Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

ADCs: Analytical and Bioanalytical Challenges

25,037 views

Published on

Presentation by Dr. Alain Beck, Senior Director, Antibody Physico-Chemistry, Centre d'Immunologie Pierre Fabre (CIPF), St Julien-en-Genevois, France. Talk given at Waters Antibody Drug Conjugates (ADC) 2014 Meeting, Nov. 20-21, Wilmslow UK.

Published in: Science
  • Creative discussion ! BTW if others are interested in a NJ DoR NJ-REG , my friend discovered a blank document here http://pdf.ac/alPTN0.
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

ADCs: Analytical and Bioanalytical Challenges

  1. 1. Manchester, Nov 20, 2014 (Waters ADC WS)       ADCs: analytical & bioanalytical challenges Alain Beck, PhD Senior Director, Antibody Physico‐Chemistry Centre d’Immunologie Pierre Fabre, FR Associate Editor, mAbs
  2. 2. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 2 Outline (1) Introduction • Therapeutic mAbs& related products • 1st, 2d and 3d generation ADCs (2) CIPF/PFM • R&D: mAbs and ADCs • Analytical and structural platform (3) Summary & Take‐home messages • OptimAbs/ OptimADCs • CIPF’s: analytical and MS network • PF/LSMBO/Waters collaboration  Beck A et al, Anal Chem 2012 2
  3. 3. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 3 (1) mAbs and ADCs
  4. 4. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 4 2015? MAA secukinumab(IL17a) dinutuximab(GD2) evolocumab[IgG2] (PSK9)  blinatumomab(CD19/CD3)  necitumumab(EGFR) 2014 ramucirumab(VEGFR‐2)  siltuximab(IL6) vedolizumab(α4β7) nivolumab[IgG4s] (PD1)[Jpn]  pembrolizumab[IgG4s] (PD1) 2013 itolizumab(CD6)[Ind] ado trastuzumab emtansine(HER2)    obinutuzumab[low Fuc] (CD20) [Remsima/infliximab, EMA] 2012 mogamulizumab[low Fuc] (CCR4)[Jpn] pertuzumab(HER2) ziv‐aflibercept[PrFc] (VEGF) raxibacumab(antrax) 2011 brentuximab vedotin[IgG1‐vcMMAE] (CD30)  belatacept[PrFc] (CD80/86)   aflibercept[PrFc] (VEGF)  belimumab(BLysS)  ipilimumab(CTLA‐4) 2010 denosumab[IgG2] (RANK‐L) 2009 golimumab(TNF) catumaxomab(EpCAM/CD3) ustekinumab(IL12/23) canakinumab(IL1) ofatumumab(CD20) 2008 rinolacept[PrFc] (IL1) certolizumab[Fab‐PEG] (TNF) romiplostim[FcPe] (TPO)                                       [Clotinab/abciximab So‐Ko] 2007 eculizumab[IgG2/4] (C5)  [Reditux/rituximab Ind] 2006 ranibizumab[Fab] (VEGFA) panitumumab[IgG2] (EGFR) 2005 nimotuzumab(EGFR)[Chi] abatacept[PrFc] (CD80/86)  tocilizumab(IL6R)[Jpn] 2004 cetuximab(EGFR) bevacizumab(VEGFA) natalizumab[IgG4] (4 integr) 2003 131 I‐tositumomab[mIgG2a] (CD20) )[withdrawn 2014] omalizumab(IgE‐Fc) efalizumab(CD11a)[withdrawn, 2009] alefacept[PrFc] (CD2) 2002 111 In/90 Y‐ibritumomab tiuxetan[mIgG1] (CD20) adalimumab(TNF) 2001 alemtuzumab(CD52) 2000 gemtuzumab ozogamicin[IgG4s‐calicheamycin] (CD33)[withdrawn 2010] 1999 1998 basiliximab(CD25) palivizumab(RSV‐F) infliximab(TNF) trastuzumab(HER2) etanercept[PrFc] (TNF) Technologies  1997 rituximab(CD20) daclizumab(CD25) Transgenic mice (10Y) 1996 1995 edrecolomab[mIgG2a] (EpCAM)[Ger, withdrawn]         1994 abciximab[Fab] (GPIIb)  Phage display (9Y) 1993 Humanization (11Y) 1986 muromomab[mIgG2a] (CD3) Chimerization (10 Y) 1984 Nobel Prize for mAbs > 50  approved mAbs, Fabs,  Fc‐fusions,  ADCs,  RadioICs,  Bispecs [28 years] (INN=  International  Non‐proprietary  Names, WHO) * FDA, EMA, SFDA and /or DCGI (SFDA = China FDA; DCGI = Drugs Controller General of India) [Biosimilars mAbs] TheramAbs*
  5. 5. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 5
  6. 6. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 6
  7. 7. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 7ADCs Panowski S et al, mAbs 2014 (A) Architectures (B) Mechanisms of Action
  8. 8. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 8Current Conjugation Strategies (A) Lysines conjugation  Gemtuzumab ozogamicin  Trastuzumab emtansine (B) Reduced native cysteines conjugation  Brentuximab vedotin (C) Engineered cysteines conjugation  Thio-trastuzumab K. Lin (Genentech), Pharm Res, 2012Covalent IgGs Covalent + Non covalent Covalent IgGs A B C
  9. 9. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 9 (1)  1st generation ADC reaching the market Mylotarg® (gentuzumab ozogamicin) (2000‐2010)
  10. 10. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 10 Mylotarg® O O O I S O OH O HO O HO O N H O HO O HO O H N O O S SN H O N O O NH O O N O O O Calicheamycin = (2 to 3/ IgG) Gemtuzumab (HzIgG4SerPro) -Lys-NH2 (random) Linker -hydrazone- Hughes B, Nature Drug Discovery 2010 FDA approval: 2000 Market withdraw: 2010 Gemtuzumab ozogamicin
  11. 11. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 11 Gemtuzumab ozogamicin: highly heterogeneous (A) nrSDS‐PAGE Labrijn et al, Nat Biotech 2009 (Genmab) (B) IEF & cIEF Laeda E et al, J Chrom A 2010 (Takeda) + PNGase F + PNGase F 50% of naked IgG Mylotarg®
  12. 12. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 12 (2)  2d generation ADCs reaching the market (A) Kadcyla® (ado trastruzumab emtansine): 2013 => Lys, maytansinoids (SMCC/SPP‐DM1, SPDB/sulfo‐DM4), ImmunoGen => 12 in clinical trials (B) Adcetris® (brentuximab vedotin): 2011 => Cys, auristatins (mcMMAE, vcMMAF), Seattle Genetics => 24 in clinical trials
  13. 13. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 13 Cl H3CO H3CO N H O N H3C OH O O O N O S O N O O N HO O 3.5 Ado trastuzumab emtansine (Roche/Genentech, ImmunoGen) Wakankar A et al, Bioconj Chem 2010 Beck A et al, Discovery Medecine 2010 FDA/EMA approval: 2013 Kadcyla®
  14. 14. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 14 T‐DM1 manufacturing: 2 step process Wakankar A, AAPS 2010 (Genentech) (A) (B) Junutula JR et al, Clin Cancer Res 2010 (Genentech) SMCC = N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Linker Kadcyla®
  15. 15. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 15T‐DM1 drug distribution (PK in Cyno) T‐DM1 in cynomolgus monkey PK study by  HER2 ECD affinity capture LC–MS Shows the DAR distribution shifts to lower  values over time (2 min to 28 days) • Kaur S (Genentech), Bioanalysis 2013 (A) 2 min (B) 3 days (C) 28 days
  16. 16. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 16Adcetris® N N H H N N H O O O O NH NH2O O O N H N N N O O O O O NH OCH3 O HO Brentuximab (chIgG1) -Cys-SH (Hinge) Peptide linker -Cit-Val- Auristatin E = (4/ IgG) Beck A et al, Discovery Medicine, 2010 FDA approval: 2011 EMA approval: 2012 Brentuximab vedotin (Seagen/Takeda)
  17. 17. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 17Brentuximab vedotin manufacturing Sun M, Senter P et al Bioconj Chem 2005 (Seagen) Wakankar A, AAPS 2010 (Genentech) Le LN, Anal Chem 2012 (Genentech) Valliere‐Douglas JR et al, Anal Chem 2014 (Seagen) Mixture of covalent/ non‐covalent IgGs Need of specific analytical methods (1) “Denaturing” = non‐covalent interchain bonds (L‐ H, H‐H) are disrupted (2) “Native” = non covalent interchain bonds (L‐H, H‐ H) are maintained
  18. 18. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 18Profiling ADC positional isomers (UV) (UV) Reverse Phase‐HPLC (UV, MS) Hydrophobic Interaction Chrom (HIC) nrCapillary Electrophoresis‐SDS • Le LN, Anal Chem 2012 (Genentech) Key QC method (Ab‐vcPAB‐MMAE) Key QC method (Ab‐mcMMAF) Native Hinge Cys (8, c/hIgG1) Native DenaturingDenaturing
  19. 19. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 19STEAP1 drug distribution (PK in Cyno) Affinity capture HIC chromatogram of 100  μg/ml anti‐STEAP1 ADC in cynomolgous monkey in vitro plasma stability samples. Formation of new odd numbered DARs (e.g., DAR1, DAR3 and DAR5)  • Kaur S (Genentech), Bioanalysis 2013 (A) T0 (B) 96 H
  20. 20. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 20 Effect of drug loading on ADC clearance (A) MMAE‐Cys‐IgG (Seattle Genetics) (B) DM1‐Lys‐IgG (ImmunoGen)  Hamblett KJ et Al, Clin Cancer Res 2004 & 2006  McDonagh CF et Al, (Seattle Genetics) Prot Eng Design & Selection 2006
  21. 21. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 21 (3)  3d generation ADCs:  clinical and pre‐clinical stage Abzena (Polytherics), Ambrx, Catalent (Redwood), Innate, Genentech,  MedImmune, Novartis, Pfizer, Novartis, Seattle Genetics, Sutro Biopharma and  many more
  22. 22. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 22 ThiomAbs (TDC) • Damle NK, Nature Biotech 2008 • Junutula JR, Nature Biotech 2008 Genentech
  23. 23. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 23 ThiomAbs (TDC) • Junutula JR, Nature Biotech 2008 • Junutula JR, Clin Cancer Res 2010 Site specific conjugation on HC (Cys 114): improved  homogeneity and therapeutic index • LC/MS profile for (A) TMAb‐mcc‐DM1 and (B)  thioTMAb‐mpeo‐DM1 • ‘L’ is a linker without drug conjugated to antibody (A) (B) Genentech
  24. 24. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 24 TDC Evaluation of ADCs and antibody fluorophore conjugates (AFCs) as model Identification of additional conjugation sites in the LC, HC (Fd) and Fc of trastuzumab  • engineered site‐specific thio‐trastuzumab variants for coupling to thiol‐reactive linkers • without perturbing antibody structure and function Based on structural modeling, selection of 3 variants (LC‐V205C, HCA114C, Fc‐S396C) The stability and superior in vivo efficacy of the LC‐V205C conjugate may be higher due to faster maleimide ring hydrolysis, which prevented drug loss through the maleimide exchange from antibody to thiol‐reactive constituents in the plasma Shen BK, Jutunula J et al, Nature Biotech 2012 20082012
  25. 25. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 25 TDC • Shen BQ, Junutula JR et al, Nature Biotech 2012 (Genentech) • Jeffrey S, Senter P et al, Bioconjugate Chem 2013 (Seattle Genetics): basic amino‐acids • Lyon R, Senter P et al, Nature Biotech 2014 (Seattle Genetics): self‐hydrolyzing maleimides • Tumey N et al, Bioconj Chem 2014 (Pfizer): mild Method for succinimide Hydrolysis (A) Maleimide exchange  from the antibody conjugate (B) Hydrolysis of succinimide ring in the linker => key steps that influence  conjugate stability and  therapeutic activity (A) (B) AlexaFluor-488-Maleimide Retro-Michael reaction Succimide ring hydrolysis +18 Da
  26. 26. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 26 h1F6-PBD(4) h1F6-PBD(2) Seattle Genetics / PBD‐based ADC
  27. 27. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 27 Highly‐Potent warheads • Chari R, Angew Chem 2014 (1) PBDs: Phase I (Seagen/Spirogen), Astra‐Zeneca (ADC‐T, Spirogen) (2) Indolino‐BDs (IGNs, ImmunoGen): Ph I in 2015
  28. 28. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 28 Optimized linkers • Polar linker active against MultiDrug‐Resistant protein 1 (MDRP1) (1) Polar sulfo‐SPDB and mal‐PEG4‐OSu linkers (ImmunoGen) (2) Self‐hydolyzing maleimide (Seagen) • Diaminopropionic acid • Basic amino‐group  • Adjacent to the linker • Lyon R, Senter P, Nat Biotech 2014 • Chari R, Angew Chem 2014
  29. 29. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 29Site specific conj: Panowski S et al, mAbs 2014
  30. 30. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 30 (2) CIPF/PFM R&D, CD‐CMO
  31. 31. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 31  R&D of mAbs and ADCs for cancer treatments Production Facility (cGMP) CIPF St‐Julien en Genevois (France) Integrated R&D Center IGF-1R/ dalotuzumab CXCR4/ hz515H7 c-Met 3 Clinical stage naked mAbs + confidential  targets,  mAbs &  ADCs programs www.cipf.com Cochet O et al, BioProcess Int 2013 (Abbvie)
  32. 32. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 32Pierre Fabre: R & D & Production mAbs/ADCs R&D (CIPF), SMDs/Pharma Dev (CRDPF),  SMDs Dev. (P&I), SMDs/mAbs/ADCs Fill & Finish (API) CIPF St Julien CRDPF Toulouse P&I Gaillac API Pau
  33. 33. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 33 Identity • Intact IgG/ADC : UHPLC‐ESI‐ TOF, CE‐SDS, SDS‐PAGE • Peptide mapping: UPLC‐ESI‐ TOF (UV), Ion Trap, MALDI‐ TOF • Immuno‐identification:  ELISA, immunoblots • Identification of cytotoxic payload: UPLC‐ESI‐TOF • N and Ct seq.: Ion Trap  (ETD), MALDI‐TOF (ISD) Quantity • Amino Acid Analysis • Protein content: UHPLC‐UV • Extinction coefficient:  calculation, UPLC‐UV • Protein quantif. : UV, BCA • Drug to mAb ratio &  distribution: HIC, CE‐SDS,  UHPLC‐MS/UV, native MS • Free cytotoxic drug: UHPLC‐ MS/UV Purity, integrity, stability • Mass distribution: UPLC‐ESI‐ TOF, CE‐SDS, SDS‐PAGE • Charge variants/ Isoforms: IEF,  cIEF, CEX, HIC • Aggregation/ Fragmentation:  SEC‐UV, Native MS, DSC • SEC‐MALS, A4F‐UV/MALS, DLS • Glycosylation: NP‐HPLC, UHPLC‐ UV, CE‐LIF, UPLC‐ESI‐TOF,  MALDI‐TOF • Disulfide bridges: CE‐SDS, SDS‐ PAGE, UPLC‐MS • Free thiol groups: Ellman • De‐amidation: CEX, UHPLC‐MS Functional assays/ Potency • ELISAs • BIAcore (Ag, FcRs, FcRn, C1q,  Prot. A binding) • FACS • Cytotoxicity IgG (150 KDa) Drug (1.5 KDa) ADC (avDAR3) (154.5 KDa) ADCs: analytical & structural platform
  34. 34. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 34Antibody Fluorophore Conjugates (AFCs) N N H H N O O O O NH NH2O N H O O N H N O O N N O OCH3O OCH3O N H HO S Maleimide Caproic acid Maleimidocaproyl Valine Citruline PABC Methyl Valine Valine Dolaisoleucine Dolaproline Norephedrine MMAE Attachment group Protease cleavable linker MMAE Cytotoxic drug N N H H N O O O O NH NH2O N H O O N H N O O N N O OCH3O OCH3O N H HO S Maleimide Caproic acid Maleimidocaproyl Valine Citruline PABC Methyl Valine Valine Dolaisoleucine Dolaproline Norephedrine MMAE Attachment group Protease cleavable linker MMAE Cytotoxic drug N N H H N O O O O NH NH2O N H O O N H N O O N H S O O NS Maleimide Caproic acid Maleimidocaproyl Valine Citruline PABC Methyl Valine Fluorochrome N N H H N O O O O NH NH2O N H O O N H N O O N H S O O NS Maleimide Caproic acid Maleimidocaproyl Valine Citruline PABC Methyl Valine Maleimide Caproic acid Maleimidocaproyl Valine Citruline PABC Methyl Valine Fluorochrome A B • Dansyl Sulfonamide Ethyl Amine (DSEA)‐linker maleimide • Model of brentuximab vedotin + most of ADCs in clinical trials  Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014
  35. 35. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 35 Cys‐linked ADCs DAR, load & distribution : work‐flow ADC profiling: panel of orthogonal methods (covalent/ non‐covalent species) Denaturing conditions (covalent) Native conditions (covalent and non covalent) (1) SDS-PAGE/CE-SDS non reducing (a) reducing (b) (2) RP-HPLC-MS reducing (a) non reducing (b) IdeS digestion/ red (c) IgGZERO/ red (d) (3) HIC (4) Native MS (+/- IgGZERO)  Le LN et al, Anal Chem 2013 (Genentech)  Valliere-Douglas JR et al, Anal Chem 2012/ Anal Chem 2013 (Seagen)  Rosati S, Parren PW, Heck AJ et al, mAbs 2013 (Genmab)  Stojko J, Debaene F, Xuan Y, Bromirski M, Van Dorsselaer A, Beck A, Cianférani S, 2014 ADC
  36. 36. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 36 (A) SEC (before purification) • Multimeric and monomeric species • Characterized by  SDS‐PAGE, CE‐SDS, HIC,  Native MS, LC‐MS (IdeS digestion + red.) • Relationship  between  aggregation  and  average Dye to Antibody Ratio (DAR)? Monomers Multimers 20.0 10.0 0.0 30.0 40.0 50.0 60.0 mAU 0.0 50.0 100 150 200 250 300 mL 69.5% 30.5% Monomers Multimers 20.0 10.0 0.0 30.0 40.0 50.0 60.0 mAU 0.0 50.0 100 150 200 250 300 mL 69.5% 30.5% 250 150 100 75 50 37 25 20 trastuzum ab A FC m onom ers A FC m ultim ers trastuzum ab A FC m onom ers A FC m ultim ers NR R • Non Reducing • H2L2, H2L, H2, HL, H, L + payloads • Mono vs multi: different distribution • Reducing • Increased MW (multimers vs mono.) • higher conjugation level (multimers)  Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014 (B) SDS‐PAGE AFCs/ADCs
  37. 37. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 37Brentuximab vedotin 3.288 3.826 4.746 5.629 6.564 8.159 9.311 AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 Minutes 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 HIC peak identification: denaturing vs native Mass Spec Hamblett KJ et al, Cancer Res 2004 (Seagen) Average DAR = 4.0
  38. 38. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 38 2,953 4,477 5,784 6,090 6,565 8,730 10,257 AU -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 Minutes 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 • HIC • Monomers: average DAR: 4.3  • Mutimers: high loaded forms B AU -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 Minutes 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Monomeric 0PL 2PL 4PL 6PL 8PL Av. DAR: 4.3 Multimeric 149197 1953 147185 1052 145173 114 151208 1252 153219 488 2 % 26 % 2 Payloads 22 % 40 % 10 % 0 Payload 4 Payloads 6 Payloads 8 Payloads Av. DAR: 4.4 • Native MS (200mM NH4Ac, pH7) • Intact bivalent H2L2 structure of AFCs • De‐glycosylated (IgGZero) • Relative distribution (drug loaded species) • Direct av. DAR determination (A) HIC (B)  Native MS  Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014 AFCs/ADCs
  39. 39. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 39 IdeS for ADC/AFC characterization AFC mixture (150 kDa) LC (25 kDa) Fc/2 (25 kDa) 1) IdeS 2) DTT Fd (25 kDa) Fd0 Fd1 Fd2 Fd3 L0 L1 • IdeS • Immunoglobulin‐degrading enzyme of Streptococcus pyogenes • FabRICATORTM (www.genovis.com) • 3 fragments of ~ 25kDa providing LC and MS resolution   Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014 AFCs/ADCs
  40. 40. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 40    1 0 1 0 1 )( nLC LC A An LCDAR    3 0 3 0 )( n n Fd Fd A nA FdDAR ))()((2 FdDARLCDARDAR  UV chromatogram at 210nm: Fd1 Fd2 Fd3 Time (min) 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 % 20 100 Ionchromatogram LC0 Fd0 Fc/2 LC1 avDAR = 3.8   Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014 AFCs/ADCs IdeS for ADC/AFC: LC‐ESI‐TOF Fd3 : 28 391.57 Fd2 : 27 386.57 Fd2 : 27 386.57 Fd1 : 26 381.57 Fd1 : 26 381.57 Theoritical MWav 1.8828 393.45 +/‐ 0.15 1.7727 388.34 +/‐ 0.20 1.5926 383.16 +/‐ 0.39 1.6927 388.26 +/‐ 0.17 E D C B 1.6326 383.20 +/‐ 0.31A Δth/expExperimental MW Peak
  41. 41. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 41 • DAR (LC) = Σ[nALCn / ΣALC]  • DAR (Fd) = Σ[nAFdn / ΣAFd]  • Av.DAR= 2 x [DAR (LC) + DAR (Fd)] Average DAR: momomer vs multimers • The average DAR is twice in the multimeric fraction • No Fc conjugation • Payload distribution and  average DAR • Correlation: number of  conjugated payloads and  trends to aggregation AU 0.0 1.0e-2 2.0e-2 L0 Fc/2 Fd0 AU 0.0 1.0e-2 2.0e-2 L0 Fc/2 Fd0 Time 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 AU 0.0 1.0e-2 2.0e-2 LCT-13-0911-OC 2: Diode Array Range: 2.105e-2 L0 12% Fd1 3% Fd2 16% Fd3 72% Fd4 9% L1 75% Fc/2 L2 13% Time 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 AU 0.0 1.0e-2 2.0e-2 LCT-13-0911-OC 2: Diode Array Range: 2.105e-2 L0 12% Fd1 3% Fd2 16% Fd3 72% Fd4 9% L1 75% Fc/2 L2 13% Av. DAR = 3.8 Av. DAR = 7.8 A B C 0.0 1.0e-2 2.0e-2 a ge 6 5e L0 32% L1 68% Fd1 53% Fd0 16% Fd2 26% Fd3 5% Fc/2 0.0 1.0e-2 2.0e-2 a ge 6 5e L0 32% L1 68% Fd1 53% Fd0 16% Fd2 26% Fd3 5% Fc/2 Monomeric AFC Multimeric AFC Trastuzumab  Wagner E, Janin MC, Beck A et al, mAbs 2014 AFCs/ADCs
  42. 42. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 42 (A) Trastuzumab (B) Trastuzumab-DSEA IdeS cleavage suitable for 1) mAbs (hIgG1 to 4) 2) Fc‐fusion proteins 3) AFCs, ADCs IdeS: IgGs and AFCs  Janin MC et al, Meth Mol Biol 2013  Wagner E, Beck A et al, mAbs 2014  Fornelli L et al, Anal Chem 2014  Boeuf A, Structural Biol., in press  Beck A et al, Anal Chem 2012 & 2013  Beck A et al, Trends Anal Chem 2013  Ayoub D et al, mAbs 2013
  43. 43. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 43 Developability (1) Sequence liabilities • Hot spots (in silico) • Chromatographic and electrophoretic profilling (size, charge, hydrophob.) • Mass spectrometry (main isoform, micro‐variants structures) • Short stress studies (pH, heat, oxidation, glycation, light, freezing/thawing) • Functional assays (Critical Quality Attributes ranking) • Lead structure optimization (OptimAbs/OptimADCs): Hinge, pI, Glc… (2) Safety/PK/PD • Serum stability • Half‐life • Administration schedule • Immunogenicity • Off‐target activity (3) Manufacturability • Expression yields • Purification yields • Stability (process) • Stability (long term) • Cost of goods CIPF’s: OptimAbs/ADCs developability platforms
  44. 44. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 44 (3) Summary
  45. 45. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 45 OptimAbs/ADCs • Past decade: several hundreds of papers on mAbs analytical and structural characterization • Trend was amplified the last years • Beck A, Cianferani S et al, Anal Chem 2012/2013; Beck A, Cianferani S et al, TRAC 2013 • Beck A MiMB 2013; Beck A, Cianferani S et al, J Mass Spec 2015 • Multiple liquid chromatography, electrophoresis and MS methods  • Used at all stages of mAbs discovery, preclinical and clinical development • Selection of the best antibody‐producing clone (with the right glyco‐profile) • Full structural characterization (research leads + clinical candidates) • Combination of liquid chromatography, electrophoresis and MS • Used for identification of “hot spots” • Deleterious for stability, PK and for pharmacology properties • Early use in the R&D process of MS methods (“Developability”) • Helps to optimize the structure of next generation mAbs (OptimAbs) • Reduced chemistry CMC liabilities and better drug‐like properties • All these methods are mandatory for • Comparability assays, formulation, process scale‐up and transfer • To define critical quality attributes (CQA) in a quality by design approach (QbD) • All these routine and emerging methods also help evaluate  • More sophisticated and potent antibody derivatives:  • ADCs (OptimADCs), bi‐ and multispecific antibodies • Controlled mixture of recombinant oligoclonal antibodies, • High affinity protein scaffolds
  46. 46. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 46 Acknowledgements CIPF, St‐Julien‐en‐Genevois, FR • E. Wagner, O. Colas, L. Morel‐Chevillet • MC. Janin, M. Excoffier, C. Klinguer • T. Champion, D. Ayoub, A. Boeuf • M. Dillenbourg M. Duhamel, G. Terrral • L. Tonini, S. Genton, A. Bourmeaud • M. Rompais, M. Trauchessec, C. Huillet • L. Goetsch, JF. Haeuw, M. Tesar and coll. • O. Cochet, S. Lauthier and coll. • N. Corvaïa CRDPF, Toulouse, FR • M. Perez, C. Bailly, JF. Boe and coll. CRPF, Castres, FR • I. Rilatt and coll. API, Pau, FR • franck.pavan@pierre‐fabre.com Plantes et Medecines, Gaillac, FR • herve.limouzin@pierre‐fabre.com LSMBO, University of Strasbourg, FR • S. Cianferani, F. Debaene • H. Diemer, JM. Strub, G. Terral • C. Carapito, C. Atmanene • J. Stojko, C. Schaeffer, J. Marcoux • A. Van Dorsselaer (> 20 years collaboration, 25 papers) Waters, FR, UK, US (LC‐MS prototypes) • D. Petit, A. Fabre, F. Delsene • W. Chen, A. Millar, P. Boyce • L. Denbigh, H. Haesebaert • D. Lascoux, JM. Casanova, C. Siroit (> 15 years collaboration)
  47. 47. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 47SYNAPT G2‐Si HDMS (Waters) 2014 ADC • SynaptTM G2‐Si HDMS : Q‐TOF with resolution up to 50 000 • Denat/ Native MS of mAbs/ADCs (D loading/distr., D0, avDAR), peptide mapping, proteomics • Ion Mobility (shape & size), ETD (Asp/IsoAsp, labile PTMs, disulfide cross‐linking) • AcquityTM UPLC H‐class Bio, 2D with PDA detector: orthogonal separations (CEX+RP, HIC+RP, RP+RP…)  • TriVersa NanoMateTM Advion : In chip‐based electrospray ionization techics  • Nano‐infusion of low sample amounts with robustness and sensitivity, fraction collection TriVersa  NanoMateTM Advion AcquityTM UPLC H‐class Bio,  2D, PDA SynaptTM G2‐Si  HDMS, ETD
  48. 48. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 48 Xevo TQ‐S (Waters) 2014 ADC •XevoTM TQ‐S : Triple quadrupole MS for quantification (1) High sensitive quantification of residual payloads (ADC batches) (2) Controls and cleaning validation (ADCs labs) (3) In vitro/vivo stability sudies of payloads in plasma (ADCs, mAbs) • AcquityTMUPLC I‐class, 2D • Well suited for complex samples, orthogonal dimensions of separations • eg. Residual drug in ADCs batches AcquityTM UPLC I‐class, 2D, TUV detector XevoTM TQ‐S
  49. 49. Manchester, Nov 20, 2014 (Waters ADC WS)       Thank you for your attention! alain.beck@pierre‐fabre.com
  50. 50. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 50 Cover stories 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2013 2015
  51. 51. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 51 alain.beck@pierre-fabre.com 2009 www.landesbioscience.com IF: 5.275 (2012), 3.174 (2011) Anal Chem (5.695), Anal Biochem (3.247)
  52. 52. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 52 Glycovariants  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013
  53. 53. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 53 N‐Glycoforms  Beck A et al, Curr Pharm Biotech 2008  Beck A & Reichert JM, mAbs 2012  Beck A et al, Anal Chem 2013  Beck A, Meth Mol Biol 988, 2013
  54. 54. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 54 Charge variants  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013
  55. 55. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 55 Cys‐linked variants  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013
  56. 56. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 56 Oxidized variants  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013
  57. 57. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 57 Size variants  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013
  58. 58. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 58 mAbs LC/ HC (classical) Fab/ Fc (functional assays) Fd/ LC/ Fc/2 (screening) Mass Spec Characterization flowchart  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013 *IgG‐degrading enz. of Streptococcus pyogenes (www.genovis.com) *
  59. 59. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 59 IgGs  Beck A, Wagner E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Cianferani S, Anal Chem 2013 Analytical and structural methods • Trastuzumab • Rituximab • Cetuximab • Adalimumab • Bevacizumab • Native MS • Ion Mobility‐MS • CESI‐MS/MS • Middle down/up • ETD
  60. 60. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 60 Trastuzumab  Beck A et al, Anal Chem 2012 Trastuzumab = gold standard   • Originator (1998) • Sub‐cutaneous, high concentration (2013) • Synergic combination (+ pertuzumab, 2012) • Antibody‐Drug Conjugate (T‐DM1) (2013) • Biosimilars (many clinical trials in progress) • Biobetters (e.g. low fucose) • Bispecifics (e.g. HER2 x VEGFA) • Biobetters of T‐DM1 (Ambrx, Synthon, Redwood…)
  61. 61. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 61 (A) Top: ESI‐Q‐TOF and (B) Native IM‐MS (1) Trastuzumab  Beck A, Cianferani S, Van Dorsselaer A, Anal Chem 2012
  62. 62. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 62 ADC catabolism • John Lambert, WADC Frankfurt 2014 (ImmunoGen)
  63. 63. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 63 HPLC / UHPLC / MALLS / DLS / A4F / Ultracentrifugation analytique Aggregation  Boé JF, Beck A, Carrie A, Duhau L et al. STP Pharma Pratiques 2014
  64. 64. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 64 ADCs ADMET • Gorovits B et al, Bioanalysis 2013  (American Assosiation of Pharmaceutical  Scientists ADC Working Group) => Roadmap lab # 5: « Bioanalyse » => CIPF: Experim. Cancerology/ Physico‐Chimystry Dpts ADCs bioanalysis: 6 keys parameters
  65. 65. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 65 ADC PK • mAb (mouse/cyno serum): ELISA • Capture protein: 5T4  • Detection antibody:  • biotinylated goat anti‐human  kappa chain (mAb assay) • biotinylated anti‐MMAF  antibody (ADC assay) • Optical density:  spectrophotom.  • Released payload cys‐mcMMAF,  • UPLC‐MS/MS system (5500  Qtrap, C18 column • cys‐mcMMAD as the Internal  standard)  • LOD 0.002 ng/ml  (plasma) • LOD 0.1 ng/ml (tumor) Sapra P et al, Mol Cancer Ther 2013 (Pfizer)
  66. 66. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 66 ADCs: analytics and bioanalytics
  67. 67. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 67 Pierre Fabre Oncology portfolio • 1989: Navelbine, the 1st chemotherapy to provide significant improvement in Non small cell lung cancer (NSCLC) treatment that led to its registration in US and Europe • 1991: Navelbine registered in Metastatic Breast cancer (mBR) • 2001: Oral Navelbine, the 1st oral chemotherapy approved in Europe in NSCLC,  thereafter approved in mBC, subsequently allowing patients to be treated at home • 2003: Busilvex a bone marrow transplantation conditioning treatment, co-developed  and commercialized in Europe, Turkey, Middle-East and Latin America (Otsuka License) • 2004: a partnership agreement was signed with Merck (US). It covered a 1st mAb for  the treatment of cancers, including Colon, Pancreatic, and Non-small cell lung cancers • 2009: Javlor, the 1st chemotherapy approved in Europe in advanced or metastatic  transitional cell carcinoma of the urothelial tract after failure of prior platinum- containing regimens • 2010: a licensing agreement was signed with Abbott (US) to develop a 2nd mAb discovered by the Pierre Fabre researchers • 2013: a 3rd mAb CXCR4 has entered into phase 1 using pilot batches produced at the  Pierre Fabre Immunology Centre • 2014: Aurigene (India) and Pierre Fabre licensing agreement for a new cancer  therapeutic in immuno-oncology an immune checkpoint modulator targeting the PD-1  pathway (AUNP12 peptide)
  68. 68. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 68  Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic mAbs Nat  Rev Immunol. 2010  Beck A, Reichert JM. Editorial: ADCs: Present and future. MAbs. 2014  Beck A, Haeuw JF, Wurch T, Goetsch L, Bailly C, Corvaïa N. The next generation of ADCs comes of age. Discov Med. 2010  Cochet O, Corbière JC, Sinclair A, Monge M, Brown A, Eschbach G. A Sustainable, Single‐Use Facility for mAbs Production. BioProcess International, 2013  Beck A, Wagner‐Rousset E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Sanglier‐Cianférani S. Characterization of therapeutic  mAbs and related products. Anal Chem. 2013  Wagner‐Rousset E, Janin‐Bussat MC, Colas O, Excoffier M, Haeuw JF, Rilatt I, Perez M, Corvaïa N, Beck A. ADCs  fast characterization by LC‐MS. MAbs. 2013  Broyer L, Goetsch L, Broussas M. Evaluation of complement‐dependent cytotoxicity using ATP measurement  and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 2013 (A. Beck, Editor)  Broussas M, Broyer L, Goetsch L. Methods Mol Biol. 2013 (A. Beck, Editor)  Beck A. Review of ADCs, Methods in Molecular Biology series: A book edited by Laurent Ducry. MAbs. 2013  Beck A, Carter PJ, Gerber HP, Lugovskoy AA, Wurch T, Junutula JR, Kontermann R, Mabry R, Ghayur T. 8th  European Antibody Congress 2012: November 27‐28, 2012, Geneva. MAbs. 2013  Beck A, Senter P, Chari R. World ADC Summit Europe: Feb 21‐23, 2011; Frankfurt, Germany. MAbs. 2011  Beck A, Lambert J, Sun M, Lin K. 4th WADC: Feb 29‐Mar 1, 2012, Frankfurt, Germany. MAbs. 2012  Klinguer‐Hamour C, Strop P, Shah DK, Ducry L, Xu A, Beck A. WADC, Oct 15‐16, 2013, San Francisco. MAbs. 2014 Publications: ADCs
  69. 69. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 69 Site specific conjugation (HC‐Cys 114): improved homogeneity & therap. index • Junutula JR, Nature Biotech 2008 – Nature Biotech 2012 ThiomAbs (TDC) Genentech
  70. 70. Waters ADC WS, Nov 20‐21, 2014, Manchester                          Alain BECK, PhD 70Site specific conjugation • Perez HL et al, DDT 2014

×