç de totsdiferents intervencions que suposen una com- Països o zones on es produeix la transmissió de malària Països o zones amb risc limitat de transmissió de malàriaFont: Organització Mundial de la Salut (OMS). Dades de 2009 2
  3. 3. Com es transmet la malària? Per què és necessària una vacuna contra la malària?La malària és una malaltia infecciosa ques’encomana amb la picada d’un mosquit delgènere Anopheles que transmet paràsits del Històricament les vacunes han constituït ungènere Plasmodium i que per tant actua com dels mitjans més eficaços per prevenir malal-a vector. Dins l’organisme humà els paràsits ties i salvar vides, especialment en el cas de leses multipliquen al fetge i després infecten els malalties infeccioses. L’obtenció d’una vacunaglòbuls vermells. Entre els símptomes de la parcialment eficaç podria significar la possibili-malària destaca la febre, el mal de cap i els tat de salvar centenars de milers de vides.vòmits, que apareixen entre deu i quinze diesdesprés de la picada del mosquit. L’obtenció d’una vacuna suposarà un gran pas endavant i es podrà afegir a l’arsenal actual de mesures utilitzades per a la prevenció de la malària, com per exemple les mosquiteres impregnades amb insecticida i el tractament oportú i adequat dels casos diagnosticats de malària.Com s’està intervenint percontrolar la malària? Com que la seva eficàcia a curt termini seràLes intervencions fonamentals per controlar la parcial, no substituirà aquestes mesures sinómalària es poden dividir en diferents grups: que les complementarà i conjuntament consti- tuiran una resposta integral per a la prevenció de la malària.1 Estratègies contra el mosquit o vector, com ara la fumigació dels espais tancats amb insecticides.2 Estratègies per evitar el contacte vector-hoste, com ara l’ús de mosquiteres impregnades amb insecticida.3 Estratègies contra el paràsit. Dins d’aquest grup d’estratègies trobem el tractament amb combinacions de fàrmacs basats en una molèculaanomenada artemisinina, que és ràpid i eficaç.Una vacuna també seria una estratègia decontrol contra el paràsit que, en combinacióamb altres estratègies, podria contribuirsignificativament a l’eradicació de la malària. 3
  4. 4. Què fem a l’ISGLOBAL, l’Institut de Salut Global de Barcelona?L’Institut de Salut Global de Barcelona (ISGlobal) 1. Estudi de les bases moleculars de la malal-és una organització sense ànim de lucre, l’ob- tia així com les diferents respostes immuni-jectiu de la qual és millorar la salut i el desen- tàries.volupament de les poblacions més vulnerablesmitjançant la generació, la gestió, la transmissió 2. Desenvolupament de nous fàrmacs i avalua-i l’aplicació de coneixements. La seva visió és un ció de la seva seguretat, eficàcia i efectivitat.món on tothom pugui gaudir de bona salut i, en-tre d’altres institucions, compta amb el suport 3. Avaluació de les característiques epidemio-de l’Obra Social “la Caixa”. lògiques de la malària en diferents entorns i dels aspectes socioculturals que l’envolten.Un dels pilars essencials de l’ISGlobal és larecerca centrada en problemes de salut que 4. Anàlisi de l’efectivitat de diferents eines deafecten les poblacions més vulnerables i es prevenció així com de la relació cost-efecti-desenvolupa des del Centre de Recerca en vitat de les intervencions.Salut Internacional de Barcelona (CRESIB). Larecerca en malària que es du a terme des del Dins de l’àmbit (4), el CRESIB du a termeCRESIB se centra en: estudis clínics de seguretat, d’eficàcia i d’efec- tivitat de vacunes. Actualment participa en el desenvolupament de la vacuna RTS,S contra la malària, que està resultant efectiva en més del 50% dels infants infectats. En paral·lel, els investigadors del CRESIB estan investigant per identificar nous candidats a vacuna. 4
  5. 5. Objectius del taller 1En aquest taller et convidem a analitzar di-ferents candidats a vacuna contra la malàriaamb què el CRESIB està investigant per tal queidentifiquis quin és el millor candidat. Els can-didats a vacuna del CRESIB han estat obtingutsde proteïnes del paràsit que prèviament s’hanpurificat.Per analitzar-los disposaràs de diferentsmostres de sang de persones residents a zonesafectades per malària, que ja han patit la malal-tia en diverses ocasions, i que ja estan immu-nitzades.Per confirmar que els nostres candidats avacuna són efectius, ens cal comprovar que lespersones immunitzades han desenvolupat unaresposta contra aquests candidats. Si en lespersones s’observa una activació de la resposta 2immunitària contra les proteïnes candidates,voldrà dir que podrien ser bons candidats avacuna perquè també podrien desencadenar laresposta necessària per protegir contra futuresinfeccions. 3 5
  6. 6. L’objectiu d’aquest taller és que us familiaritzeu indicarà que ha estat capaç d’activar una bonaamb una de les tècniques més utilitzades als resposta immunitària i que, per tant, es podrialaboratoris de biomedicina, la tècnica ELISA tractar d’un bon candidat.(Enzim Linked Immuno Sorbent Assay). Gràcies a aquesta tècnica descobrirem concre-Es tracta d’una anàlisi per detectar si a les tament quin dels antígens de què disposem almostres de sang hi ha anticossos. La presència laboratori és un bon candidat a vacuna contra lad’anticossos específics contra els candidats malària. Principis bàsics de la tècnica ELISAEl principi bàsic d’aquesta tècnica es basa en la Per dur a terme la identificació s’utilitzen unsinteracció del candidat a vacuna, o antigen (1), anticossos que tenen associada una molèculaamb l’anticòs (2). Un anticòs específic s’unirà anomenada enzim (3), que té la capacitat dea un antigen específic per donar un complex reaccionar amb una substància que hi afegirem,antigen-anticòs exclusiu. anomenada substrat (4), i donar lloc a un color.La tècnica ELISA ens permet identificar si hi Així doncs, si la mostra tenia l’anticòs quehavia anticossos, i per tant, si s’han format els volíem detectar, aquest s’unirà al que afegiremcomplexos antigen-anticòs en posar en con- unit a un enzim, que alhora farà canviar detacte les mostres de sang amb els candidats a color el substrat i així ens indicarà el resultatvacuna. positiu. Substrat Enzim Anticòs Antigen1. Antigen: qualsevol material estrany que s’uneix de manera específica als anticossos o limfòcits específics i activen una resposta immunitària. En general els antígens tenen un pes molecular elevat i normalment són proteïnes o polisacàrids.2. Anticòs: proteïnes (immunoglobulines - Ig) del sèrum que es formen en resposta a la invasió de molècules foranes en el cos, bé per exposició natural a un antigen o per immunització mitjançant vacunes. Tenen forma de Y i estan formats per quatre cadenes polipeptídiques que es mantenen unides mitjançant enllaços disulfur intercatenaris. El anticossos tenen una regió constant i una regió variable.3. Enzim: proteïna que facilita reaccions específiques del metabolisme.4. Substrat: solució que conté un compost sobre el qual actuarà un enzim. 6
  7. 7. Organització del tallerPer tal d’analitzar quin dels candidats a vacuna contra malària tenen anticossos contra aquests.o antígens és el més efectiu, analitzarem si les Per fer-ho dividirem l’experiment en 3 etapesmostres de sang de persones immunitzades principals.1. UNIÓ DE LES PROTEÏNES CANDIDATES (O ANTÍGENS) A LA SUPERFÍCIE DELS POUETSEl primer pas serà fixar les proteïnes candidates objecte d’estudi a un suport sòlid2. FORMACIÓ DE COMPLEXOS ANTIGEN-ANTICOSSOSDesprés hi afegirem les mostres de sang, concretament el sèrum (que correspon a les mostres desang un cop extretes les cèl·lules i els factors de coagulació), i un anticòs marcat amb un enzim,que anomenarem anticòs secundari. A les mostres de sang on hi havia l’anticòs d’estudi es forma-ran complexos antigen-anticòs, que alhora s’uniran a l’anticòs marcat amb l’enzim. Sèrum Anticòs 2ari dels pacients marcat amb enzim3. LECTURA DE LA REACCIÓPer últim, hi afegirem el substrat de l’enzim, que si hi ha presència del complex antigen-anticòscanviarà de color. D’aquesta manera podrem saber si les mostres de sang tenien l’anticòs d’estudi ien quines quantitats. Substrat de l’enzim Resultats i conclusionsAmb els resultats obtinguts podrem decidir immunitària més intensa i per tant pot ser elquin candidat a vacuna activa una resposta millor candidat. 7
  8. 8. Equipament i materialnecessariInstruments i estris de laboratori Agitador magnètic (1) (per Nucli magnètic i Micropipeta preparar PBS-Tween) “pescanuclis” de 20 a 200 µl (2) Proveta Ampolla de vidre Cronòmetre Embut de 100 ml de 250 mlMaterial fungible Tires de 12 pouets Pipetes Pasteur de Puntes per a micropipeta d’ELISA i suports plàstic graduades Paper absorbent Retolador permanent Guants, ulleres i bata1. En cas que no tinguis agitadors magnètics pots comprar el PBS líquid2. En cas que no tinguis micropipetes pots utilitzar pipetes Pasteur de poc volum 8
  9. 9. Reactius i mostres Solució tampó PBS (3) Detergent Tween-20 (4) Aigua destil·lada Anticòs 2ari A B C+ C- Candidats a vacuna Controls positius Anticòs secundari (antígens) i negatius (5) amb enzim (peroxidasa) Substrat 1 2 3 4 Substrat o solució de Mostres de sèrum de 4 persones residents a zones revelatge endèmiques de la malària que han esdevingut immunes a la malaltia3. Ajuda a mantenir el pH de la solució gràcies a fosfats de sodi i de potassi.4. Ajuda a prevenir unions d’anticossos inespecífiques5. C+: conté una barreja de sèrums de persones residents a zones endèmiques de la malària i que són immunes a la malaltia. C-: barreja de sèrums de persones que mai no han estat exposades a la malària 9
  10. 10. ProcedimentsPer determinar la presència o l’absència d’an- de diferents pacients que resideixen a zones en-ticossos específics contra els 2 antígens can- dèmiques de malària amb aquests antígens, perdidats a vacuna de què disposem al laboratori, tal de veure si en aquests sèrums trobem anti-confrontarem la sang (concretament el sèrum) cossos específics contra els nostres antígens. 1 Unió dels antígens a la superfície del pouetsLes tires de micropouets es recobreixen amb La unió d’aquests antígens a la superfície delsels candidats a vacuna (antígens) que volem pouets es produeix amb facilitat perquè estanprovar per veure si serien bons candidats a una fets amb un plàstic tractat que té una granvacuna contra la malària. afinitat per unir proteïnes.PROTOCOL PER A LA UNIÓ DELS ANTÍGENS A LA SUPERFÍCIE DELS POUETS1 A continuació anota què posaràs a cada pouet (controls, mostres de sang i nom dels antígens que analitzaràs).2 Retola els pouets marcant on posaràs cada mostra. 10
  11. 11. 3 Prepara una solució de rentatge (PBS-Tween 0,05%).A B Mesura 200 ml d’aigua destil·lada utilitzant la proveta i enrasant amb la pipeta Pasteur. Diposita el nucli magnètic dins l’ampolla Afegeix els 200 ml d’aigua destil·lada dins i dilueix amb l’aigua 1 pastilla de PBS l’ampolla amb l’embut. utilitzant l’agitador magnètic.C D Un cop la pastilla s’ha dissolt, extreu el nucli magnètic i afegeix-hi 100 µl de Tween-20 Remena-ho bé invertint l’ampolla unes amb una pipeta Pasteur de plàstic. quantes vegades.Nota: La solució de rentatge conté PBS (phosphate buffer saline), que permet que els anticossos es mantinguin en unambient estable que ajuda a conservar-ne l’estructura. El Tween-20 és un detergent que ajudarà a eliminar les proteïnesque s’hagin pogut unir de manera no específica i s’uneix a les parts del pouet que no estan cobertes per antigen i d’aquestamanera es redueix el soroll de fons. 11
  12. 12. 4 5 Afegeix els dos antígens problema als pouets corresponents utilitzant la micropipeta (50 µl per pouet). És important que facis servir una punta neta per dispensar els antígens, així evitarem contaminacions. Deixa-ho incubar durant 5 minuts a temperatura ambient.6 7 Renta-ho per eliminar l’excés d’antigen Elimina les restes d’antigen mitjançant no unit a la tira. Per fer-ho, omple inversió de la tira sobre un paper els pouets amb la solució de rentatge absorbent. mitjançant una pipeta Pasteur de plàstic.8 9Descarta la solució de rentatge mitjançantinversió de la tira sobre un paper absorbent. Repeteix els passos 7 i 8 un cop més. 12
  13. 13. 2 Formació de complexos antigen-anticossosEn aquest pas, primer addicionarem el sèrum anomenat peroxidasa. Com que a cada anticòsdels pacients per analitzar si contenen anti- primari se li pot unir més d’un anticòs secun-cossos contra el candidat a vacuna. A aquests dari, la quantitat de color que s’obtindrà en elanticossos que volem analitzar els anomena- pas tres serà amplificada. D’aquesta manera larem anticossos primaris. Després hi afegirem tècnica tindrà més sensibilitat.un anticòs secundari marcat amb un enzim Sèrum Anticòs 2ari dels pacients marcat amb enzimPROTOCOL DE FORMACIÓ DE COMPLEXOS ANTIGEN-ANTICOSSOS1 2 Afegeix els controls positius i negatius Afegeix les diferents mostres de als pouets corresponents utilitzant la sèrums de 4 residents a zones micropipeta (50 µl per pouet). endèmiques de malària als El control positiu (C+) conté una barreja pouets corresponents utilitzant la de sèrums de persones residents a micropipeta (50 µl per pouet). zones endèmiques de malària i que són immunes a la malaltia. El control negatiu (C-) conté una barreja de sèrums de persones que mai no han estat exposades a la malària. 13
  14. 14. 3 4 Deixa-ho incubar durant 5 minuts a Elimina l’excés de mostra mitjançant temperatura ambient. inversió de la tira sobre un paper absorbent.5 6 Renta tots els pouets per eliminar els anticossos que no han reaccionat amb els antígens i que per tant no són específics. Omple els pouets amb la Descarta la solució de rentatge solució de rentatge mitjançant una mitjançant inversió de la tira sobre un pipeta Pasteur de plàstic. paper absorbent.7 8 Amb la micropipeta, afegeix l’anticòs secundari que està unit a un enzim a Repeteix el pas 5 i 6 dues vegades més. tots els pouets (50 µl per pouet). 14
  15. 15. 9 10 Elimina l’excés d’anticòs secundari Deixa-ho incubar durant 5 minuts a mitjançant inversió de la tira sobre un temperatura ambient. paper absorbent.11 12 Renta els pouets omplint-los amb la Descarta la solució de rentatge solució de rentatge mitjançant una mitjançant inversió de la tira sobre un pipeta Pasteur de plàstic. paper absorbent.13 Repeteix els dos passos anteriors 3 vegades més. 15
  16. 16. 3 Lectura de la reaccióUn cop ho hem rentat per eliminar totes lesmolècules marcades no fixades en forma decomplexos antigen-anticossos s’hi afegeix elsubstrat enzimàtic en solució, que facilitarà elcanvi de color. Substrat de l’enzimPROTOCOL DE LA LECTURA DE LA REACCIÓ1 2 Deixa-ho incubar durant 5 minuts. Durant Afegeix el substrat de l’enzim a tots els aquest temps el substrat s’unirà a l’enzim pouets amb la micropipeta i anirà apareixent el color a temperatura (50 µl per pouet). ambient. 16
  17. 17. 3 Recull-ne els resultats en forma de gràfic de barres.ANTIGEN 1màximIntensitatmínim Mostres C+ C- M1 M2 M3 M4ANTIGEN 2màximIntensitatmínim Mostres C+ C- M1 M2 M3 M4 17
  18. 18. Resultats i conclusions Interpreta i apunta els resultats 1. Quin dels antígens que has provat creus que és el millor candidat a vacuna? Creus que els antígens que has provat són un bon candidat a vacuna? Per què? 2. Quan una reacció és positiva i quan és negativa? Per què? 3. Per què creus que s’utilitzen els controls? 18
  19. 19. 4. Quina part de l’anticòs primari és reconeguda per l’anticòs secundari: la regió constanto la variable? Raona la resposta.5. Què passaria si no féssim els rentatges abans de posar el substrat de revelatge?6. Podríem utilitzar sang de companys de la teva classe per determinar si els nostres antígensde laboratori són bons candidats per a una vacuna contra la malària? Raona la resposta.7. Creus que amb aquest experiment ha quedat demostrat que el candidat seleccionatestimula la resposta immunitària? Caldria fer algun altre tipus d’experiment per avaluar sitambé és capaç d’activar alguna altre tipus de resposta? 19
  20. 20. Annex I ÚS OBLIGATORI ÚS OBLIGATORI ÚS OBLIGATORI D’ULLERES DE BATA DE GUANTSPrecaucions de seguretatINFORMA’T utilitzes productes tòxics o corrosius. No apro-Localitza els elements de seguretat del labora- pis envasos de reactius a una flama. No escalfistori o l’espai habilitat per experimentar líquids inflamables. Transporta les ampolles(extintors, dutxes o bany, sortides, etc.). Llegeix agafant-les pel fons, mai per la boca.atentament les instruccions abans de fer unexperiment. No oblidis llegir les etiquetes de ELIMINACIÓ DE RESIDUSseguretat de reactius i d’aparells. Diposita a contenidors especials i degudament senyalitzats: el vidre trencat, els reactius tòxics,UTILITZA VESTIMENTA ADEQUADA nocius o perjudicials per al medi ambient, i elsGuants, bata i ulleres de protecció. residus biològics. Mai no s’han de tirar residus sòlids a la pica.NORMES GENERALSEstà prohibit fumar, menjar o beure al labora- En cas d’accident, avisa immediatament l’edu-tori o a l’espai habilitat per experimentar. cador. Recorda: Davant de qualsevol dubte,Renta’t les mans abans de sortir del laboratori. consulta’l amb l’educador.Treballa amb ordre, netedat i sensepresses. Si et cau un producte, recull-lo imme- PRECAUCIONS ESPECÍFIQUESdiatament. Deixa sempre el material PER A AQUEST TALLERnet i endreçat. No utilitzis mai un equip o apa- En aquesta pràctica manipularàs reactius querell sense conèixer-ne perfectament el hauràs de manipular seguint les precaucionsfuncionament. usuals per a la manipulació de productes quí- mics. A continuació s’enumeren només els queMANIPULACIÓ DE VIDRE presenten els graus de perillositat següents:Protegeix-te les mans quan manipulis material  de vidre. No utilitzis vidre esquerdat. • PBS: tòxic per ingestió, inhalació i contacte amb laPRODUCTES QUÍMICS pell.  No utilitzis cap flascó de reactius sense eti-queta. No ensumis, inhalis, tastis o toquis els • Tween 20:    productes químics. No pipetegis mai amb la tòxic per ingestió, inhalació i contacte amb laboca. Posa’t guants i renta’t les mans sovint si pell. Irritant.Annex IIReferències dels reactiusNOM REFERÈNCIA CASA COMERCIALPBS P4417-50TAB SigmaTween-20 P1379-100ML SigmaCHK IGY, bagged (=ANTIGEN) 1662406EDU BioRadRB ANTI-CHK, bagged (=PLASMA) 1662407EDU BioRadGAR-HRP, bagged (=ANTICÒS 2ari) 1662408EDU BioRadSUBSTRAT REVELATGE 1662402EDU BioRad 20
  21. 21. Continua investigant a Xplore Health!Investigadors que hi han contribuït amb continguts: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal. DESENVOLUPAT PER Aquesta obra està inclosa amb una llicència Attribution-NonCommercial- NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Per veure una còpia de la llicència, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

×