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MICROCULTIVOLos mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materiaorgánica...
•     Morfología microscópica     •     Pruebas metabólicas (levaduras)     •     Composición de la pared celular     •   ...
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Fig. 74 Por su localizaciónPor su aspecto        Algodonoso, aterciopelados, terrosos, húmedo, seco.Por su función:-      ...
Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos                               OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS. Determinar:...
Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar3. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente sele...
Fig. 80.- Inactivación del moho3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y coloca...
Fig. 83 Rhizopus spOBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURASPara la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacci...
Fig. 85 Observación microscópica de levaduras                                                76
Métodos de conservación de cepasEn un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar,...
3º.-       Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos                  cerrado...
2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de       108-109 c...
a).-    Desecación en papel de filtro.Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solu...
Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el método empleadoen la conservaci...
PRUEBAS BIOQUÍMICASAislamientoUna vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo, observamos la placa de Petri, esco...
Oxidasa        Reducción de nitratos        Hemólisis        Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %        Crecimiento en bil...
Fundamento:Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendoácido y...
pH alcalino: Color rojoRESULTADOS:Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo c...
4.- PRUEBA DE ROJO DE METILOFundamento:El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 ...
Prueba                    Control negativo     Control positivo    Voges - Proskauer         Escherichia coli     Klebsiel...
Fig. 102 Prueba del citrato de Simmons7.-CALDO MALONATOFundamentoDeterminar la capacidad de un organismo de utilizar malon...
8. CALDO UREAFundamentoLa urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de am...
b.- Incubar a 35 °C durante 24 hc.- En cada revisión de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigera...
tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapón de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar enforma ve...
Fig. 107 Medio MIO con producción de indol + y -12.- DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA.Fundament...
Fig. 108 Prueba de LIA                  DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO13.- REDUCCIÓN DE NITRATOS...
14.- DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIODE HUGH Y LEIFSONLos microorganismos s...
Verde                    +                 +        No asimila glucosa                           Fig. 110’Metabolismo oxid...
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-   Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina, la leche en polvo y los productos lácteos en    polvo. Us...
7.- De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparloscon etanol ...
cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el quedefinitivamen...
Técnicas microbiológicas
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  1. 1. MICROCULTIVOLos mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materiaorgánica y al reciclado de materia orgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas,manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo.Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los champiñones) e indirectamente en laelaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además elqueso Roquefort se produce inoculándolo con Penicillium roquefortii durante su elaboración y otros quesossuaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficieproduciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el interés en la producciónde proteína de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemploel uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Además de la producción dealimentos, los mohos producen ácido cítrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento deAspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metabólicos de Penicillium notatumrevolucionó la medicina moderna, hoy en día se produce con una variedad denominada Penicilliumchrysogenum. Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, ácidofusídicoAlgunas características de los mohos. • Los mohos tienen las siguientes características: • Son eucariontes, presentan un núcleo rodeado de membrana • No contienen clorofila • Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza • Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio • El interior de la hifa puede estar septada o no • Son inmóviles, aunque existen esporas móviles • La mayoría son esporulados • La espora se forma por la fusión de los núcleos de dos células • Si las esporas asexuales están contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa que lo sostiene, esporangióforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se les designa conidiosporas. • Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas • Muestran requerimientos nutricionales mínimos y su pH es cercano a 5,6 • Los límites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70° • Se multiplican abundantemente a humedades elevadas • La mayoría de los mohos son aeróbicos • Son heterótrofos, pero crece bien en cultivos simples • Algunos son termodúricos • Algunos producen micotoxinasLas levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducenpor fisión binaria o gemación. Generalmente son de forma ovaladaLa identificación de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a través de: • Morfología colonial • Microcultivo 68
  2. 2. • Morfología microscópica • Pruebas metabólicas (levaduras) • Composición de la pared celular • Respiración • Nutrición • Reproducción • Genética molecular.Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscilaentre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, debordes lisos.Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo,verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado,algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares.Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuertemediante la realización del microcultivo, observándose las siguientes estructuras:1.- Según su nivel de organización celular pueden ser:- Unicelulares (levaduras)- Pluricelulares (mohos)- Dimórficos (posee ambos tipos de micelio) Fig. 71 a.- Unicelular b.- PluricelularPor su tamaño Fig. 71 Macroscópicos Microscópicos 69
  3. 3. Por su formaFig. 72 Amorfos (masa algodonosa) Definida (crecimiento circular)Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos Aéreo fuera del sustrato Profundos dentro del sustrato 70
  4. 4. Fig. 74 Por su localizaciónPor su aspecto Algodonoso, aterciopelados, terrosos, húmedo, seco.Por su función:- Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes.- Micelio aéreo o reproductor: producción de esporas (sexual y asexual)b) De acuerdo al color de las hifas:- Hialino: cuando no está pigmentado.- Dematiáceo: cuando posee color café oscuro.c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual:- Las esporas asexuales son:Talosporas.a) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas.b) Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya preexistente.c) Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia.Conidiosporasa) Microconidias: Son esporas unicelularesb) Macroconidias: Son esporas multinucleadas.EsporangiosporasSon esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos almicelio vegetativo, por una estructura llamada esporangióforo.- Las esporas sexuales son:Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes.Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes.Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes.Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes.Morfología colonial de mohos y levaduras 71
  5. 5. Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS. Determinar: Tamaño, forma, aspecto, color, producción de pigmento difusible y anotar los días de incubación. Acontinuación se muestran dibujos de mohos filamentosos.Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservación o para larealización del microcultivoSembrar por punto en tubos con PDA y ADSFig. 75 Conservación de cepas de mohos.IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO)1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente. Fig.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo2. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” enuna caja de Petri (previamente esterilizada). 72
  6. 6. Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar3. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado.4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar.5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio.Fig. 78 Inoculación del cubo de agar, y colocación del glicerol para mantener la huemdad6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri.7. Incubar la caja a 28° C durante 48 h.REALIZAR OBSERVACIONES MÍNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS.1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur.Fig. 79 Observación del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivación2. Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos. 73
  7. 7. Fig. 80.- Inactivación del moho3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre unportaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente.4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetossobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X.Fig. 81.- Realización de la preparación en fresco del microcultivo5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía realizar la comparación de las estructurasreproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus spFig. 82 Aspergillus Penicillium Alternaria 74
  8. 8. Fig. 83 Rhizopus spOBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURASPara la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentación de carbohidratos.Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso soncirculares y de diámetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo máspequeñas, son de aspecto húmedo y pueden ser coloridas.Fig. 84 Crecimiento de levadurasOBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS.1. De una placa de PDA incubada a 35°C seleccionar una colonia de levadura.2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria.3. Teñir la preparación con cristal violeta, lavar y dejar escurrir.4. Observar la preparación en 10X y 40X y dibujar. 75
  9. 9. Fig. 85 Observación microscópica de levaduras 76
  10. 10. Métodos de conservación de cepasEn un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar, teniéndose variosmétodos para su conservación pero es necesario tomar en cuenta las características del microorganismos, losmateriales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues sucede que nuestras cepas tipopueden en un momento sufrir las siguientes daños como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de laviabilidad y finalmente la muerte celular. Fig. 91 Deshidratación del medio en tubo con tapón de algodón.Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratoriosde microbiología son: Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y Que estas células permanezcan genéticamente estables. Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los microorganismos. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos restringidos. A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto.Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún asíno se puede descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. Los métodos deconservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización. a) Conservación por congelación.Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturasinferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células deagua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, serecuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista,pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad yestabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes: 1º.- Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos. 2º.- Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas, tanto para la congelación como para la descongelación, por lo que para descongelar conviene poner las células a 37ºC. 77
  11. 11. 3º.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que tiene una temperatura de –195ºC, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de –140ºC. Aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC, como ocurre con la mayoría, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en la suspensión celular, su punto de congelación baja. El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica. Para la conservación en congeladores, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el género bacteriano Clostridium, ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad. 4º.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15 al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa o inositol. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. b).- Conservación por liofilización.Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el aguamediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tantocomo en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto,primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que hayanecesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para esteproceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas sesometen a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dosetapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muyrecomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vezconseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es muycómodo.Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son lógicamente los mismos queinfluyen en la congelación, a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación.Sin embargo, antes de pasar a explicar éstos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los queantes hemos mencionado para el caso de la congelación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, laprimera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se puedenutilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a suelevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos.Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporacióndel agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan comocrioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos,pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo elglutámico-glutamato para las bacterias lácticas, mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sincarne) para bacterias anaerobias.Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservaciónson: 1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos mohos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos. 78
  12. 12. 2. Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 108-109 células /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y levaduras. 3. Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por encima de –50ºC. 4. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células. 6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad. B.- Métodos alternativos.Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equiposnecesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos.Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomiendaconservar el microorganismo empleando varios de estos métodos. a).- Conservación por transferencia periódica.La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sinembargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activasexcretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular,por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método paraconseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones,y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y esposible que ya no conserven algunas de sus características. Si se va a utilizar este método es aconsejableretardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de variasmaneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo; rebajando la proporción de algunos nutrientesen el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que elcrecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y almacenando loscultivos a 4ºC-8ºC. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Conesto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría sertóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muyaerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resultamás fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácarosen los mismos. b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos demicroorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender enagua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de losanteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml enel caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner ensuspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensiónse hace en agua de mar diluida.Para demostrar la eficiencia de un método en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidaden diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica, bioquímica y la virulencia.. C.- Métodos restringidos.En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la horade conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación,como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citarse basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células. 79
  13. 13. a).- Desecación en papel de filtro.Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa decélulas y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento quese llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habidocongelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitarque un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,ocasionando la congelación incontrolada de las células. b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores deesporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es barato y de fácilconservación. Fig. 92 Deshidratación del medio para generación de esporas en mohos Fig. 93 Conservación de esporas en aceite mineral y arena estérilDesecación en bolitas de alginato.Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacióndel agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta quese pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerradosherméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajocontenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que seestá utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales. c).- Desecación en sal para halobacterias.Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente.Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por serinsuficiente el nivel de agua disponible. 80
  14. 14. Por último, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el método empleadoen la conservación de las cepas microbianas, cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para suconservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estadoguardando, porque éstas vienen de una situación de estress más o menos fuerte (sobre todo cuando se hanconservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. Primero habría querevitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo másposible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas enmedios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidadmicrobiana, cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros, o seránecesario tomar precauciones especiales en su conservación. Como ya dijimos al comienzo, no existe unmétodo general de conservación de los microorganismos, aunque no resulta difícil determinar el más aconsejableen cada caso. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con losmétodos generales de congelación y/o liofilización, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos.CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIÓN DE CEPAS POR REFRIGERACIÓN1.- Tomar un tubo con agar de soya y tripticaseína y sembrarlo por estría simple2.- Adicionarle 3 ml de aceite mineral estéril. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno)3.- Cerrar el tubo con el tapón, etiquetar el tubo perfectamente, colocarlo dentro de un bote y guardarlo en elrefrigerador. Fig. 94.- Diferentes formas de conservación de cepas Fig. 95 Una de las formas más usuales de conservar las cepas es en congelación 81
  15. 15. PRUEBAS BIOQUÍMICASAislamientoUna vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo, observamos la placa de Petri, escogeremos las coloniasque estén separadas, a estas les realizaremos la morfología colonial previamente revisada, además haremosuna tinción de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Una vez conocido el Gram podremos realizar laIdentificación del microorganismo y para ello es necesario elegir las más adecuadas acorde a lo que tenemos y alo que nos sugiere la bibliografía, pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valorpara la Identificación.La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, pormedio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunquees posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo odiferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 ml de solución salinafisiológica 0.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas.Los siguientes pruebas de Identificación para bacterias están agrupados por bacterias Gram (-) y +).PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Rojo de metilo Producción de urea Reacción de Voges Proskauer Utilización de Malonato Utilización del citrato Licuefacción de la gelatina Crecimiento en caldo nutritivo Utilización de la esculina Utilización del gluconato Requerimientos de oxígeno Catalasa Oxidasa Reducción de nitratos Fermentación O/FPRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico) Catalasa 82
  16. 16. Oxidasa Reducción de nitratos Hemólisis Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Licuefacción del a gelatina Hidrólisis de la esculina Voges - Proskauer Prueba de la fosfatas Prueba de la DNAsa Incubación a 10 y 45 °C Reducción con azul de metileno Hidrólisis del hipurato Formación de cápsula Hidrólisis del almidónDebemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura parahacer una selección de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo más rápido posible y sin perdida de tiempo yde pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado ya continuación se describirán algunas de ellas.UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS1.- HIDRÓLISIS DE ALMIDÓNFundamento.Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidónen moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.a.- En una caja con agra almidón se procede a inocular por estrías simple la placab.- Incubar la caja a 35°C durante 24 h.c.- Después de la incubación añadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa.- RESULTADOS:+ Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor de la estría.- Negativo.- No se forma un halo claro alrededor de la estría. Fig. 96 Siembra en agar almidón y realización de la prueba con lugol2.- FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL 83
  17. 17. Fundamento:Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendoácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol por loque:Indicador de pH: rojo de fenolpH ácido: Color amarillopH alcalino: Color rojoPrueba positiva: da una coloración amarilla y con la producción de gas (aerogénica)Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. El tiempo de incubación es de 24 ha.- Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol más el carbohidrato por ejemplo sacarosa, inocular 0.1ml de la suspensión microbiana.b.- Incubar a 35 °C de 24 a 48 horasc.- Observar el tubo- RESULTADOS:+ Positivo.- Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham- Negativo.- Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham Fig. 97 Fermentación de un azúcar con campana de Durham3.- FERMENTACIÓN DE AZUCARES EN MEDIO TSI.Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro(TSI).Fundamento:Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción degas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con elhierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufreproduciendo una reacción visible de color negro.La formula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa ylactosa (triple azúcar), el agar esta preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cámaras dereacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su superficie al oxígeno,es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es relativamente anaerobia.Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta, además que estos tenganla misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, paraello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta,para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico deflauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.Indicador de pH: rojo de fenolpH ácido: Color amarillo 84
  18. 18. pH alcalino: Color rojoRESULTADOS:Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo cual la prueba se lee enel fondo del tubo.Glucosa positiva: Fondo del tubo amarilloGlucosa negativa: Fondo alcalino, sin cambio.Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarillaSacarosa y lactosa negativas: superficie rojaLactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta.Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta.Producción de H2S: Presencia de una coloración negra.Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio delfondo dejando un espacio libre.a.- Inocular con el asa recta por picadura y después por estría abierta en forma de “S” sobre el pico de flauta enun tubo con agar TSI a partir de la suspensión.b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar los cambios en el tubo.Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2.- A/A con producción de gas, 3 A/A sinproducción de gas, 4 K/A sin producción de gas y H2S negativo, 5 A/A y H2S positivo sin producción de gas,6K/A con producción de H2S y sin producción de gas.Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin producción de gas y H2S negativo, 2: K/K y H2Snegativo sin producción de gas, 3 K/K sin producción de gas y H2S negativo e inmóvil , 4 K/A con producción degas y H2S negativo, 5: K/A con producción de gas y H2S positivo y móvil y Tubo 6: A/K 85
  19. 19. 4.- PRUEBA DE ROJO DE METILOFundamento:El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cualitativapara la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmicoa partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos queproducen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este pHbajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.La preparación de este medio se hace en tubos de 13 X 100, colocando 4 ml del medio de RM – VP y se inoculacon el cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 – 72 h (no menos de 48 h,finalizando este período, añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo.Indicador de pH: Rojo de metiloRojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la producción de ácido suficientecomo para bajar el pH a 4,4.Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de ácido puedeproducirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa.Controles Prueba Control negativo Control positivo Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenesa.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión al caldo rojo de metilo.b.- Incubar el tubo a 35°C durante 48 h.c.- Después de la incubación, añadir al tubo 2 gotas de la solución de rojo de metilo y observar.RESULTADOS:Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.Prueba negativa: El cultivo no cambia de color. Fig. 100 Resultados del medio rojo de metilo5.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUERFundamento:La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo poracción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el α - naftol actúa comocatalizador para revelar un complejo de color rojo.Indicador de pH: Rojo de metilo 86
  20. 20. Prueba Control negativo Control positivo Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella spa.- Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.1 ml de la suspensiónb.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h.c.- Después de incubar, agregar 6 gotas de solución de alfa-naftol y 2 gotas de solución de KOH, en ese ordenestricto y agitar suavemente, dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio.RESULTADOS:Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetoina)Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio.Fig. 101- Resultado de la prueba de VP, tubo 1 negativo, tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS6.-CITRATO DE SIMMONSFundamentoEsta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono ycompuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización delmedio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella,Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi ySalmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato deamonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH.Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amoniolo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparentepor un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.ControlesControl positivo: Enterobacter aerogenesControl negativo. Escherichia coli.a.- Inocular por estría abierta en forma de “S” un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de lasuspensión.b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.c.- Observar los resultadosRESULTADOS:Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde). 87
  21. 21. Fig. 102 Prueba del citrato de Simmons7.-CALDO MALONATOFundamentoDeterminar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con laconsiguiente alcalinidad.El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico,inhibiendo la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibicióncompetitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que laenzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un bloqueo en laoxidación del ácido succínicoSegún la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidación delácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto ácido es influidoindependientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma otra en un proceso poretapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como el ácido fumárico, el ciclo deKrebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, entonces, recurre al ciclo del ácido glioxílico para laproducción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo continuo de esa manera poder regularla cantidad de acetil coenzima A introducida en el ciclo.Indicador de pH: Azul de bromotimolControlesPrueba Control negativo Control positivoCaldo malonato Salmonella sp Alcaligenes faecalisa.- Inocular con 0.1 ml de la suspensión microbiana un tubo que contenga caldo malonatob.- Incubar el tubo a 35°C durante 24 h y observar.RESULTADOS:Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intensoNegativa: No hay desarrollo ni cambio de color. Fig. 103.- Prueba negativa y prueba positiva 88
  22. 22. 8. CALDO UREAFundamentoLa urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco ydióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea que estapresente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco reaccionan en solución paraformar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio.Inocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensión microbiana a estudiar, si se utiliza agar urea seestría la superficie del medio e incubar el medio a 35 ° C durante 24 h.Indicador de pH: Rojo de fenol.Controles Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia colia.- Inocular 0.1 ml de la suspensión microbiana a un tubo que contenga caldo ureab.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.RESULTADOS- Hidrólisis por producción de ureasa Positiva: Color rosa fucsia en el medio. Negativa: Sin cambio de color en el medio Fig. 104 Prueba negativa y prueba positiva HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:9.- LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (método del tubo)Fundamento:Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son detectadas por ladigestión o licuefacción de la gelatina presente. Estas enzimas que son capaces de gelatinólisis, se denominangelatinazas.Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para sermetabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipoproteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidadayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de las proteínas por las gelatinazas se da en dos etapas laprimera origina polipéptido y posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.ControlesControl positivo: Staphylococcus aureusControl negativo. Listeria monocytogenesa.- Inocular por picadura un tubo que contenga gelatina nutritiva a partir de la suspensión 89
  23. 23. b.- Incubar a 35 °C durante 24 hc.- En cada revisión de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigerador por cinco minutosjunto con el testigo para verificar el resultadod.- Observar si hay licuefacción de la gelatina, en el caso de que la prueba sea negativa hay que volver aincubar. Descartar la prueba negativa hasta los 14 días Fig. 105 Tubo de arriba negativo y el de abajo positivo10.- MEDIO SIMa.- Inocular por picadura con el asa recta un tubo con medio SIM a partir de la suspensiónb.- Incubar a 35 °C durante 24 h.c.- Después de incubar observar el tubo, una coloración negra indica la formación de ácido sulfhídrico yposteriormente añadir 3 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich al tubo para observar la presencia o ausencia deindol.RESULTADOS:Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tuboProducción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamentenegro. Fig.- 106Tubo 1 SIM äcido sulhidrico positivo y movilidad (+), tubo dos Indol negativo, Tubo 3 microorganismo inmóvil, tubo 4 tubo sin inocular, tubo 5 äcido sulfhídrico (+) e indol (-) y tubo 6 H2S (-), e indol (+)11.- MEDIO MIOFundamentoEs un medio semisólido, se siembra por picadura y se incuba 24 h a 35 °C. Sirve para leer la movilidad,producción de Indol y descarboxilación de la ornitina. Cada tubo debe de contener 4 ml del medio utilizando 90
  24. 24. tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapón de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar enforma vertical.La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos oinmóvil. La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de lamolécula de triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitosindólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjuntose denomina “triptofanasa ” .Para esta prueba también se puede inocular la muestra en caldo triptosa o nutritivo incorporado con triptófano al1 %.La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de unmicroorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. Ladescarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas soncapaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico,la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que esformada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos dela descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácidose produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, elfosfato de piridoxal.El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diaminaputrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos lasuperficie del medio con parafina o vaselina.Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.Control Sustancia Control positivo Control negativo Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella spa.- Inocular por picadura un tubo con medio MIO a partir de la suspensión.b.- Incubar a 35 ºC durante 24 h y observar si hay descarboxilación de la ornitinac.- Después de observar adicionar 3 gotas del reactivo de Kovac´s y observar la presencia de indol.RESULTADOSpH ácido: vire de color a amarillo (Desaminación)pH alcalino: vire del color a púrpura o morado (descarboxilación)Movilidad positiva: El medio se enturbia y se ve crecimiento en todo el tuboMovilidad negativa: El crecimiento es sólo a lo largo de la picadura.La descarboxilación de la ornitina se lleva a cabo en condiciones anaeróbicas, por lo tanto la prueba solo se leeen el fondo del tubo.Descarboxilación de la Ornitina positiva: El fondo del tubo debe alcalinizarse y presentar un color púrpura omorado.Descarboxilación de la Ornitina negativa: Fondo del tubo amarillo.Para llevar a cabo la prueba del indol se adiciona a el medio 5 gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovac´s y sedeja durante unos 2 minutos.Indol positivo: Anillo de color rojoIndol negativo: Anillo incoloro o café. 91
  25. 25. Fig. 107 Medio MIO con producción de indol + y -12.- DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA.Fundamento:En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y laDesaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de unmicroorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. Ladescarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas soncapaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico,la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que esformada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos dela descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácidose produce anaeróbicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, elfosfato de piridoxal.El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina cadaverina yanhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie delmedio con parafina o vaselina.Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta, que estos tengan la misma longitudde aproximadamente 3 cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, para ello utilizar tubosde 13 X 100 mm. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay queutilizar el asa recta., primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con unmovimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18- 24 h.Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.Controles: Aminoácido Control positivo Control negativo Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenesa.- Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA a partir de la suspensión.b.- Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observarRESULTADOS:- Desaminación de aminoácidos: Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino. Negativa: La superficie no tiene cambios.- Descarboxilación de aminoácidos: Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura. Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo 92
  26. 26. Fig. 108 Prueba de LIA DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO13.- REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOSFundamentosLa capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para laidentificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos biotipos deEnterobacter agglomerans reducen los nitratos.Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos yotros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α - naftilamina y ácidosulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - α - naftilamina. El color encaso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectannitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es necesario añadir una pequeñacantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos, y eldesarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma lareacción negativa verdadera.Indicador de pH: No tiene indicador.Controles: Prueba Control positivo Control negativo Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticusa.- Inocular 0.1 ml de la suspensión a un tubo con caldo nitratob.- Después de incubar, determinar la presencia de nitritos, añadiendo al tubo 3 gotas de alfa-naftilamina y 3gotas de ácido sulfanílico. Observar si hay cambios de color en el medio: Anotar las observacionesRESULTADOS:- Reducción de nitratos a nitratos Positiva: Aparición de un color rojo en 30 s Negativa: Sin cambio de color. Fig. 109 Prueba positiva y prueba negativa 93
  27. 27. 14.- DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIODE HUGH Y LEIFSONLos microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los subproductos dela fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentaciónconvencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles ypara su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación mas sensible, como el medio OF.Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar laspequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamentemayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólidadel agar permite que los ácidos formados en la superficie se difundan por todo el medio, facilitando lavisualización del viraje del indicador de pH. Este medio es también apto para determinar la movilidad de unmicroorganismo.La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden noproducir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con eltiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final. Para realizar estaprueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se inocula por picadura con la suspensiónmicrobiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta llegar casi al fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml deaceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35 ° Cdurante 48 h o más.Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.Interpretación. Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verdeControles Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella spa.- Inocular por picadura dos tubos con medio de Hugh Leifson, a partir de la suspensión, a un tubo se le agrega0,4 ml de aceite mineral.b.- Incubar a 35 °C y observar a las 24 h y anotar el color del tubo después de la incubación y comparar con elsiguiente cuadro: Color del tubo Tubo con sello Tubo sin sello Tipo de Metabolismo de aceite de aceite Amarillo + + Fermentativo Amarillo - + Oxidativo 94
  28. 28. Verde + + No asimila glucosa Fig. 110’Metabolismo oxidativo y metabolismo fermentativo15.- PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIOFundamento:Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio.La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio delcual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema detransporte de electrones, al aceptor de hidrógeno final, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxidode hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático.ControlesControl positivo: KlebsiellaControl negativo. Escherichia col.a.- Inocular por asada un tubo con caldo cianuro de potasio (KCN) a partir de la suspensión e incubar a 35 °C.durante 24 a 48 hb.- Después de incubar, observar si hay crecimiento o no en el medio.RESULTADOS:Positiva: Presencia de crecimiento (turbidez)Negativa: Ausencia de crecimiento (medio claro) Fig. 111 Crecimiento en KCN16.- PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASAFundamentoLos citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadenarespiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo 95
  29. 29. oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasaes importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. Laprueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) ypara la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas)Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de electrones,sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromooxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladasque se han desarrollado en la placa.2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se recomienda noemplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la superficie formados alesterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.Controles: Prueba Control positivo Control negativo Citocromo Pseudomonas Escherichia coli oxidasa aeruginosaa.- Impregnar un pedazo de papel filtro con el reactivo de oxidasa (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).b.- Tomar una asada del cultivo de TSI y frotarla en el papel y observar.RESULTADOS:Positiva: Color azul violeta.Negativa: No hay cambio de color. Fig. 112 Prueba de oxidas positiva y negativa17.- PRODUCCIÓN DE CATALASASe utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacteriasaerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: • Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). • Bacillus (+) de Clostridium (-). • Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:Método del portaobjetos (recomendado): 96
  30. 30. • Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. • Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. • Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). • Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. • Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precauciónde no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y supresencia dará un falso resultado positivoFundamento.Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias yanaerobias facultativas que contienen citocromo.La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente lacatalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina.El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de loshidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasatransforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.ControlesControl positivo: Staphylococcus aureusControl negativo. Streptococcus spRESULTADOS:Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno. Fig. 113 Prueba positiva, negativa y positiva de la enzima peroxidas 97
  31. 31. PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISISMICROBIOLÓGICOEn el análisis microbiológico de alimentos, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, los medios deconservación y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos yconfiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño oel volumen, en lo posible, serán representativos del producto y del lote o partida de donde provienen.La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa, tanto ambiental comohumana para asegurar la integridad de la misma.Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieranafectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideración. Lascondiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la recolección de la muestra, su entrega allaboratorio, así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que lapoblación microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. Esto es especialmente cierto en losalimentos perecederos.Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos perecederos, ya que para, finesoficiales la Ley General de Salud señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisispracticado, si existe alguna duda sobre la veracidad de estos, el particular puede impugnar dentro del plazocontemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestratestigo en un laboratorio que ésta señale en presencia dé las partes interesadas y el resultado obtenido sea elque en forma definitiva acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias.Sin embargo los alimentos, aún en condiciones apropiadas de conservación, pueden sufrir cambios significativosen sus características biológicas y/o fisicoquímicas, provocando que los resultados de las muestras testigo seanimprocedentes.PARÁMETROS QUE PUEDEN AFECTAR EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOa.- Tiempo de transportación. Si es muy largo y no se mantiene en condiciones adecuadas el número demicroorganismos puede aumentar o disminuir.b.- Temperatura. Si no es la adecuada el número de microorganismos se eleva o disminuye según latemperatura a la que se transporte o almacene.c.- pH. Si los microorganismos continúan su metabolismo y aumentan el pH el número puede disminuirVOCABULARIO1.- Asépticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio.2.- Fecha de caducidad, fecha limite en que se considera que un producto, almacenado en las condicionessugeridas por el fabricante, conserva las características sanitarias que debe de reunir para su consumo. Despuésde esta fecha no debe comercializarse ni consumirse.3.- Muestra representativa, es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en formaaleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del que procede.4.- Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y en disposición de la autoridad competente.5.- Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química, su vida útil es dehasta 30 días, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiquetao envase.6.- Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidaddel lote o partida.7.- Vida útil o vida de anaquel, es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidadsanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones específicas de procesamiento, envasado yalmacenamiento.SIGNIFICADO SANITARIOLa adecuada toma de muestra para el análisis es de primordial importancia. Si la muestra esta recolectada enforma impropia, esto no es representativo del lote y el resultado final puede ser erróneo. Una muestrarepresentativa es esencial cuando se buscan microorganismos patógenos o toxinas. 98
  32. 32. MUESTREO Y ALMACENAMIENTOEn la siguiente tabla se enlistan los productos competencia del control Sanitario de Bienes y Servicios, así comoel tamaño mínimo de muestra necesario para la realización de un análisis básicos y especiales.Para el análisis básico que comprende microbiológicos, fisicoquímicos y algunas veces biológicos, se indica eltamaño mínimo de muestra que se debe tomar, tanto en unidades (frascos, botes, latas, cajas, etc. Según sea lapresentación comercial del producto), como en masa o volumen: gramos (g), kilogramos (kg) o litros (l).Nivel de análisis y mínimo tamaño de la muestra para su entrega al laboratorio.No. Producto Cantidad mínima Cantidad adicional especial Básico Microbiológico Fisicoquímicos Metales pesados Plaguicidas Otros1 Agua purificada 2 Un o 2 l 1l 1l 1l2 Hielo 2 Un o 2 g 1 kg 1 kg 1 kg3 Leche pasteurizada, no 2 Un 2 l 1l 1l 2l pasteurizada4 Leche ultrapasteurizada 2 Un 2 l 1l 1l 2l5 Leche evaporada 2 Un o 25 g 1 Un 2 Un 2 Un 2l6 Leche condensada 3 Un o 250 g * 1 Un azucarada7 Leche deshidratada 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg8 Leche rehidratada 2 Un o 2 l * * 2 UN o 2l 1kg Radioactivo9 Quesos 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg10 Mantequilla 2 Un o 500 g 250 g 250 g 1 kg11 Grasa butírica 2 Un o 500 g 1 kg12 Sueros 2 Un o 500 g * 250 g 2 kg13 Crema 2 Un o 500 g * 250 g 1 kg14 Yogurt 2 Un o 500 g * 1 kg15 Jocoque 2 Un o 500 g * 250 g16 Cajeta 2 Un o 250 g * 500 g17 Flan 3 Un o 500 g *18 Helado 2 Un o 500 g * 250 g19 Leche reconstituida 2 Un o 2 l 1l 2l 2l20 Cremas vegetales 2 Un o 500 g * 250 g21 Imitación de quesos 2 Un o 500 g * 250 g22 Helado de crema vegetal 2 Un o 500 g * 250 g23 Carne 1 kg * 1 kg Biológico24 Productos de carne 2 Un o 250 g 250 g 250 g 500g 1 kg25 Aves 1 Un o 250 g Pieza completa26 Productos de la pesca 2 Un o 500 g 250 g 1 kg 1 kg Biológico (pescados y mariscos)27 Productos industrializados 2 Un o 500 g 250 g 500 g 1 kg de la pesca28 Productos derivados de la 2 Un o 500 g 2 Un ó 200 2 Un o 200 500 g 500 g pesca g g29 Huevo 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l30 Huevo y sus derivados 4 Un o 200 g 1 Un o .5 l 0.5 l31 Aceite comestible 1 Un o 1 l 1 Un o .5 l 0.5 l32 Manteca de cerdo 1 Un o 1l 1 Un o .5 l 0.5 l33 Sebo 1 Un o 1 l 500 g 500 g34 Manteca vegetal 1 Un o 1 l35 Grasas compuestas 1 Un o 1 kg 500 g 2 kg 500g36 Aditivos para alimentos 200 g 250 g 500 g37 Frutas, hortalizas, legumbres 1 kg ó 5 Un * 500 g frescas procesadas38 Fórmulas para lactantes 2 Un o 500 g * 500 g39 Alimentos envasados para 2 Un o 500 g 250 g lactantes y niños de corta edad 99
  33. 33. 40 Alimentos a base de 2 Un o 500 g cereales para lactantes41 Cacao y sus derivados 250 g 500 g 2 kg42 Cocoa 250 g 500 g 2 kg43 Café y sus derivados 250 g 500 g 2 kg44 Café tostado 250 g 500 g 2 kg45 Té y sus derivados 500 g * 500 g 2 kg46 Productos para infusiones 500 g * 500 g 2 kg47 Bebidas no alcohólicas 5 Un * 3 Un48 Productos para regímenes 5 Un * 3 Un especiales49 Productos para preparar 2 Un, 1l ó * 1 l ó 250 g bebidas no alcohólicas y 500 g refrescos50 Bebidas no alcohólicas 2 Un, 1 l ó * 1 l o 250 g congeladas 500 g51 Cereales 2 Un ó 500 g * * 3 kg 3 kg52 Harinas de cereales 500 g * 500 g 3 kg 3 kg53 Harina de leguminosas 500 g * 500 g 3 kg 3 kg secas y sus derivados54 Productos de harina de 2 Un o 1 kg * 500 g 3 kg 3 kg cereales55 Productos amiláceos y 2 Un o 500 g * 250 g 500 g 500g frituras56 Edulcolorantes nutritivos 2 Un o 500 g 2 Un o 500g 250 g 500 g57 Gelatinas y sustitutos 3 Un ó 750 g 250 g58 Golosinas 4 Un o 400 g *59 Condimentos 500 g60 Sal 1000 g *61 Aderezos 2 Un ó 500 g * 250 g62 Conservas y enlatados 6 Un del * ácidos mismo lote63 Alimentos preparados 2 Un ó 200 g * 200 g deshidratados64 Conservas y enlatados de 6 Un del * 1 Un del 2 Un o 500 g baja acidez mismo lote mismo lote65 Alimentos preparados 1 Un o 250 g 1 Un o 250g * refrigerados o congelados66 Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 ml * 1 Uno 750 ml 1 Un o 750 ml67 Bebidas alcohólicas 1 Un o 250 g * 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml fermentados68 Bebidas destiladas 2 Un o 1500 ml * 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml69 Licores 2 UN o * 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1500 ml70 Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 preparadas y envasadas ml ml71 Tabaco, sus productos y 5 Un o 1 envasa( 5 Un o 1 envase tabaco pipa) sucedáneos (tabaco de pipa)72 Productos para modificar el 2 Un o 50 – 2 UN 50 – 100 ml olor del cuerpo 100 ml73 Productos para el cabello 5 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un ó 200 g Un74 Productos para el cuerpo 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un ó 200 g n Un75 Productos para manos y 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un ó 200 g uñas Un 100
  34. 34. n76 Productos para el aseo de 6 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un ó 200 g la persona n Un77 Productos de aseo 200 g 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un ó 200 g n Un78 Productos repelentes a 4 Un 2 Un o 50 – 100 Biol 1 ml, 3 Un, 2 Un o insectos (que se aplican 50 – 100 ml, Un directamente sobre la piel)79 Faciales cremas, 5 Un * 2 Un 3 Un Biol maquillajes, rubores, mascarillas, delineadores, lápices, etc.)80 Para niños (talcos, aceites, 5 Un * 2 Un 3 Un Biol etc.)81 Alimentos preparados listos 250 g 250 g para servirseTomado de:HERRAMIENTAS PARA EL MUESTREOLas herramientas de que puede disponer un analista varia desde instrumentos comunes para fines de caráctergeneral hasta herramientas especiales, que han de utilizarse en determinadas situaciones para hacer exámenesespecíficos de productos alimenticios especiales. Todo el equipo para el muestreo deberá estar limpio y secocuando vaya a utilizarse.Para la toma de muestras para análisis microbiológico, es esencial disponer herramientas de muestreo,envueltas individualmente, previamente esterilizadas, y de recipientes irrompibles esterilizados.Las herramientas tales como los espátulas, cucharillas, etc., deberán ser lisos, sin ningún diseño en la superficie,totalmente de acero inoxidable, envueltos individualmente y esterilizados en la autoclave antes de llevarlos allugar donde van a utilizarse.Cuando sea necesario esterilizar una herramienta de muestreo en la fábrica, el analista debe seguir el siguienteprocedimiento: lavarla perfectamente en la pila de lavado del equipo de la empresa, secarla con una toalla limpia;flamearla después con la llama de una lámpara de alcohol, y enfriarla antes de utilizarla, la herramienta puedeenfriarse con alcohol.INSTRUMENTAL Y EQUIPO BÁSICO DE MUESTREO- Recipientes isotérmicos: Cajas de material aislante equipados con tapas y espacios suficientes para colocar los refrigerantes y las muestras que deberán permanecer en la temperatura deseada hasta su ingreso al laboratorio.- Bolsas limpias de polietileno estériles de varias medidas para submuestras.- Pinzas, tijeras, espátulas, cucharas, cuchillos afilados, termómetro con un intervalo de 0 a 100 grados centígrados; hielo o líquidos precongelados.- Hielo seco para las muestras congeladas, hielo o recipientes con líquido precongelados para la refrigeración.- Papelería: plumones marcadores de agua, etiquetas adhesivas, masking tape, diurex, plumas.- Bata, cubrebocas, malla para pelo o cofia.- Herramientas comunes como alicates, destornilladores y cuchillos, son útiles para abrir los envases, cortar sacos y vaciar los productos alimenticios. Puede disponerse de una herramienta especial para abrir las cajas de cartón que se utilizan para el transporte, ocasionándoles daños mínimos.- Una lámpara sorda de luz brillante es muy útil cuando hay que trabajar en zonas poco iluminadas. En zonas polvorientas como molinos harineros o elevadores de grano, deberá utilizarse una linterna a prueba de explosiones. Se pueden utilizar unas tijeras para cortar los embalajes de tela, o unas pinzas para manipular los cortes hechos en los sacos. 101
  35. 35. - Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina, la leche en polvo y los productos lácteos en polvo. Usualmente habrá que sacar el producto de la probeta con una espátula. Esta probeta no deberá usarse para la toma de muestras microbiológicas. Puede utilizarse también un cucharón adecuado de acero inoxidable o aluminio.- Sondas o probetas especiales se usan para el muestreo de la mantequilla y el queso. Se hace penetrar la probeta en el producto, y después se la hace girar para cortar un trozo cilíndrico. Para la toma de muestras de queso solamente, se necesitará un compuesto obturante hecho a base de parafina o cera de abejas, para cerrar de nuevo herméticamente las zonas de las que se han tomado las muestras.- Un manguito o probeta para harina sirve para el muestreo de las tolvas (fondos) de los elevadores de molinos harineros u hornos de pan de grandes dimensiones. La probeta se clava en el material estático del equipo, y después se saca para su examen.- Se emplean cucharas y pipetas de plástico desechables esterilizadas para un muestreo aséptico destinado al análisis microbiológico. Podrán utilizarse también guantes de cirujano de látex o PVC para poder manipular los instrumentos de muestreo sin introducir microorganismos en la muestra.- Un tamiz metálico o un recogedor se utilizan para controlar si los cereales a granel tienen insectos, heces de roedores y otras materias extrañas.- Termómetro completamente metálico, o dos si es necesario para abarcar la escala de temperatura de -35 a 100 grados centígrados, con intervalos de graduación no superiores a 2 grados centígrados. Su precisión deberá calibrarse regularmente con los laboratorios de metrología oficiales.- Se usará alcohol isopropilíco o etílico al 70 %, que el muestreador puede llevar en una botella de plástico, para desinfectar las herramientas de muestreo. Podrán utilizarse indicadores de papel para determinar si existen residuos de cloro y tomar el pH del producto, pero este ensayo no debe constituir un sustituto de determinaciones precisas de pH.- Papel aluminio. Papel estraza.- Algodón.- Cerillos o encendedor.- Lámparas de alcohol.- Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio para la toma de muestra- Hielo o bolsas refrigerantes.- Guantes estérilesEQUIPOAutoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada 121 ° C ±1 ° CHorno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C.Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperatura de alimentos intervalos de -40 a 100°C,con intervalos no superiores a 1 °C.Preparación del Material para la Toma de la Muestra.1.- Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras,que van a estar en contado directo con el alimento, debe estar limpio, estéril y libre de substancias que pudieranafectar la viabilidad de los microorganismos.2.- El material para la toma de muestra que requiera esterilización, se envolverá en forma individual debidamenteidentificado, con papel de Kraf antes de esterilizado.3.- La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos adecuadamente.4.- Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.5.- El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15minutos o en homo a 170°C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza.6.- Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación posterior. 102
  36. 36. 7.- De ser necesario, si se requiere mayor número de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparloscon etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estériles para evitar sucontaminación o inmediatamente utilizarlos.PROCEDIMIENTOEl procedimiento para la toma de muestra, dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen:OBTENCIÓN1.- La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará acabo en forma aleatoria y no aséptica, tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis,enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.2.- Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y extraer la muestra encondiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana.3.- Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamenteasépticas.4.- Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en áreas donde las condicionessanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas.5.- Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar éste. Paramuestreo aséptico debe utilizarse bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos conel producto deberán usarse guantes estériles.6.- La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma demuestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior delos envases y evitar que la tapa se contamine.7.- Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de laque se envía para su análisis.8.- Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora losalimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que empleanormalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura enque se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse atemperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.9.- En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar ydespués efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.10.- En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensiliosestériles como sacabocados, cucharas y o cuchillos.11.- En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestrarepresentativa.12.- Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel,antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salidacon el flujo.PRODUCTOS PERECEDEROS1.- Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran comoalimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel, sedeterminará la fecha de caducidad, con base en productos de características similares.2.- Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta norma,como no perecederos.3.- Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria será únicamente porduplicado, la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder delinteresado para su análisis particular si es necesario.4.- En caso de impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de Salud, en productosperecederos, la toma de muestra subsecuente la llevará a cabo personal autorizado tomando como muestras enforma aleatoria del lote existente o la cantidad o número estipulado en la norma correspondiente del producto, la 103
  37. 37. cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el quedefinitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. Elnúmero de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de cinco o lo que estipule la normacorrespondiente.IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA1.- En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despuésde colocar en él la muestra, mediante rótulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos:2.- Fecha, lugar, hora del muestreo, número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede.3.- La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco la caja, en el nudo o cierre de la bolsa enforma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada.CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE1.- El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracióno contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.2.- Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos perecederos setransportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta elmomento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección.En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando para conservarla hieloseco. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con liquido refrigerante o hielo potablecontenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envaseso que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.3.- En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o unacantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga encontacto con el exterior de la envoltura.4.- En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o contaminen con otras.5.- Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperaturaambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C6.- Para la conservación, durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustanciasquímicas.7.- Las muestras que se entreguen al laboratorio de preferencia deberá acompañarse de un informe y el númerode unidades y/o cantidad.a.- Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor.b.- Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y cualquier otra informaciónque se considere importante.c.-Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antesde efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisismicrobiológicos que sean necesarios.d.- La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen elcumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación.Tomado de: NOM-109-SSA1–1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestrasde alimentos para su análisis microbiológicoMUESTRAS PARA AGUA1 Frasco para muestra de agua. a.- Lavar y secar perfectamente un frasco de boca ancha de 500 ml con tapa.b.- Si la muestra proviene de agua que no ha sido clorada esterilizar el frasco en estufa a 170º C, por una horao a 121º C durante 15 min.c.- Si la muestra de agua posee cloro residual los frascos se deben esterilizar en estufa a 170º C, por una horao en autoclave a 120º C durante 15 min, los cuales deben contener 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada125 ml de capacidad de los mismos. 104

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