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Fusion gene generated in iPS cells by passage

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Fusion gene generated in iPS cells by passage

  1. 1. iPS細胞の継代培養でおこる 遺伝子の変化 融合遺伝子(fusion gene) http://www.tsukuba-genetech.com
  2. 2. 慶應義塾大学医学部 岡野 栄之氏 https://www.lifescience.mext.go.jp/files/pdf/n1549_06.pdf より抜粋 iPS細胞の継代に よる融合遺伝子 の出現の可能性
  3. 3. iPS細胞の継代培養による 融合遺伝子(fusion gene)出現について検証 融合遺伝子とは、染色体転座で 2 種類の遺伝子が 融合し、正常細胞では見られないタンパ ク質が産生する遺伝子です。 RNAのペアエンドシ-クエンスが行われる様になって、融合遺伝子からの遺伝子発現解 析が可能となりました。2010年以降、この解析を行うプログラムが、数多く発表され、 現在では、少なくとも16種類あります。 2017年に開発され、2019年4月に更新された最新のプログラムSTAR-Fusionを用いて、 融合遺伝子を発現レベルで、継代数の異なるiPS細胞について、データベース上で利用可能 なものを用いて検討して見ました。
  4. 4. 検討対象し たiPS細胞の RNAデータ 継代数5 と 継代数10のブタiPS細胞
  5. 5. 最新のSTAR-Fusionを用いた 融合遺伝子の発現解析 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/120295v1 ブタiPS細胞 継代数5 と 継代数10 継代数5には、既に 存在し、継代数10 になっても維持さ れている融合遺伝 子 融合遺伝 子名 組換 え点 を含 む リー ド数 組換 え点 を挟 む断 片数 スプライ ス型 左側遺伝 子 左側組換 え点 右側遺伝 子 右側組換 え点 LargeAn chorSup port FFPM 左端 2塩 基 LeftBrea kEntrop y 右端 2塩 基 RightBr eakEntr opy 組換え 様式 左側 CDS_ID 左側 CDS_ RANG E 右側 CDS_ID 右側 CDS_ RANG E タンパク 質融合型 融合型 融合CDS 融合たん ぱく質の アミノ酸 配列 左側のペ プチドの 機能ドメ イン 右側のペ プチド機 能ドメイ ン 継代数 ENSSSCG00000031392--ENSSSCG0000001120915 6 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000031392chromosome13:10013639:+ENSSSCG00000011209chromosome13:10289379:+YES_LDAS 1.1326 GT 1.8892 AG 1.9329 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.28Mb]"]ENSSSCG00000031392.ENSSSCT000000488761-227 ENSSSCG00000011209.ENSSSCT000000350753-381 INFRAME INFRAME atgtccactgaggcacaaagagttgatgacagtccaagcactagtggaggaagttcMSTEAQRVDDSPSTSGGSSDGDQRESVQQEPER. UQ_con|3-120|3.5e-47^Pr5 ENSSSCG00000031392--ENSSSCG0000001120921 31 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000031392chromosome13:10013639:+ENSSSCG00000011209chromosome13:10289379:+YES_LDAS 1.8217 GT 1.8892 AG 1.9329 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.28Mb]"]ENSSSCG00000031392.ENSSSCT000000488761-227 ENSSSCG00000011209.ENSSSCT000000350753-381 INFRAME INFRAME atgtccactgaggcacaaagagttgatgacagtccaagcactagtggaggaagttcMSTEAQRVDDSPSTSGGSSDGDQRESVQQEPER. UQ_con|3-120|3.5e-47^Pr10 ENSSSCG00000005934--ENSSSCG000000365317 4 ONLY_REF_SPLICEENSSSCG00000005934chromosome04:3218070:+ENSSSCG00000036531chromosome04:3341379:+YES_LDAS 0.5932 GT 1.7819 AG 1.9086 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome04:0.12Mb]"]ENSSSCG00000005934.ENSSSCT000000065151-2520 ENSSSCG00000036531.ENSSSCT0000003264546-930 INFRAME INFRAME atgagcgtcccggactacatgcagtgcgcggaggaccaccagaccctgctcgtggMSVPDYMQCAEDHQTLLVVVQPVGIVSEENFFRTRAPPC9-Trs120|59-145|4.4e-06^TRTRAPPC9-Trs120|64-260|45 ENSSSCG00000005934--ENSSSCG000000365313 4 ONLY_REF_SPLICEENSSSCG00000005934chromosome04:3218070:+ENSSSCG00000036531chromosome04:3341379:+YES_LDAS 0.2452 GT 1.7819 AG 1.9086 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome04:0.12Mb]"]ENSSSCG00000005934.ENSSSCT000000065151-2520 ENSSSCG00000036531.ENSSSCT0000003264546-930 INFRAME INFRAME atgagcgtcccggactacatgcagtgcgcggaggaccaccagaccctgctcgtggMSVPDYMQCAEDHQTLLVVVQPVGIVSEENFFRTRAPPC9-Trs120|59-145|4.4e-06^TRTRAPPC9-Trs120|64-260|410 ENSSSCG00000039134--ENSSSCG000000115217 5 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000039134chromosome13:54881268:-ENSSSCG00000011521chromosome13:54678797:-YES_LDAS 0.6472 GT 1.9086 AG 1.8892 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.17Mb]"]ENSSSCG00000039134.ENSSSCT000000544801-288 ENSSSCG00000011521.ENSSSCT00000012609265-2547INFRAME INFRAME atgaccgccctgcgctaccagaagaagttcaccgagtacagcgcacgcctcgattcMTALRYQKKFTEYSARLDSLSRCVAAPPGGKGEPDZ|42-98|3.7e-13^PDZ_2|64-97|7.8PDZ-PARTIAL|~265-280|25 ENSSSCG00000039134--ENSSSCG0000001152114 13 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000039134chromosome13:54881268:-ENSSSCG00000011521chromosome13:54678797:-YES_LDAS 0.9459 GT 1.9086 AG 1.8892 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.17Mb]"]ENSSSCG00000039134.ENSSSCT000000544801-288 ENSSSCG00000011521.ENSSSCT00000012609265-2547INFRAME INFRAME atgaccgccctgcgctaccagaagaagttcaccgagtacagcgcacgcctcgattcMTALRYQKKFTEYSARLDSLSRCVAAPPGGKGEPDZ|42-98|3.7e-13^PDZ_2|64-97|7.8PDZ-PARTIAL|~265-280|210 ENSSSCG00000012003--ENSSSCG0000001200225 17 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000012003chromosome13:177901517:-ENSSSCG00000012002chromosome13:177541063:-YES_LDAS 2.2652 GT 1.9656 AG 1.9329 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.18Mb]"]ENSSSCG00000012003.ENSSSCT000000131341-355 ENSSSCG00000012002.ENSSSCT0000002703426-4242INFRAME INFRAME ttcgtcttcattctgtcccatttcgtaggatctcgtcttcgccaggaagacttccccccgFVFILSHFVGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEIg_3|19-103|2e-21^I-set|20-117|3.4eI-set-PARTIAL|~26-100|1.5 ENSSSCG00000012003--ENSSSCG000000120026 4 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000012003chromosome13:177901517:-ENSSSCG00000012002chromosome13:177541063:-YES_LDAS 0.3503 GT 1.9656 AG 1.9329 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome13:0.18Mb]"]ENSSSCG00000012003.ENSSSCT000000131341-355 ENSSSCG00000012002.ENSSSCT0000002703426-4242INFRAME INFRAME ttcgtcttcattctgtcccatttcgtaggatctcgtcttcgccaggaagacttccccccgFVFILSHFVGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEIg_3|19-103|2e-21^I-set|20-117|3.4eI-set-PARTIAL|~26-100|1.10 ENSSSCG00000008310--ENSSSCG000000397833 3 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000008310chromosome03:70397062:+ENSSSCG00000039783chromosome03:70539043:+YES_LDAS 0.3236 GT 1.9219 AG 1.6895 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome03:0.14Mb]"]ENSSSCG00000008310.ENSSSCT000000578481-1557 ENSSSCG00000039783.ENSSSCT0000003719073-312 INFRAME INFRAME aaagctccattgggaaatactttgaaacatgctgggttaaatcatattaaagaagactKAPLGNTLKHAGLNHIKEDFSHFLFCSKRKSKKDSec15|126-168|0.61^Sec15|250-520|. 5 ENSSSCG00000032459--ENSSSCG0000003677211 3 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000032459chromosome06:67640257:+ENSSSCG00000036772chromosome06:67890522:+YES_LDAS 0.4905 GT 1.8892 AG 1.9656 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome06:0.20Mb]"]ENSSSCG00000032459.ENSSSCT000000644051-234 ENSSSCG00000036772.ENSSSCT00000054407274-5289INFRAME INFRAME atgtggcgcgcggaggggaaatggctgccgaaaacaagccggaagagcgtttcccMWRAEGKWLPKTSRKSVSQSVFCGASTYCVLN. TIG|892-971|1.8e-12^TIG_10 ENSSSCG00000037643--ENSSSCG0000000380522 6 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000037643chromosome06:146614850:-ENSSSCG00000003805chromosome06:146300028:-YES_LDAS 0.9809 GT 1.9219 AG 1.8256 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome06:0.24Mb]"]ENSSSCG00000037643.ENSSSCT000000607151-281 ENSSSCG00000003805.ENSSSCT0000000421151-1980INFRAME INFRAME atgaagaaaagcaggagtgtgatgacagtgacagccgatgataatgttaaagacgaMKKSRSVMTVTADDNVKDDFECSLSKSYSSSSN. PDE4_UCR|89-204|1.9e-6010 ENSSSCG00000035984--ENSSSCG000000077273 3 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000035984chromosome03:14461672:+ENSSSCG00000007727chromosome03:14705786:+YES_LDAS 0.2102 GT 1.3996 AG 1.8892 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome03:0.24Mb]"]ENSSSCG00000035984.ENSSSCT000000387411-414 ENSSSCG00000007727.ENSSSCT000000084724-3081 INFRAME INFRAME atgaccagctttgtcacttttgaagcgctggagaaagatgtagcacttaagcctcaggMTSFVTFEALEKDVALKPQERVEKRQTPLTKKKRSynapsin_N|111-130|5.4e-06Auts2|186-229|1^Auts2|2910 ENSSSCG00000008070--ENSSSCG0000003682611 4 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000008070chromosome03:42106025:+ENSSSCG00000036826chromosome03:42306351:+YES_LDAS 0.5255 GT 1.7056 AG 1.7465 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome03:0.20Mb]"]ENSSSCG00000008070.ENSSSCT000000088431-564 ENSSSCG00000036826.ENSSSCT00000046019133-444INFRAME INFRAME atggactcccttcgcgctgaggccgacgccttggaagccgagatcaaggccttgagMDSLRAEADALEAEIKALRRACVELPAPGEDTSPJnk-SapK_ap_N|1-103|5.4e-07^CENPCENP-P-PARTIAL|~133-110 継代数5から10な る過程で出現した 融合遺伝子
  6. 6. In silico解析で示された融合遺伝子の発現の検証 ブタiPS細胞継代数5から10なる過程で出現した融合遺伝子 スプライ ス型 左側遺伝 子 左側組換 え点 右側遺伝 子 右側組換 え点 LargeAn chorSup port FFPM 左端2塩 基 LeftBrea kEntrop y 右端2塩 基 RightBre akEntro py 組換え様 式 左側 CDS_ID 左側 CDS_RA NGE 右側 CDS_ID 右側 CDS_RA NGE タンパク 質融合型 融合型 融合CDS 融合たん ぱく質の アミノ酸 配列 左側のペ プチドの 機能ドメ イン 右側のペ プチド機 能ドメイ ン 継代数 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000032459chromosome06:67640257:+ENSSSCG00000036772chromosome06:67890522:+YES_LDAS 0.4905 GT 1.8892 AG 1.9656 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome06:0.20Mb]"]ENSSSCG00000032459.ENSSSCT000000644051-234 ENSSSCG00000036772.ENSSSCT00000054407274-5289 INFRAMEINFRAMEatgtggcgcgcggaggggaaatggctgccgaaaacaagccggaagaMWRAEGKWLPKTSRKSVSQSVFCGASTYCVL. TIG|892-971|1.8e-12^TIG10 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000037643chromosome06:146614850:-ENSSSCG00000003805chromosome06:146300028:-YES_LDAS 0.9809 GT 1.9219 AG 1.8256 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome06:0.24Mb]"]ENSSSCG00000037643.ENSSSCT000000607151-281 ENSSSCG00000003805.ENSSSCT0000000421151-1980 INFRAMEINFRAMEatgaagaaaagcaggagtgtgatgacagtgacagccgatgataatgttMKKSRSVMTVTADDNVKDDFECSLSKSYSS. PDE4_UCR|89-204|1.9e-10 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000035984chromosome03:14461672:+ENSSSCG00000007727chromosome03:14705786:+YES_LDAS 0.2102 GT 1.3996 AG 1.8892 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome03:0.24Mb]"]ENSSSCG00000035984.ENSSSCT000000387411-414 ENSSSCG00000007727.ENSSSCT000000084724-3081 INFRAMEINFRAMEatgaccagctttgtcacttttgaagcgctggagaaagatgtagcacttaaMTSFVTFEALEKDVALKPQERVEKRQTPLTKKSynapsin_N|111-130|5.4e-06Auts2|186-229|1^Auts2|10 INCL_NON_REF_SPLICEENSSSCG00000008070chromosome03:42106025:+ENSSSCG00000036826chromosome03:42306351:+YES_LDAS 0.5255 GT 1.7056 AG 1.7465 ["INTRACHROMOSOMAL[chromosome03:0.20Mb]"]ENSSSCG00000008070.ENSSSCT000000088431-564 ENSSSCG00000036826.ENSSSCT00000046019133-444 INFRAMEINFRAMEatggactcccttcgcgctgaggccgacgccttggaagccgagatcaagMDSLRAEADALEAEIKALRRACVELPAPGEDTJnk-SapK_ap_N|1-103|5.4e-07^CECENP-P-PARTIAL|~133-10 4種の融合遺伝子が、ブタiPS細胞の継代数5から継代数10になる過程で、出 現したことが示唆されました。 これは次にWetの検証として、プライマーを用いて、RT-PCRで検討する必 要があります。 ここでの解析は、データベース上のデータを解析した結果だけです。 gagcgtttcccaaagtgtattctgcggagctagcacctactgtgttc tcaacaccgtgccgcctctagaagatgatcatgggaacagcaata gtagtcatgtaaaaatctttttaccgaaaaagctgcttgaatgtctg ccgaaatgttcaagtttacccaaagagaggcaccgctggaacact aatgagGAAATCGCAGCTTACTTAATAACATTTGA GAAACACGAAGAATGGCTAACCACCTCCCCTAA GACAAGGCCGCAGAATG プライマー配列 iPS細胞をより一層活用するために、長期培養・継代培養での融合遺伝子発現を確認し、もし、それが問 題になるものとなれば、排除することが重要であると思われます。

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