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Doutoranda: Viviane Acunha Barbosa
Orientador: Prof.Dr.Cláudio T de Souza
Criciúma-SCCriciúma-SC
20092009
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METODOLOGIAMETODOLOGIA
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EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.
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EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.

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Viviane Acunha - AMPK, AKT, ENOS, EXERCÍCIO , INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
objetivos


Avaliar se em quadro de IC ocorre redução da atividade da Akt e AMPK;
Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e AMPK e se essas levam o aumento da atividade da eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;
Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com ARA – adenina arabinofuranosida;
Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com LY294002.

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EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.

  1. 1. Doutoranda: Viviane Acunha Barbosa Orientador: Prof.Dr.Cláudio T de Souza Criciúma-SCCriciúma-SC 20092009 EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICOEFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOSSOBRE A VIA AKT/eNOS E AMPK/eNOS EM AORTA DE RATOS WISTAR COMEM AORTA DE RATOS WISTAR COM INSUFICIÊNCIA CARDÍACA.INSUFICIÊNCIA CARDÍACA. Projeto de doutorado apresentado ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde – PPGCS – UNESC para o exame de qualificação. AKT AMPKeNOS
  2. 2. DEFINIÇÃODEFINIÇÃO ““ INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC):INSUFICIÊNCIA CARDÍACA (IC): Síndrome clínicaSíndrome clínica complexa ecomplexa e progressivaprogressiva,, que pode resultar deque pode resultar de qualquerqualquer distúrbiodistúrbio funcional ou estrutural do coração quefuncional ou estrutural do coração que altere sua capacidade dealtere sua capacidade de enchimentoenchimento e/oue/ou ejeçãoejeção. Caracterizada clinicamente por. Caracterizada clinicamente por dispnéia, fadiga, edema e redução dadispnéia, fadiga, edema e redução da sobrevidasobrevida.”.” (Jessup & Brozena, 2003; Neto Rossi, 2004).
  3. 3. Doença CardiovascularDoença Cardiovascular PRINCIPAL CAUSA DE MORTE NOPRINCIPAL CAUSA DE MORTE NO MUNDOMUNDO The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.The World Health Report 2001. Geneva: WHO; 2001.
  4. 4. Insuficiência Cardíaca Congênitas (CIV, Fallot, etc) Valvares (IMi, EAo, etc) Miocárdicas (IAM, entre outras) Hipertensão Arterial Tóxicas (álcool, anti-blásticos )Pericárdio (pericardite constritiva) ETIOPATOGENIAETIOPATOGENIA (Albanesi Filho, 2005; Hagen, 2006).
  5. 5. Insuficiência CardíacaInsuficiência Cardíaca EtiopatogeniaEtiopatogenia Principais causas de insuficiência cardíaca dos pacientes internados no INCOR - 1995 1,66 22,1 32,6 25,8 6,97 7,41 3,4 Mioc. Restritiva Valvopatia Mioc. Isquêmica Mioc. Dilatada Hipertensção Card. Congênita Outros Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998Arq Bras Cardiol vol 71, (nº 1), 1998
  6. 6. EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA Nettto Rossi, 2004. Rev Soc Cardiol Estado de São Paulo.
  7. 7. EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA
  8. 8. Relação entre hospitalizações eRelação entre hospitalizações e sobrevida anualsobrevida anual World Health Statistics, World Health Organization, 1999.World Health Statistics, World Health Organization, 1999. American Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical UpdateAmerican Heart Association, 2002 Heart and Stroke Statistical Update.. SOBREVIDA HOSPITALIZAÇÕES
  9. 9. IMPORTÂNCIA DO EXERCICIOIMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC
  10. 10. IMPORTÂNCIA DO EXERCICIOIMPORTÂNCIA DO EXERCICIO FISICO NA ICFISICO NA IC
  11. 11. LIMITAÇÕES DA CAPACIDADE FISICA Dispneia, fadiga e descondicionamento Fraqueza muscular Alterações endoteliais entre outras AKT AMPK ? Disfunção muscularPORQUE?
  12. 12. AKT AMPK Capacidade Oxidativa Sintetisa eNOS L-Citrulina CL- Miosina Célula de Músculo Liso Vascular Membrana Basal Endotelio Matriz Extracelular Função endotelial Condutância vascular L-Arginina BENEFICIOS DO EXERCÍCIO FÍSICO
  13. 13. Oxido nítrico (NO .):Oxido nítrico (NO .): Anti-inflamatoria Anti-apoptosis Pro-fibrinolítica Anti-plaquetaria Proliferação e migração CML NO. • pesquisas? quais são os fatores ? Disfunções do IAM-IC Dentre essas investigações Um mediador na funcionabilidade vascularUm mediador na funcionabilidade vascular + potente vasodilatador endogeno+ potente vasodilatador endogeno Atualmente ON: prevenção e na redução dos Sintomas clinicos e hemodinamicos IC Porem a relevância do ON no endotelio e na vasculatura do Musculo liso Depende de uma enzima importante eNOS
  14. 14. Ativação da eNOS por diversosAtivação da eNOS por diversos fatores…fatores… ? PI3K PLC-γ AC PKC CaM Akt CaMK PKA oxigenasa CaM reductasa β γ αi β γ αs InsP3 DAG Ca 2+ ATP AMPc S1177S635 S617 T497 S116 VEGF-R Estrógeno-R Esfingosina-1-P Bradicinina shear stress IGF-1 e insulina eNOS IL-8 integrinas P Comini et al., 1996, Viaro& Evora, 2000
  15. 15. NO NO CÉLULA MUSCULAR VASCULAR LISA CÉLULA ENDOTELIAL αs S-S RPK ββ TYR S-S αα p85 p110P P P P IRS- 1IRS- 2IRS- 3IRS- 4 PI(4,5)-P2 PI(3,4,5)-P3 PI(4)-P PI(3,4)-P2 P P P AKT3 AKT2 AKT1 P PDK NO eNOS P Fosfoinositídeos PI3K VEGF, IGF-1 , insulina shear stress, (Bertrand et al., 2008;Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Zecchin, 2007). A AKT será o mecanismo principal de ativação de eNOS? P AKT Captação de glicose Anti-lipólise Síntese de glicogênio Síntese de PTN Antiapoptose
  16. 16. Dano oxidativo Choque osmótico Hipoxia Privação de glicose Estímulos patológicos Estímulos fisiológicos Exercício Contração do músculo hormônios leptina (Hardie et al. 2003). AMPK é um kinase e ativada por... adiponectina Proteina Kinase ativada por AMP
  17. 17. ATP ADP AMP ExercícioAMPKsensor energético P172 AMPK β γ CBS CBS CBS CBS AMPK αGLUT4 (Glucose transporter 4) PFK (Phosphofructokinase} IRS1 (Insulin Receptor substrate 1) eNOS mTOR ACC2 (Acetyl-CoA carboxylase) GPAT (Glicero-3-phosphate acyltransferase) PPARγ Leptin Adipo- nectin MCD (Malonyl-CoA carboxylase) Triglicerideos e Malonil CoA Captação de glicose e metabolica GS (Glycogen synthase) PKC CaMKKβ TSC1/2 PGC-1α (PPARγ coactivator) Gene expressão Rheb AMPKK (LKB1) Ativada pela redução do conteúdo energético celular (aumento da relação AMP/ATP) Inibe as vias metabólicas que consuma ATP estimula as vias metabólicas que produzam ATP exercício
  18. 18. PI3K PI3K eNOS Akt AMPK P VEGF, IGF-1 , insulina EXERCICIO MODERADO SHEAR ESTRESS NOS III NO NO CÉLULA VASCULAR LISA CÉLULA ENDOTELIAL NO IC ? Dimmeler et al., 1999; Fulton et al., 1999; Magata et al. 2003; Zechin et al, 2007; Zhang et al, 2009
  19. 19. Exercício físico regular ↑ fluxo sanguíneo ↑Akt ↑ eNOS (Ser 1177) NO. NO. ↑Força de frição tangencial célula endotelial NO CML AMPK NO. Exercício Fisico Tambem ativa eNOS via ? NO IC Problemática do estudoProblemática do estudo P
  20. 20. OBJETIVO Geral:OBJETIVO Geral: • Avaliar os efeitos do exercícioAvaliar os efeitos do exercício sobre a via AKT/eNOS esobre a via AKT/eNOS e AMPK/eNOS na aorta deAMPK/eNOS na aorta de ratos wistar com IC.ratos wistar com IC.
  21. 21. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos :: • Avaliar se em quadro de IC ocorre redução daAvaliar se em quadro de IC ocorre redução da atividade da Akt e AMPK;atividade da Akt e AMPK; • Avaliar se o exercício físico induz ativação da AKT eAvaliar se o exercício físico induz ativação da AKT e AMPK e se essas levam o aumento da atividade daAMPK e se essas levam o aumento da atividade da eNOS em ratos com insuficiência cardíaca;eNOS em ratos com insuficiência cardíaca; • Avaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e daAvaliar os efeitos sobre a fosforização da AMPK e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíacaeNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados comtratados com ARA – adenina arabinofuranosida; • Avaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e daAvaliar os efeitos sobre a fosforização da Akt e da eNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíacaeNOS em aorta de ratos com insuficiência cardíaca tratados com LY294002.tratados com LY294002.
  22. 22. METODOLOGIAMETODOLOGIA (Tipo de estudo e ética)(Tipo de estudo e ética) • Estudo experimental.Estudo experimental. • Abordagem quantitativa,Abordagem quantitativa, • Comitê de Ética; UNESC e HCPAComitê de Ética; UNESC e HCPA • Princípios éticos na experimentaçãoPrincípios éticos na experimentação animal e pratica didático-científica; lei nºanimal e pratica didático-científica; lei nº 6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA6.638/ 08/05/ 1979 -COBEA • Após os experimentos procedimentos:Após os experimentos procedimentos: conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA .conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA . (Schnaider & Souza, 2003).(Schnaider & Souza, 2003).
  23. 23. METODOLOGIAMETODOLOGIA • 51 ratos machos da linhagem wistar51 ratos machos da linhagem wistar (HCPA) cIAM-30 dias(HCPA) cIAM-30 dias Barbetta (2007).Barbetta (2007). Avaliação / Ecocardiograma •diâmetros do VE ao final da diástole (DDVE) / sístole (DSVE). A extensão do infarto (%IM), porcentagem do perímetro total do contorno endocárdico (PE)
  24. 24. Modelos deModelos de indução de infartoindução de infarto agudo do Miocárdioagudo do Miocárdio AC descente anterior esquerda cateter periférico intravenoso (Gelko-16G) reg torácica (4º espaço intercostal esquerdo)O pericárdio será rompido e o AE afastado Johns & Olson, 1954; Pfeffer et
  25. 25. METODOLOGIAMETODOLOGIA • Critérios de inclusão:Critérios de inclusão: - homogeneidade na proporção do peso (em media de 200g ahomogeneidade na proporção do peso (em media de 200g a 350 g),350 g), - idade (60 dias- adultos jovens),idade (60 dias- adultos jovens), - gênero (machos), raça (wistar),gênero (machos), raça (wistar), - Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana,Todos/ protocolo de adaptação ao exercício de uma semana, sendo randomizados os com maior aptidão física,sendo randomizados os com maior aptidão física, - chegar ao final do experimento com bom estado de saúde.- chegar ao final do experimento com bom estado de saúde. Barbetta (2007).Barbetta (2007).
  26. 26. METODOLOGIAMETODOLOGIA Critérios de exclusão:Critérios de exclusão: - complicações como infecções,complicações como infecções, - necroses,necroses, - debilitação do estado geral;debilitação do estado geral; - problemas ou desconforto ao animal durante o- problemas ou desconforto ao animal durante o período do experimentoperíodo do experimento - morte dos mesmos,morte dos mesmos, - não conseguirem realizar a semana denão conseguirem realizar a semana de adaptação na esteira.adaptação na esteira.
  27. 27. 7 dias ciclo 12 h claro/ciclo 12 h claro/ escuro, 22,5ºCescuro, 22,5ºC Adaptação biotério 30 dias PO-IAM HCPA de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Protocolo exercício físico em esteira
  28. 28. 4m/min -10min > gradativamente por dia 5dias Adaptação Protocolo (4º/5º+aptos) 1º semana de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Brum et al., 2007;
  29. 29. 5m/min - 10min > A cada 3’ até exaustão Pré-treinamento 5 semanas (Ajuste) 11 semanas (Aferição final) Teste Esforço Máximo 2º semana de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006;Ferreira et al., 2007;
  30. 30. Grupos experimentais Sedentário Exercício Grupo Controle N-6 Sham Treinado (ST) N-6 IC Treinado (ICT) N-9 IC Treinado LY200940 (ICT-LY) N-9 IC Treinado adenina arabinofuranosida (ICT-ARA) N-9 Grupo Sham N-6 Grupo IC N-6
  31. 31. semanseman aa tempotempo 0202 1010 0303 1515 0404 2020 0505 2525 0606 3030 0707 3535 0808 4040 0909 4545 1010 5050 1111 5050 1212 5050 Protocolo Treinamento Físico 5m/min 5m/min 60%-TEM 5 min 5 min-10 min a 50 min- 2ª a 10ª 2º 12º semana de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007;
  32. 32. 7 dias 4m/min -10min > gradativamente por dia 5dias Adaptação Protocolo Adaptação biotério 30 dias PO-IAM HCPA (4º/5º+aptos) 1º semana 5m/min - 10min > A cada 3’ até exaustão Pré-treinamento 5 semanas (Ajuste) 11 semanas (Aferição final) Teste Esforço Máximo 2º semana Protocolo Treinamento Físico 5m/min 5m/min 60%-TEM 5 min 5 min-10 min a 50 min- 2ª a 10ª semanseman aa tempotempo 0202 1010 0303 1515 0404 2020 0505 2525 0606 3030 0707 3535 0808 4040 0909 4545 1010 5050 1111 5050 1212 5050 de Gava et al., 1995.Bertagnoli, 2004; Zanchi et al., 2006; Ferreira et al., 2007; 2º 12º semana Vel. treino (m.min) = Vel. max (m.min-1) . 60% 100%
  33. 33. HistologiaHistologia Tamanho do IAMTamanho do IAM Hangen, 2006 (Hangen, 2006 (Mill el at., 1990) Area de infarto= massa da região infartada x 100% (massa do VE + massa do VD Verificar a deposição ou não de colageno e análise da musculatura lisa Area infartada e não infartada: •PESADAS •DESENHADAS (PAPEL MILIMETRADO) •Recortado e pesado •(VE/VD)
  34. 34. Y I Eppendorf YYYI Western BlotWestern Blot Macerada em nitrogenio liquido Homogeneizada em tampão especifico Adicionado triton Centrifugado 40 min sobrenadante Será processado e aplicado em gel SDS (apósCorrida) Transferidas Memb de nitrocelulose Incubadas com antocorpo primario secundario Tranf. Filme de raiox
  35. 35. Analises Moleculares via de sinalização da insulina Imunoblot: PI 3-KPI 3-K AKTAKT P172 AMPK β γ CBS CBS CBS CBS AMPK α L-ARGL-ARG eNOSeNOS ON Nagata et al., 2003; Reihill et al. 2007; Reihill, 2009 AVALIAR A EXPRESSÃO E A FOSFORILAÇÃO DA
  36. 36. Analises Moleculares via de sinalização da insulina Imunoblot: PI 3-KPI 3-K AKTAKT LY200940 ARA – adenina arabinofuranosida P172 AMPK β γ CBSCBS CBS CBS AMPK α L-ARGL-ARG eNOSeNOS ON AVALIAR A FOSFORILAÇÃO DA eNOS mediante o inibidor A utilização dos inibidores e para mostrar a importância da AKT e AMPK neste processo
  37. 37. Analise estatisticaAnalise estatistica • A analise estatística será pelo teste deA analise estatística será pelo teste de Student (não pareados) e ANOVA paraStudent (não pareados) e ANOVA para comparar as múltiplas médias. Serácomparar as múltiplas médias. Será adotado o nível de significância p<0,05.adotado o nível de significância p<0,05.
  38. 38. no: 2009 J F M A M J J A S O N D Elaboração do projeto x x x x x x x x x x x Avaliação pelo Comitê de ética x x elaboração e apresentação Qualificação x x Qualificação x no: 2010 J F M A M J J A S O N D Infarto dos animais-HCPA/ Deslocamento UNESC x x x Protocolo de Exercício C/I aerobio X X X Eutanásia UNESC/coleta de tecidos x Analises molecularese histológicas x x x x x x Analise dos dados e elaboração de artigo x x x CRONOGRAMA
  39. 39. Ano: 2011 J F M A M J J A S O N D Analises moleculares/bioquímicas e histológicas x x x x x Analise dos dados e elaboração de artigo x x x x x x x x x x x x Ano: 2012 J F M A M J J A S O N D Defesa da tese x x CRONOGRAMA
  40. 40. Quantidade Material Valor (R$) Fonte 51 Ratos Wistar 1020,00 HCPA-UNESC Diversos Reagentes para Western blot 4.000,00 CNPq Diversos Anticorpos 15.000,00 UNICAMP e HCPA Histologia 1.000,00 UNICAMP Diversos Material de Consumo/condução para animais/eventos 4.000,00 UNESC TOTAL 25.020,00 ORÇAMENTO
  41. 41. O que busca-se :O que busca-se : • ........que esses resultados demonstrem um novo........que esses resultados demonstrem um novo mecanismo biológico pelo qual o exercício físicomecanismo biológico pelo qual o exercício físico possa induz relaxamento vascular e proporcionepossa induz relaxamento vascular e proporcione importantes informações acerca da modulaçãoimportantes informações acerca da modulação vascular na insuficiência cardíaca.vascular na insuficiência cardíaca. • OBs.: é importante ressaltar que existemOBs.: é importante ressaltar que existem fármacos já comercializados que aumentam afármacos já comercializados que aumentam a atividade da AKT e da AMPK porem.....atividade da AKT e da AMPK porem.....
  42. 42. O não farmacologico?O não farmacologico?
  43. 43. Evitar.......Evitar.......
  44. 44. “Ter problemas na vida é inevitável, ser derrotado por eles e opcional”. (Anonimo)
  45. 45. Valeu Gabi te adoro!!!
  46. 46. ? PI3K PI3K AC eNOS CA Akt AMPK PKA P ATP AMPc CaM insulina EXERCICIO MODERADO SHEAR ESTRESS NOS III BH4 NO PGIS NO CÉLULA VASCULAR LISA CÉLULA ENDOTELIAL αs αS β γ PROSTAGLANDINAS NO
  47. 47. 1 3 4 2 1. Canal de sodio. 2. Canal L de calcio. 3. Inter Na+/Ca2+ 5. SERCA-PLN. 6. RYR2 RS 5 6 Sodio Calcio Sitio de união dos gicosideos Cardiacos 4 7. Ca 2+ ATPasa 7 3 Na+ 2 K+ Recaptura de Ca 2+ 1 Ca2+ 3 Na+ Ca2+

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