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Manual inmunología aplicada

  1. 1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 1 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS MANUAL DE PRÁCTICAS DELLABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADAProfesores de LaboratorioDra. María del Carmen Oliver SalvadorM. en C. Paola B. Zárate SeguraDr. Luis Gilberto Torres BustillosM. en C. Rodrigo Balam Muñoz SotoIBT Héctor Molina JiménezIBT Hernán Cortés Arroyo OCTUBRE 2008
  2. 2. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 2 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA ÍNDICE GENERALPRÁCTICA 1. TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS 4PRÁCTICA 2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN 8PRÁCTICA 3. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN 14PRÁCTICA 4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD 18PRÁCTICA 5. DETERMINACIÓN DE REACCIÓN Ag-Ac PORELECTROTRANSFERENCIA 20
  3. 3. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 3 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA REGLAMENTO DEL LABORATORIOEl laboratorio representará el 30% de la calificación final de la materia de InmunologíaAplicada.La calificación de laboratorio se distribuirá de la siguiente manera:1. TRABAJO PRÁCTICO 40% - Asistencia al laboratorio. - Puntualidad. Se dará un máximo de tolerancia de 10 minutos. - Manutención de los conejos. Se evaluará la limpieza del bioterio así como el cumplimiento y la responsabilidad de los conejos diariamente. - Cada alumno deberá presentarse a la sesión de laboratorio con bata y con el manual de prácticas engargolado en el cual deberán anotar todos los resultados obtenidos en las prácticas. No se permitirá el acceso al laboratorio si no se cumple este requisito. - El material se entregará una vez llenado de manera correcta el vale correspondiente. - El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estará regido por el reglamento general del laboratorio de biotecnología.2. INFORME POR EQUIPO 40%Este porcentaje se divide en:- Introducción 10%- Objetivo- Resultados 15%- Discusión de resultados 20% - Cuestionario 20%- Conclusiones 30%- Referencias 5%(diferentes a las mencionadas en la práctica)3. EXAMEN DE LABORATORIO Consistirá en una evaluación del conocimiento adquirido durante las prácticas
  4. 4. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 4 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA 1 TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS1. INTRODUCCIÓNSISTEMA ABO Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas determinadasgenéticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos específicos. Elprimer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llamósistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glóbulos rojos uno, dos oninguno de los dos antígenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. Así, los individuospueden ser del tipo A, si solamente poseen el antígeno A; del tipo B, si únicamente tienenel antígeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos.La naturaleza química de los determinantes antigénicos es polisacarídica. Aproximadamente el 85% de la población posee sustancias con característicasantigénicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de loseritrocitos en prácticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se lesllama secretores. Los carbohidratos que forman estructura antigénica A y B en la membrana de losglóbulos rojos, también están presentes en otros materiales biológicos como bacterias,alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistenteestímulo. Los humanos reaccionan a este estímulo produciendo anticuerpos contraaquellos antígenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razón, elanticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antígenos,no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.Sistema Rh En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reacciónhemolítica después de la transfusión sanguínea proveniente de su esposo. El antígenoresponsable fue diferente de los ya conocidos en la época. En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos demonos Macacus rhesus, basandose en la suposición de que en los eritrocitos de estosmonos podrían existir antígenos similares a los de los humanos. El suero obtenidoaglutinaba los glóbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la población humanablanca. Hasta ese momento todo sugería que el supuesto antígeno hallado porLandsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antígeno descrito por Levine y Stetson enhumanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestosantígenos eran diferentes; se determinó que la mayoría de los humanos tienen el antígenodel mono rhesus y además otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, seconservó la demostración del factor Rh para el antígeno humano, y se le asignó el nombrede LW al antígeno común al hoimbre y al mono. A mediados de la década de los 40, se habían identificado cinco antígenos comopertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antígenos (C, c, D, E, e) secombinan entre sí, dando lugar a diversos patronesantigénicos. El D tiene dominanciaantigénica. Los individuos que presentan el antígeno D en sus eritrocitos se denominanRh(+), y aquellos que no tienen el antígeno D se denominan Rh(-).
  5. 5. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 5 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA Además de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemasantigénicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estossistemas se consideran secundarios. El conocimiento de los antígenos sanguíneos ABO y Rh. Como antígenoscelulares importantes en transfusiones sanguíneas, en medicina legal y en laisoinmunización materno-fetal. Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que sonaltamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinación deeste sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguíneas.2. OBJETIVOS2.1 OBJETIVO GENERAL Determinar el sistema ABO y Rh de diferentes muestras.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2.2.1 Realizar la extracción sanguínea por jeringa 2.2.2 Realizar la tipificación sanguínea del sistema ABO3. MATERIALES Y REACTIVOS3.1 Material por grupoCentrífuga clínicaBaño maría a 37°C3.2 Material por equipo1 Frasco de torundas de alcohol2 portaobjetos3 pipetas PasteurJeringa desechable de 5 mL con aguja de 21x32mm2 tubos de ensaye de 13x 100mL1 pipeta serológica de 5 mL1 pipeta serológica de 1 mL5 palillos de maderaSueros tipificadotes anti-A, anti-B, anti-ABSolución de albumina bovina al 25%Eritrocitos humanos tipo A, B y 0, en suspensión al 5%2 tubos de ensaye 10 x 75mmTubo con tapón de roscaSuero tipificador anti-D comercialSolución salina al 0.85%Suero de Coombs4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1. Tipificación Sanguínea 1. Obtener aproximadamente 5 mL de sangre venosa y colocarla en un tubo sinanticoagulante, permitir que se retraiga el coágulo incubando a 37°C 10 min y centrifugarpara separar el suero del paquete celular.
  6. 6. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 6 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA 2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB ytestigo. Rotular otra placa diferente con: A, B y 0. 3. Del mismo tubo donde se dejó coagular la sangre, con una pipeta pasteur tomareritrocitos del fondo (de los no atrapados en el coágulo). Colocar una gota de estasuspensión en el portaobjetos que tiene las marcas anti A, anti-B, anti-AB y testigo. 4. Cerca de cada gota, adicionar una gota de suero comercial anti-A, anti-B y anti-AB, según corresponda y en el lugar marcado como testigo, colocar una gota de lasolución de albúmina al 25%. Mezclar primero suavemente con un palillo y después conmovimientos rotatorios. 5. Buscar la presencia de aglutinación antes de 25 seg. Por ejemplo, si se observa el siguiente resultado: Anti-A Anti-B Anti-AB Testigo Aglutinación - + + - Esto indicaría que los eritrocitos probados corresponden al grupo sanguíneo B. 6. Para buscar las isohemaglutininas, en la otra placa marcada como A, B y 0,colocar una gota del individuo frente a las marcas y agregar cerca una gota de eritrocitospreviamente tipificados de tipo sanguíneo A, B y 0, según corresponda. 7. Mezclar suavemente, primero con ayuda de un palillo y después conmovimientos rotatorios. 8. Buscar la presencia de aglutinación.Resultados. De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el gruposanguíneo serían: A B 0 Aglutinación + - -Por lo que el individuo correspondería al tipo B.En el sistema ABO el grupo sanguíneo esta dado por la siguiente tabla.Reacción de los eritrocitos con antisueros Reacción con el suero con antígenos Grupocomerciales conocidos sanguíneoAnti-A Anti-B Anti-AB A B O+ - + - + - A- + + + - - B+ + + - - - AB- - - + + - OEn caso de que se presente aglutinación en el testigo, se debe a que existenautoanticuerpos antieritrocitos y esto DEBE de ser reportado inmediatamente. 4.2. Sistema Rh De este sistema por su mayor inmunogenicidad, sólo se determina de forma rutinaria el antígeno D en caso de requerirse una transfusión sanguínea. Por la naturalez proteica del antígeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG que pueden atravesar placenta y causar hemólisis intrauterina en caso de incompatibilidad materno-fetal.
  7. 7. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 7 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapón derosca que contenga 2 mL de SS.2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno.3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente.4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente.5. Centrifugar 1000 rpm 60seg6. Buscar aglutinación, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+)7.Si no hay en ninguno incubar a 37°C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a1500 rpm 2 min. Después de la última centrifugación remover el sobrenadante yadicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs.8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg.Resultados.Presencia de aglutinación.Rh con aglutinación corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-).Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusión el sujetoclasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-).5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. “Agglutination and agglutination- inhibition”. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black Scientific Publications. Oxford.2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. Year Book Medical Publishers, Inc.Chicago.
  8. 8. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 8 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA 2 ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN1. INTRODUCCIÓN. La Inmunización es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuocompetente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmunógeno. Eltipo y magnitud de la respuesta producida se deben a múltiples variables entre ellas seencuentra: la inmunogenicidad de un antígeno, que depende de su complejidadestructural, peso molecular, conformación y naturaleza química, dosis, vía deadministración etc.La síntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra moléculas específicas que el organismono reconoce como propias (determinantes antigénicos), para que esta síntesis ocurra,primero debe existir un contacto entre las células encargadas de la síntesis y eldeterminante antigénico, contacto que es mediado por algunas células involucradas en larespuesta celular.Cuando un organismo se expone a un antígeno desconocido, el sistema inmune puederequerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos. Al final de lainfección la concentración alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llamaprimaria. Cuando el organismo se expone posteriormente al antígeno, la respuesta ocurremucho más rápido y la concentración alcanzada, es apreciablemente mayor, en este casose habla de respuesta secundaria.La aplicación práctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con finesterapéuticos (inmunización pasiva), en diversos estados infecciosos o tóxicos (neumoníalobar, tétanos, etc.). Además son útiles en la identificación de microorganismos aisladosde procesos infecciosos y en la clasificación taxonómica de diversas especies. Tambiénhan servido como herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunológicosbásicos (especificidad inmunológica, activación del complemento, fagocitosis,citotoxicidad, etc.) y en la determinación rápida y específica de la naturaleza de diversassustancias químicas (proteínas, carbohidratos, haptenos, etc).ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterogéneasi se toman en consideración su origen, naturaleza química y actividad biológicaespecífica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2funciones fundamentales: la estimulación de la resistencia no específica del huéspedcontra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y, por otra parte, la potenciación de lainmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales delaboratorio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de antisueros.Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antígeno o inyectadossimultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se lograuna economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerposespecíficos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios delos siguientes procesos: a) Incremento de la producción de anticuerpos específicos frente a un antígeno vacunal.
  9. 9. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 9 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciación de su función neutralizante, germicida, opsonizante etc. c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por células T. d) Generación de una respuesta humoral y/o celular de mayor duración. e) Generación de una respuesta incrementada de memoria inmunológica.Algunos adyuvantes son en si antigénicos (endotoxinas de bacterias gramnegativas,como Bordetella pertussis, o algunas bacterias grampositivas y el género de lasmicobacterias, etc.) mientras que otros no lo son (tartrato de alumínico de potasio oalumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores,polinucleótidos y otros).El adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol oNujol) con un detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, porejemplo, Arlacer-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freud(FCA) contiene además del aceite y el detergente, una micobacteria (M. tuberculosis, M.bovis u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la bacteria, peso seco, por cadamL de la mezcla incompleta de Freund). Este ha sido utilizado durante más de 50 años enla producción de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se disponede cantidades limitadas de antígenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. Lagravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos porencontrar opciones igualmente efectivas y menos tóxicas no han resultado del todoexitosos. Con los avances alcanzados en numerosas áreas de las ciencias biológicas y elcreciente interés por el bienestar de los animales de experimentación, existe unaconsiderable presión para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en laactualidad con alternativas definitivas para este adyuvante, en diferentes estudioscomparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor númerode efectos adversos y mayor facilidad en la manipulación.En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante Freund completo eincompleto ya que frecuentemente su aplicación conduce al desarrollo de granulomasseveros.VÍAS DE INMUNIZACIÓN.Se pueden emplear vías tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa,intracardiaca, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, etc.El estado físico del antígeno (particulado o soluble) debe tenerse en cuenta para escogerla ruta de inmunización; es decir, los antígenos particulados por lo general sonintroducidos por vía intravenosa, mientras que los antígenos en solución puedenintroducirse por otras vías como la intramuscular, la intraperitoneal, la subcutánea o laintradérmica. En estas dos últimas vías preferentemente se utiliza al antígenoacompañado con adyuvante.La mayoría de las veces sólo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo más deun estímulo antigénico, asegurando así que se obtendrán títulos altos de anticuerpos o elnúmero deseado de células específicas estimuladas.2. OBJETIVOS.2.1. OBJETIVO GENERAL. Desarrollar diferentes esquemas de inmunización en animales.
  10. 10. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 10 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.2.2.1. Desarrollar esquema de inmunización en conejos raza Nueva Zelanda2.2.2. Desarrollar el esquema de inmunización para diversos antígenos3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1 Material por Grupo. Centrífuga clínica. Baño María a 37°C.3.2. Material por Equipo. Antígeno suficiente para inmunizar a conejos, de acuerdo al protocolo de inmunización. Un conejo que no rebase 5 Kg. de peso (de preferencia de color blanco, para facilitar la localización de la vena marginal de la oreja). Adyuvante incompleto de Freund. Jeringas de 1 mL con aguja de 25x16 (5/8) mm. Un lienzo para sujetar al conejo. Un frasco con torundas de algodón y alcohol al 70%. Frasco de solución salina fisiológica estéril (0.85%). Mechero Bunsen.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1 TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEAPara todos los antígenos el sangrado se hace antes y después de la última inmunización,tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo esindispensable para contar con un suero testigo. Venosa. 1. Inmovilizar al animal. 2. Tomar la oreja. 3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%. 4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposición del a vena. 5. Hacer un corte con una navaja de bisturí estéril de 2mm de longitudinalmente a la vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante. 6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja. Antes de iniciar el esquema de inmunización correspondiente. Dejar coagular la muestra sanguínea y separar el suero por centrifugación. Este suero, será el testigo, debe ser conservado en un tubo de ensayo, sellado y rotulado adecuadamente, en congelación, hasta que se concluya con el esquema.4.2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN. A. mexicaina (Proteasa de origen vegetal, extraída, tratada y purificada) Inyección Tiempo Dosis Vía (Días) (mg)
  11. 11. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 11 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA 1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund vía intradérmica o subcutánea. 2 15 0.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunización pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por vía subcutánea o intradérmica. 3 30 0.5 En SS 0.85%, por vía subcutánea o intradérmica. Sangrado 39 -- Vía intravenosa o intracardíaca para la obtención del antisuero. SS = Solución SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación pordensitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford. A. Papaína (Proteasa de origen vegetal, extraída, tratada y purificada) Inyección Tiempo Dosis Vía (Días) (mg) 1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund vía intradérmica o subcutánea. 2 15 0.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunización pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por vía subcutánea o entradérmica. 3 30 0.5 En SS 0.85%, por vía subcutánea o intradérmica. Sangrado 39 -- Vía intravenosa o intracardíaca para la obtención del antisuero. SS = Solución SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación pordensitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford. B. Salmonella entérica transformada con plásmidos pL-STPN. Las cepas fueron sembradas en tioglicolato durante 10h para inducir la expresión de las proteínas, la inoculación se realizara en concentraciones de 1x 10 5 celulas/mL.
  12. 12. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 12 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA Inyección Tiempo Dosis Vía (Días) (mg) 1 0 0.5 El antígeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5mL de adyuvante incompleto de Freund vía intradérmica o subcutánea. 2 15 0.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunización pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por vía subcutánea o intradérmica. 3 30 0.5 En SS 0.85%, por vía subcutánea o intradérmica. Sangrado 39 -- Vía intravenosa o intracardíaca para la obtención del antisuero. SS = Solución SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación pordensitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford.4.2. Una vez terminado el esquema de inmunización en cada caso, realice un gel deelectroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenidodespués de terminado el esquema de inmunización y de los antígenos utilizados. Colocarel siguiente orden en el gel. 1. Marcador de peso molecular. 2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunización. 3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunización. 4. Antígeno inyectado. 5. Estandar de IgG de conejo.4.3. Cuantificar por medio de densitometría la proporción de IgG obtenidas. (% pureza).4.4. Reportar el gel final como resultado de esta práctica.5. CUESTIONARIO. 5.1 ¿Qué es un antígeno soluble y qué es un antígeno partículado? 5.2 ¿Por qué se utilizan las diferentes vías de inmunización para los antígenos? 5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunación, los principales tipos de adyuvantes y su mecanismo de acción, así como restricciones de uso. 5.4 Cite 5 tipos de antígenos utilizados para la inmunización de animales, describiendo la naturaleza del antígeno, la vía de inmunización que se utiliza y especie de animal en que se desarrolla. 5.5 . Investigue las nuevas vías de administración de proteínas para generar respuesta inmune. 5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo específico de respuesta inmune (no específica, humoral o celular) en un organismo. 5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en el gel de acrilamida.6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología. Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.6.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (1998). Departamento de Inmunología. Escuela Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.
  13. 13. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 13 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA6.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993). Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306.
  14. 14. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 14 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA 3 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN1. INTRODUCCIÓNLa reacción de la precipitación se presenta cuando un antígeno multivalente en estadosoluble, se une con su anticuerpo específico y así da lugar a la formación de un complejoinsoluble. Esta reacción se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antígenos yanticuerpos y se puede llevar a cabo en medio de líquido o semisólido.La precipitación en medio líquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera,sólo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitadoformado se le determina la concentración de proteínas totales por métodosespectrofotométricos o bien por el análisis de nitrógeno proteico empleado en el métodode Kjelndahl.Cuando la reacción se realiza en medio líquido, la cantidad de precipitado varía según laproporción de los reactivos. Si se dispone de una serie de tubos capilares que contenganel mismo volumen de suero y cantidades crecientes de antígeno, puede observarse que elprecipitado formado alcanza un máximo, después del cual, progresivamente, se encuentrauna disminución en la cantidad de precipitado.Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correspondientes a los quepresentan un máximo de precipitación prácticamente no tienen antígeno ni anticuerpos,en tanto, en los precedentes puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto,la presencia de antígenos.Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antígenoagregado y en el eje de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva,generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres regiones.La reacción de precipitación en medio semisólido, se efectúa en un gel y se conoce comoinmunodifusión. Esta consiste en la difusión, a través de un gel, de un antígeno, y suanticuerpo homólogo con la consiguiente aparición de una banda de precipitado en el sitiodonde se alcanzan las concentraciones óptimas de ambos reactivos.La velocidad de la difusión depende de la forma, tamaño y la concentración de lasmoléculas precipitantes, así como de la temperatura a la cual se realice la reacción.Cuando se tienen dos o más tipos de moléculas, éstas se pueden difundir a diferentevelocidad. En el sitio donde se localicen zonas de concentración óptima de antígeno y deanticuerpos se formarán bandas de precipitación.Existen diferentes tipos de inmunodifusión; aquel en el que ambos reactivos difundenlibremente en el gel es llamado doble difusión o método de Ouchterlony, el cual puedetener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinación de la posible relacióninmunológica entre dos antígenos y del número de sistemas antígeno-anticuerpopresentes, así como la semicuantificación de un antígeno o de un anticuerpo.Otra variante en la que sólo uno de los reactivos (generalmente el antígeno) difunde en elgel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce comoimunodifusión simple. En la imunodifusión radial se aplica este principio para determinarcuantitativamente la concentración del antígeno, éste se encuentra en una concentracióninicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la
  15. 15. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 15 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADAconcentración disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos están en proporcionesóptimas, se forma un halo de precipitación cuyo diámetro tiene relación directa a laconcentración del antígeno.La técnica de imunoelectroforésis fue propuesta por Grabar y Williams quienescombinaron las técnicas de electroforesis y de inmunodifusión para separar y determinarla presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antigénicas.Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicación de unacorriente eléctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos específicos,con los que se realiza la precipitación. Esta prueba es ampliamente utilizada paradeterminar la pureza de sustancias antigénicas.En la contra–inmunoelectroforesis, los antígenos y sus anticuerpos simultáneamente sesometen a la acción de un campo eléctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones,los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarán bajo el efecto de lacorriente eléctrica, sin embargo, se mueven hacia el cátodo debido al flujo endosmóticodel regulador usado.Los antígenos que poseen carga negativa migran hacia el ánodo y mediante ladisposición apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antígeno y elanticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitación en pocotiempo, dependiendo de la concentración y de la velocidad de migración de los reactivos.Obviamente, este método no es aplicable a antígenos con carga positiva o neutra.2. OBJETIVOS.2.1. OBJETIVO GENERAL. Evidenciar la reacción de precipitación que se lleva a cabo cuando hay interacciónentre antígeno soluble con anticuerpo homólogo.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS2.2.1 Desarrollar la técnica de precipitación en capilar para la cuantificación de losanticuerpos presente en un antisuero específico.2.2.2 Valorar la reacción de precipitación3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1Material por equipo.- 11 tubos capilares de 100 mm de largo y de 1.6 a 1.8 mm de diámetro.- 8 tubos de ensaye de 13 x 100mm.- 8 pipetas de 1.0 ml.- 1 gradilla de plastilina.- Papel absorbente.3.2 Reactivos- 5 ml. de solución salina isotónica.- 1.0 ml. de solución de antígeno que se desea probar.- 1.0 ml. del antisuero correspondiente.- Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunización.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1. PRECIPITACION EN CAPILAR.
  16. 16. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 16 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA 1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de 0.5 mL y 1 mL 2. En 7 tubos de ensaye de 13 x100 mm debidamente rotulados, se hacen diluciones seriadas de la solución de antígeno: a) Se colocan 0.5 ml de solución salina en cada uno de los tubos de ensaye. b) Al tubo 1 se le agrega 0.5 ml de la solución del Ag, se mezclan bien con la misma pipeta (dilución 1: 2). c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml del tubo 1 y se pasan al tubo 2, se mezclan bien con la misma pipeta (dilución 1: 4) d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (dilución 1:8 a 1:128). 3. Se toma un tubo capilar y por capilaridad se absorbe un volumen tal de antisuero que llegue hasta la primera marca. La parte externa del capilar se limpia con papel absorbente (papel filtro grueso). 4. El tubo capilar se gira ligeramente y se hace descender el volumen de antisuero hasta el otro borde. 5. Por el extremo en el que se encuentra el antisuero en seguida se absorbe la cantidad necesaria de antígeno sin diluir (dilución 1:1), de tal modo que el volumen total llegue hasta la siguiente marca del tubo. Se limpia la parte externa con papel absorbente. 6. Es necesario realizar dicha operación con sumo cuidado, evitando que el antisuero se salga del capilar y contamine el antígeno. 7. Con el dedo índice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el contenido quede centrado en el capilar. 8. Un extremo se introduce en una barra de plastilina. 9. Se repite el procedimiento señalado en los incisos de 3 al 8 usando cada una de las diluciones del antígeno (de 1:2 a 1:128). 10. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antígeno sin diluir y otro, en la misma forma, únicamente con antisuero. El primero es el testigo del antígeno y el segundo es el del anticuerpo. 11. Se dejar reposar y al término de la práctica a temperatura ambiente, si no hay reacción aparente se guardan en el refrigerador y observar a las 12 y 24 horas. 12. Se mide la cantidad de precipitado en milímetros.4.2 PRECIPITACION EN CAPILAR. Observe cuidadosamente la serie de tubos capilares y mida la altura de la columnade material precipitado en aquellos en que se encuentre. Con estos datos complete unatabla que contengan los siguientes datos: Numero de tubo, factor de dilución,concentración del antígeno y altura de la columna.Numero de Capilar Dilución del antígeno Concentración del Precipitación en mm antígeno 1 1:1 2 1:4 3 1:16 4 1:645. CUESTIONARIO • Que metodologías actuales se pueden aplicar para medir la reacción antígeno- anticuerpo.
  17. 17. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 17 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA • Desarrolle un esquema para cuantificar la reacción antígeno anticuerpo en el laboratorio. • Qué sugerencias tiene para optimizar la práctica. • A nivel comercial que pruebas biológicas-clínicas se utilizan en la reacción Ag-Ac? 6. REFERENCIAS.7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología. Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.7.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (2). Departamento de Inmunología. Escuela Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.7.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma growth in Freund´s adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193.
  18. 18. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 18 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA 4 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD1. INTRODUCCIÓN El método de Bradford, (1976) involucra la unión del azul brillante de CoomassieG-250 a la proteína. Esta unión provoca un cambio en el máximo de absorción de 465 a595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unión es independientede la composición de aminoácidos de las proteínas.2. OBJETIVO2.1 OBJETIVO GENERAL Determinar de manera cuantitativa el anticuerpo producido, para realizar lainmunodetección en medio sólido “western blot”2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Cuantificar el anticuerpo producido por la técnica de Bradford Determinar la variación de las muestras3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1 Material por equipo.- Espectrofotometro- celdas de cuarzo para leer- tubos tipo ependorff- 1 gradilla- Micropipetas- Puntas3.2 Reactivos- Reactivo de Bradford- Suero del conejo obtenido después el esquema de inmunización.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. Se determina la concentración de proteínas, por medio de una curva tipo con BSAy el reactivo de Bradford, como se indica abajo:(BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25µg/mL (mL)Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0(mL)Reactivo de 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75Bradford (mL)
  19. 19. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 19 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADAConcentración 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200de BSA µg/mL)Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Después de 5 min de agregado elreactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un “blancode reactivos” (el que no contiene proteína) y se calcula la ecuación de la recta.La cantidad de proteína contenida en la muestra se determina interpolando el dato deabsorbencia en la curva tipo elaborada con la albúmina de suero de bovino a diferentesconcentraciones. Se utiliza la ecuación obtenida de la curva tipoANEXOSPreparación del reactivo de Bradford: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 sedisuelven en 50mL de etanol al 95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácidofosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen final de 1litro. Lasconcentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanoly 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS • Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976. • Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
  20. 20. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 20 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA PRÁCTICA 5 DETERMINACIÓN DE REACCIÓN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA1. INTRODUCCIÓNLa técnica de inmunoelectrotransferencia (IET), descrita por Towbin et al en 1979, es unode los métodos más útiles con que se cuenta para el análisis antigénico (Peferoen et al,1982). Esta metodología combina el poder resolutivo de la electroforesis en geles depoliacrilamida (PAGE), en presencia o en ausencia de detergentes como el docecil sulfatode sodio (SDS), con las reacciones inmunoenzimáticas en fase sólida. Las proteínasseparadas por pesos moleculares son electrotransferidas a membrana de nitrocelulosa(NC) o de Nylon, en donde se unen a los grupos reactivos de éstas, quedandoinmovilizadas y expuestas en la superficie para reaccionar con los anticuerposcorrespondientes. El patrón que se obtiene sobre el papel de NC es una copia del patrónde separación obtenido en el gel. Posteriormente de bloquean los sitios reactivos delpapel de NC que quedan libres, con alguna proteína que no interfiera y a continuación sehace reaccionar con los anticuerpos problema, los cuales podrán unirse a sus antígenoscorrespondientes inmovilizados en el papel (Brunete, 1981). La siguiente reacción que seefectúa corresponde a la primera interacción antígeno-anticuerpo, que se pone demanifiesto al agregar un segundo anticuerpo unido a una enzima como peroxidasa u otroconjugado como proteína A de Staphyloccocus aureus igualmente marcada.En el ensayo enzimático se agrega el sustrato y un cromógeno que precipiten in situ parahacer visible la reacción. Se puede identificar la clase de respuesta inmunológica delhuésped (IgM, IgG, IgA, IgE), usando el conjugado correspondiente.2. OBJETIVOS2.1 OBJETIVO GENERAL.Cuantificar el anticuerpo producido, para realizar la inmunodetección en medio sólido“western blot”2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS2.2.1 Determinar la presencia del antígeno por medio de la técnica deelectrotransferencia.2.2.2 Realizar la transferencia y detección por unión especifica.2.2.3. Corroborar que el esquema de inmunización se llevo de la manera adecuada3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1. Material por equipo. Cámara de electrotransferencia Fuente de Poder Papel filtro Whatman 3mm Papel de Nitrocelulosa Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamaño del gel de porteinas (SDS-PAGE). Vasos de precipitado
  21. 21. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 21 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA Micropipetas Matraces aforados Matraces erlenmeyer3.2. Reactivos Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Amortiguador del gel separador pH 8.8 Amortiguador del gel separador pH 6.8 Amortiguador de corrida 5X / SDS Amortiguador de muestra pH 6.8 Persulfato de amonio al 10% Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL Sol. teñidora Sol. desteñidora Amortiguador de electrotransferencia [25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% (v/v) metanol, 0.01% (w/v) SDS, pH 8.3]. Solución salina de fosfatos 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.2 (PBS) Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20,, 0.05%) Rojo de Ponceau [0.2% en ácido tricloroacético 3%] Solución de bloqueo Solución cromógeno /sustrato4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1 Tratamiento de las muestras5. A la muestra de proteína con concentración conocida se lleva a un volumen de 85 Lcon amortiguador de muestra. Adicionar con 10 L de la sol. de azul de bromofenol y 5 µLde β-mercaptoetanol.6. Poner a ebullición durante 5 minutos y enfriar.4.2 Procedimiento para el gel de SDS-PAGE7. Limpiar con etanol al 70% las placas de vidrio.8. Colocar el juego de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el gel.9. Preparar el gel separador con forme a la Tabla 1, considerando que al final se adicionael TEMED y Persulfato de amonio para vaciar en la cámara de electroforesis. Vaciar el gelseparador evitando la formación de burbujas hasta dejar un espacio de 3 cm a partir delborde superior de los vidrios (Tabla 1).Tabla 1.Gel separador para 15 mLSol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
  22. 22. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 22 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADATEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.0110. Dejar polimerizar de 20-30 minutos11. Preparar el gel concentrador como lo índica la Tabla 2, vaciar en la parte superior delgel.Tabla 2. Gel concentrador para 2 mLSol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26 mLAmortiguador pH 6.8 0.5 mLAgua desionizada 1.22 mLPersulfato de amonio 0.01 mLTEMED 0.002 mL 3. Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min. 4. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular. 5. Montar las placas de vidrio en su base y ésta en la cámara de electrofóresis. 6. Preparar el amortiguador de corrida al 1X. 7. Llenar la cámara interna con amortiguador de corrida hasta el límite y la parte externa hasta cubrir los electrodos. 8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular. 9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder. 10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador, posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del gel. 11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede utilizar hasta 3 veces) 12. Desmontar la cámara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente adecuado y teñirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitación orbital durante 1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteñidora hasta desteñir bien el gel. Una vez obtenido el gel SDS-PAGE, se sumerge en amortiguador de transferencia.4.3 Preparación de la cámara y transferencia.1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente consuficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir.2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamaño del gel (utilizandoguantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia.3.- Colocar dos fibras Scoth en un “cassette” para electrotransferencia, sobre las cualesse colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujasatrapadas entre los papeles; después colocar el gel y sobre este la membrana de NC;eliminar las burbujas.4.- Con un lápiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y señalarel número de carril de acuerdo a la colocación de las muestras, colocar otros dos papelesfiltros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el “cassette” e insertarlo en el contenedor.5.- Colocar el contenedor en la cámara y llenarla con el amortiguador de transferencia,tapar y conectar los electrodos de tal manera que el ánodo (-) quede del lado del gel y el
  23. 23. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 23 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADAcátodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a100 V, cuidando de que la temperatura del líquido no se eleve a más de 60° C.6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en unrecipiente con solución para teñir (durante 20 minutos)7.- Observar en la membrana si se distinguen las proteínas que fueros transferidas, lavarcon agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan adistinguir las bandas teñir otros 20 min.4.4 Reacción inmunoenzimática1.- Colocar la membrana de NC en un recipiente que contenga 30-50 mL del amortiguadorde bloqueo e incubar 2 h a temperatura ambiente en agitación continua.2.- Eliminar el exceso de solución de bloqueo por decantación y hacer 3 lavados con PBS-Tween de 5 min. Cada uno con agitación continúa.3.- Incubar la membrana con el suero o anticuerpo de interés a las diluciones establecidascon anterioridad.4.- Eliminar el exceso y lavar come en el paso 2.5.- Posteriormente se agrega el conjugado correspondiente en la dilución apropiada conPBS-Tween. Se incuba durante 2 h a temperatura ambiente con agitación continua.6.- Se repite el paso 4.7.- Por último se agrega la solución cromógeno/sustrato para dot-ELISA einmunoelectrotransferencia y se espera hasta que aparezcan las bandas; después seenjuaga con agua desionizada y se deja secar.ANEXOSSOLUCIONES PARA GEL SDS-PAGEAcrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8g de bis-acrilamida. Disolver en aguabidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°C. Usar guantes al pesar ya que la archilamida es un compuesto neurotóxico.Amortiguador del gel separador pH 8.8Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustarel pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.Amortiguador del gel separador pH 6.8Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.Amortiguador de corrida 5X / SDSPesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de Glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizaday aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.Amortiguador de muestra pH 6.8Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada yajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar elvolumen a 100 mL.Persulfato de amonio al 10%
  24. 24. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 24 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADASe prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mLPesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardaren refrigeración.Sol. teñidoraPara preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL deagua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en elmetanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.Sol. desteñidoraPara preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL deagua desionizada.SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIAAmortiguador de transferencia(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2My agregar 14.49 g de glicina, añadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con aguabidestilada. Guardar a 4ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de lacalidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usarhasta 3 veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PBse prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfatode sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L conagua desionizada.Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.Solución de bloqueo.Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.Guardar a -20° C.Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 mlcon agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ambar.Solución cromógeno / sustratoPesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS,agregar 25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se preparainmediatamente antes de usarla.5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
  25. 25. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 25 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual deInmunología clinica, segunda edición, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 50-60.2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc NatlSci USA, 1979, 76:4350.3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficienttransfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.FEBS Lett. 1982, 145:369.

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