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新型コロナウイルスの検出

新型コロナウイルスを高感度で検出する方法を作りました。検体の中に、ウイルスが2個以上あれば検出出来ます。早期確定診断は、重症化の抑制、他人への感染の阻止に役立つと思われます。

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新型コロナウイルスの検出

  1. 1. 新型コロナウイルス(COVID-19 )の高感度 検出システムの開発 [SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) Sequences] つくば遺伝子研究所 http://www.tsukuba-genetech.com/
  2. 2. Data to support research and public health activities directed at the ongoing SARS-CoV-2 (Wuhan coronavirus) outbreak. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/) 上記サイトに48種類のCovid19 ウイルスの全配列が Genbank (遺伝子銀行)に登録されています(2020年2月26日現在)。すべてをダウ ンロードし、どのタイプのウイルスであっても検出できるように、PCRプライマーを設定しました。 Genebank RefSeq Gene region collection date Locality MN908947 NC_045512 complete 1-Dec-19 China MT019529 complete 23-Dec-19 China: Wuhan LR757998 complete 26-Dec-19 China: Wuhan MN996527 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MN996528 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MN996529 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MN996530 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MN996531 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MT019530 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MT019531 complete 30-Dec-19 China: Wuhan MT019532 complete 30-Dec-19 China: Wuhan LC522972 complete Jan-20 Japan LC522973 complete Jan-20 Japan LC522974 complete Jan-20 Japan LC522975 complete Jan-20 Japan LR757996 complete 1-Jan-20 China: Wuhan MT019533 complete 1-Jan-20 China: Wuhan MT039890 complete Jan-20 South Korea MN988668 complete 2-Jan-20 China MN988669 complete 2-Jan-20 China LR757995 complete 5-Jan-20 China: Wuhan MT093631 complete 8-Jan-20 China MN938384 complete 10-Jan-20 China: Shenzhen MN975262 complete 11-Jan-20 China MT072688 complete 13-Jan-20 Nepal MT049951 complete 17-Jan-20 China: Yunnan MN985325 complete 19-Jan-20 USA: WA MT039873 complete 20-Jan-20 China: Hangzhou MN988713 complete 21-Jan-20 USA: IL MN994468 complete 22-Jan-20 USA: CA MN997409 complete 22-Jan-20 USA: AZ MN994467 complete 23-Jan-20 USA: CA MT007544 complete 25-Jan-20 Australia: Victoria MT020880 complete 25-Jan-20 USA: WA MT020881 complete 25-Jan-20 USA: WA MT044258 complete 27-Jan-20 USA: CA MT044257 complete 28-Jan-20 USA: IL MT027062 complete 29-Jan-20 USA: CA MT027063 complete 29-Jan-20 USA: CA MT027064 complete 29-Jan-20 USA: CA MT039888 complete 29-Jan-20 USA: MA MT039887 complete 31-Jan-20 USA: WI MT066175 complete 31-Jan-20 Taiwan MT066176 complete 5-Feb-20 Taiwan MT106052 complete 6-Feb-20 USA: CA MT093571 complete 7-Feb-20 Sweden MT106053 complete 10-Feb-20 USA: CA MT106054 complete 11-Feb-20 USA: TX 48種類のCovid19
  3. 3. Covid-19 検出システム開発の戦略 • Genbankに登録されているCovid19の配列で、すべてのウイルスの種類に保存されている(共通の) 配列を検索する。 • 定量PCRを考慮に入れて、PCR産物(PCR反応で得られるDNA断片)が150塩基以下になるようにプ ライマーをデザインする。 • ウイルスRNAから、先ず、cDNAを作る必要があるが、そのためのプライマー(ここでは、リバース プライマーと呼ぶ)に、一本鎖として安定であることに配慮した、タグ配列を付加する。 • Covid19 を検出するための最初のプロセスは、検体からRNAを抽出し、逆転写酵素とリバースプラ イマーを用いて、ウイルスRNAからcDNAを作る。 • こうして得られたウイルス由来の cDNA をタグともう一つのプイラマー(フォワードプライマー)を 用いて、通常のPCR 或いは、定量PCR法で、ウイルスRNAの存在を検出する。 • 次のスライドに、検出方法を模式的に示す。
  4. 4. Covid19 検出の流れ RNA 抽出 リバースプライマー 5’ 3’ タグ配列(タグプライマー) cDNA RNA タグ配列 5’3’ 逆転写 フォワードプライマー 通常PCR 定量PCR タグ配列(タグプライマー)は、鋳型と会合しやすいように、二次構造を取らないように設計し、且つ、 ほ乳類の配列とは相同性がないように設定 検体 RNA
  5. 5. Genbankに登録されているCovid19の全ての種類の配列に、共通している配列 GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGA NC_045512 (MN908947: reference genome) 4124 4208 mer Tm GC PCR product 1-3L forward primer GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGT 26 71.6 50.0 85 1-3R reverse primer TCGCTAGCATTTCAGTAGTGCCACCAG 27 73.0 51.9 フォワードプライマー リバースプライマー タグ 2720..8554 /gene="orf1ab" /locus_tag="GU280_gp01" /product="nsp3" /note="former nsp1; conserved domains are: N-terminal acidic (Ac), predicted phosphoesterase, papain-like proteinase, Y-domain, transmembrane domain 1 (TM1), adenosine diphosphate-ribose 1''-phosphatase (ADRP); produced by both pp1a and pp1ab"/protein_id="YP_009725299.1" 国立感染研究所が示したPCR領域と同じ領域
  6. 6. GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGA https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
  7. 7. Forward Primer: GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGT
  8. 8. フォワードプイラマー/リバースプイラマーについて、Genbankに登録されている配列との相 同性を検索。 Covid19の配列を除けば、一つの登録配列でフォワードプイラマー/リバースプ イラマーの双方が相同性を示すことはなかった。このことから、Covid19配列以外の配列を鋳 型とした、PCR産物が出来ないと判断される。
  9. 9. 前出のスライドで記載したように、in silicoで開発したシステムは、実際のCovid19RNAの検出が可能である と思われる。 そこで、それを検証するために、Covid19のRNAゲノムの一部を化学合成し、それを鋳型として検出できる かを調べた。 M DW 2000 200 20 500bp 100bp 110bp [結果] : 本システムは20分子以上の Covid19 RNAが検出可能であることが判った。 M: 分子量マーカー DW: 陰性コントロール(水) 2000: 2,000 分子のCovid19 RNA 200: 200 分子のCovid19 RNA 20: 200 分子のCovid19 RNA 110bp: Covid19由来PCR産物 Currently, the detection conditions are being under optimization
  10. 10. https://news.yahoo.co.jp/byline/yanagitaemmy/20200414-00172885/ 上記のような報告がありました。コロナウイルス感染の確定診断はPCRで行われていますので、感染し ていても、陰性の場合は、コロナ感染者とみなされません。陽性になるまでに、病状が進行したり、他 人にウイルスをうつすことも想定されます。極端な話ですが、ウイルス1個で感染がおこることもありま す。 そこで、より高感度で、信頼性の高い検出システムを作るため、本システムの最適化を行いました。 その結果、次のスライドに示しましたように、感度を10倍に上げることが出来ました。具体的には、ウ イルスRNAが2個(分子)あっても検出できるようになりました。
  11. 11. PCR 条件の最適化により、Covid19の検出感度の向上 M:分子量マーカー C1: PCRでの陰性コントロール(水) C2: RT-PCRでの陰性コントロール(水) 0: 0分子のCovid19 部分RNA 2: 2分子のCovid19 部分RNA 20: 20分子のCovid19 部分RNA 200: 200分子のCovid19 部分RNA 2000: 2,000 分子のCovid19 部分RNA 110bp: Covid19由来PCR産物 PCR cycles:40 RT反応は、ヒトRNAの存在下で行っている。 M C1 C2 0 2 20 200 2000 M 110bp 結論: 改良した本システムはサンプル当たり2個(分子)のウイルスRNAを検 出することができる。感染早期に確定診断が可能で、早い段階での治療、隔 離が可能となる可能性がある。

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