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Samonella infection

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ブタのサルモネラ菌感染による血液細胞での遺伝子発現の変化

サルモネラ菌がブタに感染すると、血液細胞での多くの発現遺伝子の発現パターンが変化することが判った。従って、血液細胞での遺伝子発現をマーカして調べれば、サルモネラ菌を含めも他の感染も認知することが可能ではないかと考えられる。

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Samonella infection

  1. 1. データベースにあるRNA sequence情報を用いた発現遺伝子の網羅的解析 ブタのサルモネラ菌感染による血液細胞での遺伝子発現の変化 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=ERR413337) 背景 形質の変化は、遺伝子発現の変化が伴うことが知られています。しかし、具体的にどの遺伝子が変化をもたらすのか? その答えを求めて、かつての研究者は、「研究者の勘」で、候補遺伝子を選択し、検証してきました。 近年、「勘」に頼らず、より網羅的に解析する手法として、マイクロアレイが登場しました。しかし、遺伝子内でも、 スプライスが変化し、多様なトランスクリプトが生成することが判ってきました。こうした変化を解析するには、エキソ ン単位で、プローブを作る必要が出てきます。仮に出来たとしても、マイクロアレイだけでは実際のトランスクリプトを 捉えることが出来ません。 mRNAの配列を直接解析することで、この問題を解決できます。現在は、形質の変化に関与する遺伝子を明らかにする ための、究極の手法として、RNAシークエンスとその解析が行われて来ています。 RNAシークエンス価格が下がり、解 析手法が色々考案され、その有用性が検証されつつあります。 動機 こうした解析手法から得られるデータは多様で、その処理と評価は極めて煩雑です。そこで、これら のデータを分かりやすく出力することを、既存のデータを用いて試みました。 西堀正英(広島大学)、渡部 聡(畜草研) 、平岩秀樹、土井考爾、安江 博(つくば遺伝子研)
  2. 2. 材料 Samples used in this study were selected from Salmonella negative piglets (crossbred or Yorkshire sows bred to boars from different breeds) belonging to two populations of 40 and 77 individuals each and raised in climate-controlled, fully enclosed isolation facilities at the USDA-ARS-National Animal Disease Center (NADC) in Ames, IA under identical management conditions. サルモネラ菌感染 At 7 weeks of age, these Salmonella negative pigs received intranasal inoculation of 109 colony-forming units (cfu) of nalidixic acid resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST _4232. 血液からのRNA調製 Approximately 2.3 ml of whole blood was collected from the jugular vein into PAXgene Blood RNA tubes (processed according to manufacturer‘s instructions) from each individual just prior to infection (day 0) and at days 2, 7, 14, and 20 post-inoculation. Blood samples collected at day 0 and day 2 from 16 selected pigs identified as low shedding (n=8) and persistent shedding (n=8) based on extremes of Salmonella shedding levels post innoculation were used for total RNA extraction Total RNA was prepared from 4.5-9.0 ml of solution from the PAXgene Blood RNA tubes. The DNA was removed by in-solution DNase I digestion and RNeasy mini elute kit cleanup as recommended by QIAGEN. PCR assay without reverse transcription was used to confirm that the RNA samples were DNA-free. The quantity and quality of the RNA were determined using Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) and Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). A globin reduction protocol developed in-house (Choi et al.; manuscript under preperation) using porcine specific oligonucleotides was performed. Briefly, 3 ug of denatured total RNA was hybridized in a thermal cycler at 70 degrees C for 2 min with the 10X GR oligonucleotides mix in hybridization buffer (100 mM Tris-HCL, pH 7.6; 200 mM KCl) at 70 degrees C for 5 min, then cooled to 4 degrees C. RNA-DNA hybrids were digested with 2 U RNase H (Ambion) in the reaction buffer (100 mM Tris_HCl, pH 7.6, 20 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, Superase-in) at 37 degrees C for 10 min and cooled to 4 degrees C. The reaction was stopped by addition of 0.5 M EDTA. The globin depleted RNA was immediately purified with the RNeasy MinElute cleanup kit (Qiagen, Toronto, Canada, Cat. No.: 74204) according to manufacturer’s instruction. RNA quality of the globin depleted samples was assessed using an Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, USA). The mRNA library was constructed using Illumina System (TruSeq RNA sample Preparation v2 Guide, Illumina, Inc., San Diego, USA). One ug of total RNA was purified using poly-T oligo-attached magnetic beads. The Poly (A) RNA was primed and fragmented. The first and second strand cDNA were synthesized according to Illumina's sample preparation guide. Then individual RNA index was ligated to the end-repaired cDNA and subsequently enriched. The quality of the mRNA libraries were confirmed using Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). The quantification was performed using StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). The individual libraries were adjusted to 2 nM concentrations and pooled before denaturation and dilution according to Illumina's instructions. The diluted libraries (8 - 10 pM) were loaded on a cBot (Illumina) for cluster generation using the TruSeq SR Cluster Kit v3 (50 cycles, Illumina). 材料と方法
  3. 3. 具体的には 1.ブタ16頭についての実験結果である。先ず、サルモネラ菌感染前に採血し、その後、一定量のサルモネラ菌感染 2.サルモネラ菌が増殖し、沢山排泄されたブタ8頭から、感染後2日目で採血 3.サルモネラ菌があまり増殖せず、排泄が少なかった8頭から、同様に、感染後2日目で採血 4.これらの血液サンプルから、RNAを抽出し、次世代シークエンサーでmRNAの解析を行った 。 5.シングルリードで、約4000万リード/サンプル、約20億塩基/サンプル 6.TopHat/Cufflinkで解析 経緯 本年度の動物遺伝育種学会では、各群4頭の解析を行った結果を発表した。また、その時は、P値の設定 を0.01以下としていた。そこで、解析をさらに進め、各群の全ての頭数、8頭を改めて解析した。ま た、P値の設定を0.003以下も設けて、解析を行った。この成果を本学会で発表する。 さらに、感染易性(感染非抵抗性)ブタ群と感染抵抗性ブタ群の間で、感染前に遺伝子発現に差異があるの かについての解析も合わせ行った
  4. 4. 遺伝子単位での解析 エキソン単位での解析 サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液で の遺伝子発現の比較 (p<=0.01 および 0.0003) スキャタープロット 感染後2日 感染後2日 感染前 (19,524遺伝子) (216,769エキソン) p<=0.01 p<=0.003
  5. 5. 遺伝子単位での解析 エキソン単位での解析 サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液で の遺伝子発現の比較 (p<=0.01 および 0.0003) Volcano プロット (19,524遺伝子) (216,769エキソン) p<=0.01 p<=0.003
  6. 6. 遺伝子単位での解析 エキソン単位での解析 サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液で の遺伝子発現の比較 (p<=0.01 および 0.0003) クラスター解析 有根 (19,524遺伝子) (216,769エキソン) p<=0.01 p<=0.003
  7. 7. 遺伝子単位での解析 エキソン単位での解析 サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液で の遺伝子発現の比較 (p<=0.01 および 0.0003) クラスター解析 無根 (19,524遺伝子) (216,769エキソン) p<=0.01 p<=0.003
  8. 8. エキソン単位での解析 (19,524遺伝子) (216,769エキソン) サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液での遺伝子発現の 比較 (p<=0.0003) 遺伝子単位での解析
  9. 9. 遺伝子単位での解析 主成分分析 (19,524遺伝子) (216,769エキソン) エキソン単位での解析 サルモネラ菌感染後、サルモネラ菌がよく増殖するブタ8頭の感染前と感染後2日の血液で の遺伝子発現の比較 (p<=0.01 および 0.0003) p<=0.003
  10. 10. 発現マーカーの検証として、In silicoのデータをウエットの実験で確認するとき 遺伝子の例 この遺伝子の場合、トランスクリプト( )によっては、実験群と対象群では、発現量比が逆転しているので、 エキソンを跨ぐプライマーを設計する場合は、殊に注意を要する。 そこで、発現マーカーとしての機能を考えると、エキソン単位での解析を基に、エキソン内にプイラマー を設計することで、比較的単純に、in silicoのデータとウエットの実験結果を対応づけることが出来る。 エキソン毎の 発現量 (FPKM) 対照群 実験群
  11. 11. In silicoのデータを実験で検証するためのプライマーの設計 (エキソンを跨ぐプライマーを設計する場合は、スプライスバリアントの発現量も考慮する必要があり、難しい) CTGCGATCCTGCCATCAATGGGGGCCTGCCGTGTTGACGTTGTGGGGAAGGAGCCGGCTCCCTC TGCCCTGCAGCCGAGCTCTGCCCAGCGAGAAAAACTGAAGGACTCCTGCTTACTAAGGGGCCAGC TGGCTGGGCCAGGGACATCCAGGTGGCTCCAGGAGCTGGCAAGCCCTGGGTCGGGTGGCTGCTG CAGGAAGCCAGTCCCCT 設計したプライマー( )を用いて、逆転写、そしてRT-PCRを用いて、in silicoのデータを検証
  12. 12. 未感染状態での感染易性(感染非抵抗性)ブタ群と感染抵抗性ブタ群の血液での遺伝子発 現の比較 (p<=0.0003) 感染易性(感染非抵抗性)群と感染抵抗性群の間では、未感染状態では、血液細胞での遺伝子発現の 明確な差異は観察されなかった。
  13. 13. まとめ 1.サルモネラ菌がブタに感染すると、血液細胞での多くの発現遺伝子の発現パターンが変化す ることが判った。従って、血液細胞での遺伝子発現をマーカして調べれば、サルモネラ菌を含め も他の感染も認知することが可能ではないかと考えられる。 2.感染易性(感染非抵抗性)ブタ群と感染抵抗性ブタ群の間では、感染前のブタでは、血液細胞 での遺伝子発現の明確な差異は観察されなかった。感染非抵抗性と感染抵抗性を規定している要 因は、別にあるのではと思われる。 3.色々なP値を設定して解析することにより、遺伝子発現による異なった局面を見ることがで きることが判った。

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