FUNDAMENTOS
La espectrofotometría método de análisis no estequiométrico
que mide una propiedad física del analito, mide el...
Leyes de fonometría : Cuando un haz de luz (luz incidente),
atraviesa una solución, una parte de las radiaciones quedan
ab...
 IMPORTANTE: La ley de absorción , conocida como la ley de
Lambert y Beer, da información cuantitativa de cómo es que la
...
CURVA DE CALIBRACION
y = 0.2305x + 0.0633
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0.25
0.30
0.17 0.33 0.50 0.67 0.83
CONCENTRACION (mg/ml...
directamente proporcional a las concentraciones, asimismo
estas desviaciones de la curva se deben a errores de manejo
en l...
directamente proporcional a las concentraciones, asimismo
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Lab.2 concentracion proteica

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Lab.2 concentracion proteica

  1. 1. FUNDAMENTOS La espectrofotometría método de análisis no estequiométrico que mide una propiedad física del analito, mide el comportamiento del analito frente a una radiación electromagnética especifica asimismo no se mide el analito como parte de una reacción química y no aplica la estequiometría . Tal respuesta puede ser una absorción, una emisión, una difracción una refracción, una dispersión o una rotación. En esta practica observaremos el comportamiento del analito a la radiación electromagnética, la absorción de radiación que experimenta la muestra en este caso anaranjado de metilo con el agua. La radiación que absorbe se encuentra dentro del rango visible (460nm) y de hay el nombre de espectrofotometría de absorción molecular en el rango visible. La manera de saber la magnitud de tales absorciones a diferentes longitudes de onda es obteniendo experimentalmente su ESPECTRO DE ABSORCIÓN . REVISIÓN BIBLIOGRAFICA Los métodos espectroscópicos de análisis miden la cantidad de radiación producida o absorbida por las especies atómicas o moleculares que se analizan. La espectroscopia ha jugado un papel muy importante en el desarrollo de la teoría atómica moderna. Asimismo los métodos espectro químicos también han aportado herramientas que posiblemente , son las que mas se utilizan para elucidar estructuras moleculares, así como para identificar y obtener la composición cuantitativa y cualitativa de sustancias orgánicas. Colorimetría : Es la medida del color de la solución por comparación con una solución de la misma sustancia en concentración conocida utilizando para ella luz blanca.
  2. 2. Leyes de fonometría : Cuando un haz de luz (luz incidente), atraviesa una solución, una parte de las radiaciones quedan absorbidas por las moléculas del soluto sufriendo una reducción en su intensidad (luz transmitida) proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas . Si consideramos que onda absorbe una determinada cantidad de luz la intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el numero de moléculas que se interponen entre la fuente luminosa y el observador. Esto mismo varia de acuerdo a la concentración del soluto y al espesor del recipiente que contenga la solución , estos factores están comprendidos entre la ley de Lambert y Beer. Ley de Lambert y Beer : De acuerdo con la ley de Beer la absorbancia esta relacionada linealmente con la concentración (c) de las especies absorbentes y con la longitud de la trayectoria de la radiación (b) en el medio absorbente; y se expresa mediante la siguiente ecuación: A = log Po/P = abc Limitaciones de esta ley: La relación lineal entre la absorbancia y la longitud de la trayectoria de la radiación a una concentración fija, es una generalización para la que hay pocas excepciones. Por el contrario, es muy frecuente encontrar desviaciones a la proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración (cuando b es constante). Algunas de estas desviaciones , denominadas desviaciones reales , son significativas y representan limitaciones de esta ley. A veces se observan desviaciones debidas a la forma en que se mide (desviaciones instrumentales ) o como resultado de los cambios químicos asociados a las variaciones de concentración (desviaciones químicas). Curva de calibración: Una curva de calibración o curva standard, se determina, experimentalmente preparando una serie de soluciones de concentración conocida y midiendo la absorbancia de cada una de ellas. Con los datos obtenidos se construyen curvas de absorción. La relación Absorbancia vs. distancia de recorrido de la radiación o concentración es lineal mientras que con la transmitancia no lo es. Coeficiente de extinción : Viene a ser el logaritmo de la relación existente entre la intensidad de la luz incidente y de la luz transmitida después de haber atravesado una capa de solución de concentración igual a la unidad y de espesor también igual a la unidad.
  3. 3.  IMPORTANTE: La ley de absorción , conocida como la ley de Lambert y Beer, da información cuantitativa de cómo es que la atenuación de la radiación depende de la concentración de las moléculas que la absorben y de la distancia que recorre el rayo en el medio absorbente. Cuando la luz atraviesa una solución de analito, la intensidad de la radiación disminuye como consecuencia de la excitación del analito. Cuanto mayor sea la trayectoria del rayo en la solución de analito de una concentración dada, habrá mas especies que absorban la radiación y la atenuación será mayor. Procedimiento: • Vaciar de un frasco de Biuret a un vaso precipitado seguidamente pipetear 5ml. de Biuret y pasar al tubo de ensayo luego enrasamos con agua destilada mezclamos la solución y en los 6 tubos de ensayo proporcionados por el laboratorio preparar soluciones a diferentes concentraciones ; por ejemplo : *0º Muestras en blanco: 1ml de agua destilada con 5ml de Biuret. *1° tubo: 5ml. de Biuret con 0.8 ml. de agua destilada mas 0.2 sol. St. *2° tubo: 5ml. de Biuret con 0.6 ml. de agua destilada mas 0.4 sol. St. *3° tubo: 5ml. de Biuret con 0.4 ml. de agua destilada mas 0.6 sol. St. *4° tubo: 5 ml. de Biuret con 2 ml. de agua destilada mas 0.8 sol. St. *5° tubo: 5ml. de Biuret con 1.0 sol. St. Después de la preparación de estos 6 tubos llevar al vortex y posteriormente al espectrofotómetro el cual nos proporcionara datos de la Absorbancia de la muestra a diferentes concentraciones. Materiales: E = log Io /It
  4. 4. CURVA DE CALIBRACION y = 0.2305x + 0.0633 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.17 0.33 0.50 0.67 0.83 CONCENTRACION (mg/ml) ABSORBANCIA  Tubo de ensayo.  Rejilla.  Vaso precipitado.  Fiola.  Pipetas.  Espectrofotómetro.  Cubeta de 1cm.  Agua destilada  Biuret RESULTADOS DISCUSIÓN  La curva de calibración posee errores ya que normalmente debería salir una recta ya que la absorbancia es muestras B 1 2 3 4 5 M sol.st _ 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.9 H2O dest. 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Muestra Higado _ _ _ _ _ _ 0.1 Biuret 5 5 5 5 5 5 5 10 min en Bano Maria ABSORBANCIA 0.076 0.108 0.133 0.165 0.220 0.256 0.108 0.140 0.173 0.221 0.259 Coef. Variabilidad (%) 0 3.36 3.35 0.32 0.82 Concentraciones (mg/L) 0 0.167 0.333 0.5 0.667 0.833
  5. 5. directamente proporcional a las concentraciones, asimismo estas desviaciones de la curva se deben a errores de manejo en los instrumentos sobretodo a la hora de tomar los volúmenes así como un error en el manejo del espectrofotómetro el cual posee un tubito que de una u otra manera pudo estar influyendo en la determinación de las absorbancia de las muestras a distintas concentraciones.  Así también obtenemos un coeficiente de variabilidad mayor a un 5% lo cual nos indica que hubo errores para la preparación de los tubos descritos anteriormente.  Debemos tener en cuenta que el error en el caso del tubo uno se pudo deber a la mala lectura, así también observar que la persona que prepare (pipetee) los tubos debe ser la misma para, también la agitación del tubo es muy importante para que la solución sea homogénea y así lograr mejores resultados.
  6. 6. directamente proporcional a las concentraciones, asimismo estas desviaciones de la curva se deben a errores de manejo en los instrumentos sobretodo a la hora de tomar los volúmenes así como un error en el manejo del espectrofotómetro el cual posee un tubito que de una u otra manera pudo estar influyendo en la determinación de las absorbancia de las muestras a distintas concentraciones.  Así también obtenemos un coeficiente de variabilidad mayor a un 5% lo cual nos indica que hubo errores para la preparación de los tubos descritos anteriormente.  Debemos tener en cuenta que el error en el caso del tubo uno se pudo deber a la mala lectura, así también observar que la persona que prepare (pipetee) los tubos debe ser la misma para, también la agitación del tubo es muy importante para que la solución sea homogénea y así lograr mejores resultados.

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