Investiga la vacunade la malariaTaller de experimentaciónPROTOCOLO
IntroducciónLa malaria es considerada la enfermedad más                         combinación de diferentes medidas que incl...
¿Cómo se transmite la malaria?                      ¿Por qué es necesaria una vacuna                                      ...
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ProcedimientosPara determinar la presencia o la ausencia de        el suero) de diferentes pacientes que residen enanticue...
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Resultados y conclusiones Interpreta y apunta los resultados 1. ¿Qué antígeno de los que has probado crees que es el mejor...
4. ¿Qué parte del anticuerpo primario es reconocida por el anticuerpo secundario: la regiónconstante o la variable? Razona...
Anexo I                                                     USO OBLIGATORIO   USO OBLIGATORIO   USO OBLIGATORIO           ...
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Investiga la vacuna de la malaria

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Siguiendo este protocolo, los jóvenes participan en la investigación para desarrollar una vacuna contra la malaria que, en combinación con las medidas actuales, podría contribuir de forma significativa a controlar mejor esta importante enfermedad causada por un parásito. Los estudiantes probarán distintas vacunas posibles utilizando una técnica llamada ELISA y decidirán cuál es la más eficaz. El protocolo del experimento es una oportunidad para que los centros de ciencias, los museos y los colegios simulen un experimento real realizado en un laboratorio real para investigar la vacuna de la malaria.

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Investiga la vacuna de la malaria

  1. 1. Investiga la vacunade la malariaTaller de experimentaciónPROTOCOLO
  2. 2. IntroducciónLa malaria es considerada la enfermedad más combinación de diferentes medidas que inclu-importante del mundo debida a un parásito y es yen la utilización de mosquiteras impregnadasresponsable de la muerte de aproximadamen- de insecticida, de aerosoles insecticidas, dete 800.000 personas cada año, especialmente tratamientos de prevención, la implantación deniños menores de cinco años y mujeres emba- programas educativos e intervenciones ambien-razadas. Según la Organización Mundial de la tales, entre otras cosas.Salud (OMS), unos 3.000 millones de personascorren el riesgo de contraer la infección, y en el La comunidad científica está trabajando in-año 2010 se produjeron 225 millones de casos tensamente para desarrollar una vacuna quede malaria en el mundo, de los cuales un 90% se cree que, en combinación con las medidastuvieron lugar en África. actuales, podría contribuir significativamente a un mejor control de la malaria. Actualmente yaActualmente, la malaria es endémica en más de existe una vacuna que se encuentra en fase de100 países localizados en el África Subsahariana estudio clínico y que será efectiva en un 50% dey regiones del sur de Asia, de Latinoamérica y de los casos.Oceanía. Los últimos informes indican que la mi-tad de la población mundial vive en áreas dondeexiste riesgo de contraer la enfermedad y donde,además de las consecuencias sobre la salud dela población, la malaria contribuye a debilitaraún más la situación económica de la zona. En este taller investigarás con diferentes candidatos a vacuna para decidirPara erradicar la enfermedad, en las zonas con cuál es el más eficaz.alto riesgo de transmisión se están llevando acabo varias intervenciones que suponen una Países o zonas donde se produce la transmisión de malaria Países o zonas con riesgo limitado de transmisión de malariaFuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). Datos de 2009 2
  3. 3. ¿Cómo se transmite la malaria? ¿Por qué es necesaria una vacuna contra la malaria?La malaria es una enfermedad infecciosa quese contagia mediante la picadura de un mosqui- Históricamente las vacunas han constituidoto del género Anopheles que transmite parási- uno de los medios más eficaces para prevenirtos del género Plasmodium y que por lo tanto enfermedades y salvar vidas, especialmenteactúa como vector. Dentro del organismo huma- en el caso de las enfermedades infecciosas. Lano, los parásitos se multiplican en el hígado y a obtención de una vacuna parcialmente eficazcontinuación infectan los glóbulos rojos. Entre podría significar la posibilidad de salvar a cien-los síntomas de la malaria destaca la fiebre, tos de miles de vidas.el dolor de cabeza y los vómitos, que aparecenentre 10 y 15 días después de la picadura del La obtención de una vacuna supondrá un granmosquito. paso adelante y se podrá añadir al arsenal ac- tual de medidas utilizadas para la prevención de la malaria, como las mosquiteras impregnadas con insecticida y el tratamiento oportuno y ade- cuado de los casos diagnosticados de malaria.¿Cómo se está interviniendo para Como su eficacia a corto plazo será parcial, nocontrolar la malaria? sustituirá estas medidas, sino que las comple-Las intervenciones fundamentales para contro- mentará y, conjuntamente, constituirán unalar la malaria se dividen en varios grupos: respuesta integral para la prevención de la malaria.1 Estrategias contra el mosquito o vector, como la fumigación de los espacios cerrados con insecticidas.2 Estrategias para evitar el contacto vector- huésped, como el uso de mosquiteras impregnadas con insecticida.3 Estrategias contra el parásito. Dentro de este grupo de estrategias, encontramos el tratamiento con combinaciones de fármacos basados enuna molécula llamada artemisinina, que esrápido y eficaz. Una vacuna también sería unaestrategia de control contra el parásito que,en combinación con otras estrategias, podríacontribuir significativamente a la erradicaciónde la malaria. 3
  4. 4. ¿Qué hacemos en ISGLOBAL, el Instituto de Salud Global de Barcelona?El Instituto de Salud Global de Barcelona 1. Estudio de las bases moleculares de la(ISGlobal) es una organización sin ánimo de enfermedad, así como de las diferenteslucro, cuyo objetivo es mejorar la salud y el respuestas inmunitarias.desarrollo de las poblaciones más vulnerablesmediante la generación, la gestión, la transmi- 2. Desarrollo de nuevos fármacos y evaluaciónsión y la aplicación de conocimientos. Su visión de su seguridad, eficacia y efectividad.es un mundo donde todos podamos gozar deuna buena salud y, entre otras instituciones, 3. Evaluación de las características epidemio-cuenta con el apoyo de la Obra Social "la Caixa". lógicas de la malaria en diferentes entornos y de los aspectos socioculturales que la rodean.Uno de los pilares esenciales de ISGlobal es lainvestigación centrada en problemas de salud 4. Análisis de la efectividad de diferentes herra-que afectan a las poblaciones más vulnerables mientas de prevención, así como de la rela-y se desarrolla desde el Centro de Investigación ción coste-efectividad de las intervenciones.en Salud Internacional de Barcelona (CRESIB).La investigación sobre la malaria que se lleva a Dentro del ámbito (4), el CRESIB lleva a cabocabo desde el CRESIB se centra en: estudios clínicos de seguridad, de eficacia y de efectividad de vacunas. Actualmente participa en el desarrollo de la vacuna RTS,S contra la malaria, que está resultando efectiva en más del 50% de los niños infectados. En paralelo, los investigadores del CRESIB están investigando para identificar nuevos candidatos a vacuna. 4
  5. 5. Objetivos del taller 1En este taller te invitamos a analizar diferen-tes candidatos a vacuna contra la malaria conlos que el CRESIB está investigando, para queidentifiques cuál es el mejor candidato. Loscandidatos a vacuna del CRESIB han sido obte-nidos de proteínas del parásito que previamentese han purificado.Para analizarlos dispondrás de varias muestrasde sangre de personas residentes en zonasafectadas por malaria que ya han sufrido laenfermedad en varias ocasiones y que ya estáninmunizadas.Para confirmar que nuestros candidatos a vacu-na son efectivos, tenemos que comprobar quelas personas inmunizadas han desarrollado unarespuesta contra esos candidatos. Si en las per-sonas se observa una activación de la respuesta 2inmunitaria contra las proteínas candidatas,significará que podrían ser buenos candidatos avacuna porque también podrían desencadenarla respuesta necesaria para protegerse contrafuturas infecciones. 3 5
  6. 6. El objetivo de este taller es que te familiarices candidatos indicará que ha sido capaz de acti-con una de las técnicas más utilizadas en los var una buena respuesta inmunitaria y que, porlaboratorios de biomedicina, la técnica ELISA lo tanto, se podría tratar de un buen candidato.(“Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”). Gracias a esta técnica descubriremos concreta-Se trata de un análisis para detectar si en mente cuál de los antígenos de los que dispo-las muestras de sangre hay anticuerpos. La nemos en el laboratorio es un buen candidato apresencia de anticuerpos específicos contra los vacuna contra la malaria. Principios básicos de la técnica ELISAEl principio básico de esta técnica se basa en la Para llevar a cabo la identificación, se utilizaninteracción del candidato a vacuna, o antígeno unos anticuerpos que tienen asociada una molé-(1), con el anticuerpo (2). Un anticuerpo especí- cula llamada enzima (3), que tiene la capacidadfico se unirá a un antígeno específico para dar de reaccionar con una sustancia llamada sustra-un complejo antígeno-anticuerpo exclusivo. to (4) que le añadiremos, y producir un color.La técnica ELISA nos permite identificar si Así pues, si la muestra tenía el anticuerpo quehabía anticuerpos, y por lo tanto, si se han queríamos detectar, éste se unirá al que aña-formado los complejos antígeno-anticuerpo al diremos unido a una enzima, que a la vez haráponer en contacto las muestras de sangre con que el sustrato cambie de color y de este modolos candidatos a vacuna. nos indicará el resultado positivo. Sustrato Enzima Anticuerpo Antígeno1. Antígeno: cualquier material extraño que se une de forma específica a los anticuerpos o linfocitos específicos para activar una respuesta inmunitaria. En general, los antígenos tienen un peso molecular elevado y normalmente son proteínas o polisacáridos.2. Anticuerpo: proteínas (inmunoglobulinas o Ig) del suero que se forman como respuesta a la invasión de moléculas extrañas en el organismo, bien por exposición natural a un antígeno o por inmunización mediante vacunas. Tienen forma de Y y están formados por cuatro cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro intercatenarios. Los anticuerpos tienen una región constante y una región variable.3. Enzima: proteína que facilita reacciones específicas del metabolismo.4. Sustrato: solución que contiene un compuesto sobre el cual actuará una enzima. 6
  7. 7. Organización del tallerPara analizar qué candidato a vacuna o antígeno laria tienen anticuerpos contra los mismos.es el más efectivo, analizaremos si las muestras Para ello dividiremos el experimento en 3 eta-de sangre de personas inmunizadas contra ma- pas principales.1. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS CANDIDATAS (O ANTÍGENOS) A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOSEl primer paso será fijar las proteínas candidatas objeto de estudio a un soporte sólido2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPODespués añadiremos las muestras de sangre, concretamente el suero (que corresponde a lasmuestras de sangre una vez extraídas las células y los factores de coagulación), y un anticuerpomarcado con una enzima que denominaremos anticuerpo secundario. En las muestras de sangredonde esté presente el anticuerpo de estudio se formarán complejos antígeno-anticuerpo, que a suvez se unirán al anticuerpo marcado con la enzima. Anticuerpo Suero secundario de los pacientes marcado con enzima3. LECTURA DE LA REACCIÓNPor último, añadiremos el sustrato de la enzima, que cambiará de color en caso de que hubieracomplejos antígeno-anticuerpo. De este modo podremos saber si las muestras de sangre tenían elanticuerpo de estudio y en qué cantidad. Sustrato de la enzima Resultados y conclusionesCon los resultados obtenidos podremos decidir inmunitaria más intensa y por lo tanto puedequé candidato a vacuna activa una respuesta ser el mejor candidato. 7
  8. 8. Equipamiento y materialnecesarioInstrumentos y utensilios de laboratorio Agitador magnético (1) Núcleo magnético y Micropipeta (para preparar PBS-Tween) "pesca-núcleos" de 20 a 200 µl (2) Probeta Botella de cristal Cronómetro Embudo de 100 ml de 250 mlMaterial fungible Tiras de 12 pocillos Pipetas Pasteur Puntas para micropipeta de ELISA y soportes de plástico graduadas Papel absorbente Rotulador permanente Guantes, gafas y bata1. En caso de que no tengas agitadores magnéticos, puedes comprar el PBS líquido2. En caso de que no tengas micropipetas, puedes utilizar pipetas Pasteur de poco volumen 8
  9. 9. Reactivos y muestras Solución tampón PBS (3) Detergente Tween-20 (4) Agua destilada Anticuerpo 2ario A B C+ C- Candidatos a vacuna Controles positivos Anticuerpo secundario (antígenos) y negativos (5) con enzima (peroxidasa) Sustrato 1 2 3 4 Sustrato o solución de Muestras de suero de 4 personas residentes en zonas revelado endémicas de la malaria que son inmunes a la enfermedad3. Ayuda a mantener el pH de la solución gracias a fosfatos de sodio y de potasio.4. Ayuda a prevenir uniones de anticuerpos inespecíficas5. C+: contiene una mezcla de sueros de personas residentes en zonas endémicas de malariay que son inmunes a la enfermedad. C-: mezcla de sueros de personas que nunca han estadoexpuestas a la malaria 9
  10. 10. ProcedimientosPara determinar la presencia o la ausencia de el suero) de diferentes pacientes que residen enanticuerpos específicos contra los 2 antígenos zonas endémicas de malaria con estos antígenos,candidatos a vacuna que tenemos en el labora- para ver si en estos sueros encontramos anti-torio, confrontaremos la sangre (concretamente cuerpos específicos contra nuestros antígenos. 1 Unión de los antígenos a la superficie de los pocillosLas tiras de micropocillos se recubren con los La unión de estos antígenos a la superficie decandidatos a vacuna (antígenos) que queremos los pocillos se produce con facilidad por estarprobar para ver si serían buenos candidatos a hechos con un plástico tratado que tiene unauna vacuna contra la malaria. gran afinidad para unir proteínas.PROTOCOLO PARA LA UNIÓN DE LOS ANTÍGENOS A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS1 A continuación anota qué pondrás en cada pocillo (controles, muestras de sangre y nombre de los antígenos que analizarás).2 Rotula los pocillos marcando donde pondrás cada muestra. 10
  11. 11. 3 Prepara una solución de lavado (PBS-Tween 0,05%).A B Mide 200 ml de agua destilada utilizando la probeta y enrasando con la pipeta Pasteur. Deposita el núcleo magnético dentro de Añade los 200 ml de agua destilada a la la botella y diluye con el agua 1 pastilla botella utilizando el embudo. de PBS utilizando el agitador magnético.C D Cuando la píldora se haya disuelto, extrae el núcleo magnético y añade 100 µl de Tween-20 Remuévelo bien invirtiendo la botella con una pipeta Pasteur de plástico. varias veces.Nota: La solución de lavado contiene PBS (phosphate buffer saline), que permite que los anticuerpos se mantengan en unambiente estable que ayuda a conservar su estructura. El Tween-20 es un detergente que ayudará a eliminar las proteínasque se hayan podido unir de forma no específica y se une a las partes del pocillo que no están cubiertas por antígeno.De este modo se reduce el ruido de fondo. 11
  12. 12. 4 5 Añade los dos antígenos problema a los pocillos correspondientes utilizando la micropipeta (50 µl por pocillo). Es importante que uses una punta limpia para dispensar los antígenos, así se evitarán contaminaciones. Deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.6 7 Lávalo para eliminar el exceso de antígenoElimina los restos de antígeno mediante no unido a la tira. Para ello, llena losinversión de la tira sobre un papel absorbente. pocillos con la solución de lavado mediante una pipeta Pasteur de plástico.8 9Descarta la solución de lavado medianteinversión de la tira sobre un papel absorbente. Repite los pasos 7 y 8 una vez más. 12
  13. 13. 2 Formación de complejos antígeno-anticuerpoEn este paso, primero acondicionaremos el con una enzima llamada peroxidasa. Como asuero de los pacientes para analizar si contie- cada anticuerpo primario se le puede unir másnen anticuerpos contra el candidato a vacuna. de un anticuerpo secundario, la cantidad deA estos anticuerpos que queremos analizar los color que se obtendrá en el paso tres será am-llamaremos anticuerpos primarios. Después plificada. De este modo la técnica tendrá másañadiremos un anticuerpo secundario marcado sensibilidad. Anticuerpo Suero de los secundario pacientes marcado con enzimaPROTOCOLO DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO1 2 Añade los controles positivos y negativos Añade las distintas muestras de a los pocillos correspondientes utilizando sueros de 4 residentes en zonas la micropipeta (50 µl por pocillo). endémicas de malaria a los pocillos El control positivo (C+) contiene una correspondientes utilizando la mezcla de sueros de personas residentes micropipeta (50 µl por pocillo). en zonas endémicas de malaria y que son inmunes a la enfermedad. El control negativo (C-) contiene una mezcla de sueros de personas que nunca han estado expuestas a la malaria. 13
  14. 14. 3 4 Déjalo incubar durante 5 minutos a Elimina el exceso de muestra mediante temperatura ambiente. inversión de la tira sobre un papel absorbente.5 6 Lava todos los pocillos para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado con los antígenos y que por lo tanto no son específicos. Llena los pocillos con la Descarta la solución de lavado mediante solución de lavado mediante una pipeta inversión de la tira sobre un papel absorbente. Pasteur de plástico.7 8 Con la micropipeta, añade el anticuerpo secundario que está unido a una enzima a todos los pocillos (50 µl por pocillo). Repite los pasos 5 y 6 dos veces más. 14
  15. 15. 9 10 Elimina el exceso de anticuerpo Deja incubar durante 5 minutos a secundario mediante inversión de la tira temperatura ambiente. sobre un papel absorbente.11 12 Lava los pocillos llenándolos con la Descarta la solución de lavado mediante solución de lavado mediante una pipeta inversión de la tira sobre un papel absorbente. Pasteur de plástico.13 Repite los dos pasos anteriores 3 veces más. 15
  16. 16. 3 Lectura de la reacciónDespués de lavarlo para eliminar todas lasmoléculas marcadas no fijadas en forma decomplejos antígeno-anticuerpo, se añade elsustrato enzimático en solución, que facilitaráel cambio de color. Sustrato de la enzimaPROTOCOLO DE LA LECTURA DE LA REACCIÓN1 2 Añade el sustrato de la enzima a todos Déjalo incubar durante 5 minutos. los pocillos con la micropipeta Durante este tiempo el sustrato se unirá (50 µl por pocillo). a la enzima e irá apareciendo el color a temperatura ambiente. 16
  17. 17. 3 Recoge los resultados en forma de gráfico de barras.ANTÍGENO 1máximoIntensidadmínimo Muestras C+ C- M1 M2 M3 M4ANTÍGENO 2máximoIntensidadmínimo Muestras C+ C- M1 M2 M3 M4 17
  18. 18. Resultados y conclusiones Interpreta y apunta los resultados 1. ¿Qué antígeno de los que has probado crees que es el mejor candidato a vacuna? ¿Crees que los antígenos que has probado son un buen candidato a vacuna? ¿Por qué? 2. ¿Cuándo una reacción es positiva y cuándo es negativa? ¿Por qué? 3. ¿Por qué crees que se utilizan los controles? 18
  19. 19. 4. ¿Qué parte del anticuerpo primario es reconocida por el anticuerpo secundario: la regiónconstante o la variable? Razona la respuesta.5. ¿Qué pasaría si no hiciéramos los lavados antes de poner el sustrato de revelado?6. ¿Podríamos utilizar sangre de compañeros de tu clase para determinar si nuestros antígenosde laboratorio son buenos candidatos para una vacuna contra la malaria? Razona la respuesta.7. ¿Crees que con este experimento ha quedado demostrado que el candidato seleccionadoestimula la respuesta inmunitaria? ¿Tendría que hacerse algún otro tipo de experimento paraevaluar si también es capaz de activar algún otro tipo de respuesta? 19
  20. 20. Anexo I USO OBLIGATORIO USO OBLIGATORIO USO OBLIGATORIO DE GAFAS DE BATA DE GUANTESPrecauciones de seguridadINFÓRMATE envases de reactivos a una llama. No calientesLocaliza los elementos de seguridad del labora- líquidos inflamables. Transporta las botellastorio o el espacio habilitado para experimentar sujetándolas por la base, nunca por la boca.(extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Leeatentamente las instrucciones antes de hacer ELIMINACIÓN DE RESIDUOSun experimento. No olvides leer las etiquetas Deposita en contenedores especiales y debida-de seguridad de reactivos y aparatos. mente señalizados el cristal roto, los reactivos tóxicos, nocivos o perjudiciales para el medioUTILIZA VESTIMENTA ADECUADA ambiente y los residuos biológicos. No tiresGuantes, bata y gafas de protección. nunca residuos sólidos por el fregadero.NORMAS GENERALES En caso de accidente, avisa inmediatamenteEstá prohibido fumar, comer o beber en el labo- al educador. Recuerda: Ante cualquier duda,ratorio o en el espacio habilitado para experi- consulta al educador.mentar.Lávate las manos antes de salir del laborato- PRECAUCIONES ESPECÍFICASrio. Trabaja ordenadamente, pulcramente y sin PARA ESTE TALLERprisas. Si se te cae algún producto, recógelo in- En esta práctica deberás seguir las precaucio-mediatamente. Deja siempre el material limpio nes generales para la manipulación de produc-y ordenado. No uses nunca un equipo o aparato tos químicos. A continuación se enumeran sólosin conocer perfectamente su funcionamiento. los que presentan los grados de peligrosidad siguientes:MANIPULACIÓN DE CRISTAL  Protégete las manos cuando manipules mate- • PBS:rial de cristal. No uses cristal agrietado. tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel.  PRODUCTOS QUÍMICOSNo uses ningún frasco de reactivos sin etiqueta. • Tween 20:    No huelas, inhales, pruebes o toques los pro- tóxico por ingestión, inhalación y contacto conductos químicos. No pipetees nunca con la boca. la piel. Irritante.Ponte guantes y lávate las manos a menudo siusas productos tóxicos o corrosivos. No acerquesAnexo IIReferencias de los reactivosNOMBRE REFERENCIA CASA COMERCIALPBS P4417-50TAB SigmaTween-20 P1379-100ML SigmaCHK IGY, bagged (= ANTÍGENO) 1662406EDU BioRadRB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) 1662407EDU BioRadGAR-HRP, bagged (= ANTICUERPO SECUNDARIO) 1662408EDU BioRadSUSTRATO REVELADO 1662402EDU BioRad 20
  21. 21. Sigue investigando en Xplore Health!Investigadores que han contribuido con contenidos: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal. DESARROLLADO POR Esta obra ha sido incluida con una licencia Attribution-NonCommercial- NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Para ver una copia de la licencia, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

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