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Variabilidade Genética na Medicina Forense

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Apresentação sobre a Variabilidade Genética na Medicina Forense para a disciplina de BMC. Caso de estudo: investigação de uma violação.

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Variabilidade Genética na Medicina Forense

  1. 1. A VARIABILIDADE GENÉTICA Biologia Molecular da Célula Trabalho elaborado por: Carolina Correia Cátia Barão Francisco Santos Vânia Caldeira NA MEDICINA FORENSE
  2. 2. Variabilidade Genética <ul><li>Meiose </li></ul><ul><ul><li>> Crossing-over (profase I) </li></ul></ul><ul><ul><li>> Colocação de cada cromossomas de cada par de homólogos, de um lado ou outro do plano equatorial do fuso acromático é feita ao acaso (metafase I) </li></ul></ul><ul><li>Resulta de: mutações e recombinação génica durante a meiose e a fecundação: </li></ul><ul><li>Fecundação </li></ul>
  3. 3. Medicina Legal e Forense <ul><li>Especialidade médica e jurídica </li></ul><ul><li>Usa conhecimentos técnico-científicos de Medicina para o esclarecimento de factos de interesse da Justiça </li></ul><ul><li>Reúne o estudo da Medicina, do Direito, da Biologia, da Química, da Balística, da Física, da Sociologia... </li></ul><ul><li>Divide-se em várias áreas: </li></ul><ul><li>> Antropologia forense </li></ul><ul><li>> Traumatologia forense </li></ul><ul><li>> Sexologia forense </li></ul><ul><li>> Tanatologia… </li></ul>
  4. 4. Variabilidade e Polimorfismos na Medicina Legal e Forense <ul><li>O objectivo da análise de DNA é diferenciar um </li></ul><ul><li>indivíduo de outro pelo maior nº de características possível. </li></ul><ul><li>Na espécie humana 10% do genoma codifica proteínas através do RNA, o restante são sequências repetitivas. </li></ul><ul><li>É a variabilidade deste restante, ou seja, das regiões polimórficas, de função estrutural que se utiliza nos exames forenses de DNA. </li></ul>
  5. 5. Variabilidade e Polimorfismos na Medicina Legal e Forense <ul><li>Alelo - cada uma das variantes possíveis de um locus polimórfico. </li></ul><ul><li>Locus – posição de um gene ou de um marcador genético num cromossoma. </li></ul><ul><li>Tipos de polimorfismos: </li></ul><ul><ul><li>> SNPs </li></ul></ul><ul><ul><li>> VNTRs </li></ul></ul><ul><ul><li>> Polimorfismos de repetição de transposões </li></ul></ul><ul><li>Polimorfismos: verificados em mais de 1% da polulação, sendo transmissíveis à descendência. Geralmente sem ou com consequências fenótipicas não negativas. </li></ul><ul><li>Mutações: geralmente associadas a patologias, daí não se “alastrararem” muito (menos de 1% da população). </li></ul><ul><li>Variações genéticas </li></ul>
  6. 6. Caso de Estudo – a Medicina Forense e a Violação Sexual <ul><li>Nos casos de violação e noutros cenários criminais, as recolhas de amostras biológicas (sangue, cabelo, sémen, etc…) permitem o isolamento do DNA de um eventual suspeito. </li></ul><ul><li>Após a recolha e amplificação da amostra de DNA pela técnica de PCR bem como a sequenciação destes é possível ainda a descoberta de polimorfismos particulares e consequente identificação do criminoso. </li></ul>
  7. 7. A Investigação de uma Violação <ul><li>A vítima de violação foi uma rapariga de 14 anos, portadora de Síndroma de Down, no Rio de Janeiro em 1998. </li></ul><ul><li>O crime foi notificado apenas alguns meses mais tarde, quando a gravidez resultante da violação se tornou evidente. </li></ul><ul><li>Assim, a análise forense do sémen do violador estava fora de questão. </li></ul><ul><li>A vítima obteve autorização judicial para uma interrupção da gravidez. </li></ul><ul><li>O feto abortado foi então analisado para identificar o pai biológico, tal como a mãe e 4 suspeitos deste caso de violação. </li></ul>
  8. 8. Técnicas Utilizadas: Extracção do DNA <ul><li>Material biológico: </li></ul><ul><ul><li>Recolha de sangue da vítima e suspeitos </li></ul></ul><ul><ul><li>Tecido da pele do feto </li></ul></ul><ul><li>Incubação (15-18 horas, 56ºC) </li></ul><ul><li>Uso de fenol e clorofórmio para extracção de DNA </li></ul><ul><li>Suspensão das preparações de DNA em solução ( 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) </li></ul><ul><li>Verificação da integridade do DNA: amostras colocadas num gel de agarose 0,8% com brometo de etídio  electroforese, 100V, 15 minutos  medição da densidade do DNA </li></ul>
  9. 9. Técnicas Utilizadas: PCR <ul><li>Análise de 6 loci STRs </li></ul><ul><li>DNA template + dNTP’s de STR + primers sintéticos (CTT ou FFv) + U Taq polimerase </li></ul><ul><li>PCR: </li></ul><ul><ul><li>Desnaturação inicial, 2 min, 96ºC </li></ul></ul><ul><ul><li>10 ciclos de: 1 min a 94ºC, 1 min a 60ºC, 1,5 min a 70ºC </li></ul></ul><ul><ul><li>20 ciclos de 1 min a 90ºC, 1 min a 60ºC e 1,5 min a 70ºC </li></ul></ul><ul><li>Os produtos da amplificação por PCR foram analisados num gel de agarose, 2%. </li></ul>
  10. 10. Técnicas Utilizadas <ul><li>Análise dos Alelos STRs: </li></ul><ul><ul><li>Desnaturação a 95ºC, 2 min </li></ul></ul><ul><ul><li>O material amplificado foi introduzido num gel de poliacrilamida (4%) com “corante de prata” e submetido a electroforese </li></ul></ul><ul><li>Análise de 3 loci VNTRs </li></ul><ul><li>Digestão do DNA com enzimas de restrição: </li></ul><ul><ul><li>Amostras de DNA genómico foram digeridas com Hae III, a 37ºC </li></ul></ul><ul><ul><li>Os fragmentos resultantes foram precipitados pela </li></ul></ul><ul><ul><li>adição de acetato de amónio e etanol </li></ul></ul><ul><ul><li>Incubação a -20ºC, 2 horas </li></ul></ul><ul><ul><li>Centrifugação, velocidade máxima, 10 min </li></ul></ul><ul><ul><li>Suspensão em solução tampão </li></ul></ul>
  11. 11. Técnicas Utilizadas <ul><li>Electroforese: </li></ul><ul><ul><li>Os fragmentos foram separados num gel de agarose, 0.8%, 24 horas, 20V </li></ul></ul><ul><li>Transferência e sequenciação por hibridação: </li></ul><ul><ul><li>Tratamento e transferência de gel para membrana de nylon </li></ul></ul><ul><ul><li>Hibridação desta com sequências de DNA quimioluminescentes (sondas) </li></ul></ul><ul><li>Análise Estatística </li></ul><ul><ul><li>Recorrência a uma base de dados da população do Rio de Janeiro </li></ul></ul>Southern blot
  12. 12. Resultados <ul><li>Os resultados da electroforese mostram que três dos suspeitos podem ser excluídos e apenas o suspeito nº3 é um potencial pai biológico do feto, depois da sequenciação dos vários loci (VNTR e STR). </li></ul><ul><li>Os alelos sequenciados nos 6 loci STR em cada suspeito encontram-se esquematizados na tabela seguinte. </li></ul>
  13. 14. Resultados <ul><li>Loci de STRs que se revelaram motivo de exclusão dos suspeitos: </li></ul><ul><ul><li>Suspeito nº1 – TPOX, F13A01 e vWA </li></ul></ul><ul><ul><li>Suspeito nº2 – CSF1PO, TPOX, THO1, FESFPS, vWA </li></ul></ul><ul><ul><li>Suspeito nº4 – TPOX, F13A01, FESFPS, vWA </li></ul></ul><ul><li>Loci de VNTRs que se revelarem mais um motivo de inclusão do suspeito nº3, em comparação com a vítima e o feto: </li></ul><ul><ul><li>D7S467, D8S358 e D10S28 </li></ul></ul>Conclusão <ul><li>O Índice de Paternidade Combinado é de 412.860, pelo que a probabilidade de ser o pai biológico do feto abortado é de 99,9997%. </li></ul><ul><li>Assim, conclui-se que o violador é o Suspeito nº3. </li></ul>
  14. 15. Referências Bibliográficas <ul><li>http://www2.ufp.pt/~jcabeda/pdf/sebenta-sequenciacao.pdf </li></ul><ul><li>GOES, Andréa Carla de Souza, SILVA, Dayse Aparecida da, DOMINGUES, Cristiane Santana et al . Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil . Sao Paulo Med. J., May 2002, vol.120, no.3, p.77-79. ISSN 1516-3180 </li></ul><ul><li>COOPER, Geoffrey M.; HAUSMAN, Robert E., “The Cell – A Molecular Approach”, ASM Press e Sinauer Associates, 4ª edição, 2007 </li></ul>

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