Vie biomolecolari dell’apoptosi

1,492 views

Published on

Apoptosis pathways, heat shock proteins, caspase dipendente apoptosis, caspase indipendent apoptosis, anoikisis.

Published in: Health & Medicine
0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
1,492
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
13
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Vie biomolecolari dell’apoptosi

  1. 1. VIE BIOMOLECOLARI DELL’APOPTOSI Le Heat Shock Proteins Acquisizioni di biologia molecolare ed eventuali applicazioni in terapia medica. 26 Settembre 2005 Patologia Clinica Dott. Stefano Mancini
  2. 2. Le fasi dell’apoptosi I. INDUZIONE Include diversi meccanismi: -recettori di superficie -via mitocondriale; -altre vie (es. ER). II. PREPARAZIONE Comprende l’attivazione di iniziatori del processo quali le caspasi iniziatrici ed altre chinasi/fosfatasi. III. ESECUZIONE Detta anche “fase di morte”, coinvolge prevalentemente le caspasi effetrici.
  3. 3. Le fasi dell’apoptosi  Signaling phase Death receptors: TNF-alfa, Fas(Apo1/CD95), FADD. Physiological inducers: ROS, Ca++, JNK/SAPK activation. Protease activators: granzymes, calpains, cathepsins, proteasome.  Preparation phase Initiator caspase: caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-12. Physiological inducers: Bax, ROS, MMPT, cytochrome c, apoptosome. Nucleases: AIF, endonuclease G, PARP.  Execution phase Effector caspase: caspase-3, caspase-6, caspase-7. Physiological changes: membrane blebbing, apoptotic body formation, DNA fragmentation.
  4. 4. Esistono diverse vie per l’apoptosi  Apoptosi caspasi-dipendente  Apoptosi caspasi-indipendente  Anoikisi Le HSP possono intervenire in tutte queste vie ostacolando o facilitando l’apoptosi.
  5. 5. Diagram showing the role of heat-shock proteins and a chaperonin in protein folding. As the ribosome moves along the molecule of messenger RNA, a chain of amino acids is built up to form a new protein molecule. The chain is protected against unwanted interactions with other cytoplasmic molecules by heat-shock proteins and a chaperonin molecule until it has successfully completed its folding.
  6. 6. Classi di HSP nei mammiferi 5 maggiori famiglie di HSP coinvolte nella risposta a stress cellulari: -HSP 27 -HSP 60 -HSP 70 -HSP 90 -HSP 104
  7. 7. Regolazione La sintesi è finemente regolata a livello trascrizionale da Heat Shock Factors (HSF). HSF 1 fa parte dei principali regolatori.
  8. 8. HSF-1 In forma monomerica nelle cellule quiescenti, è legato da HSP-90 e -70. Sotto stress le HSP si separano da HSF-1 il quale migra nel nucleo come trimero. Si lega così al DNA nella sequenza consenso in modo da avviare la sintesi di HSP.
  9. 9. Apoptosi caspasi-dipendente  Siti dei segnali di induzione Membrana citoplasmatica Citosol Nucleo Mitocondri Reticolo endoplasmatico  Effettori Caspasi Nucleasi Transglutaminasi
  10. 10. Apoptosi caspasi-dipendente  Membrana citoplasmatica L’espressione di HSP-70 inibisce l’apoptosi Fasmediata. Tuttavia l’iperespressione di HSP-70 non protegge le cellule Jurkat dall’apoptosi.
  11. 11. Apoptosi caspasi-dipendente  Membrana citoplasmatica L’inibizione di HSP-90 attraverso oligonucleotidi antisenso favorisce l’apoptosi in cellule di neuroblastoma sottoposte a stress termico. Ciò favorisce inoltre l’attivazione del death domain, facilitando così la morte cellulare programmata.
  12. 12. Apoptosi caspasi-dipendente  Membrana citoplasmatica Diverse HSP (es. HSP-70) migrano sulla superficie cellulare quando il processo apoptotico è già avviato. Questo rende le cellule più facilmente riconoscibili dai fagociti.
  13. 13. Apoptosi caspasi-dipendente  Citosol Le HSP di basso PM (es. HSP-27) sono fosforilate in vivo dalla MAPKAP chinasi-2, la quale è a sua volta attivata da una fosforilazione mediata dalla p38 chinasi. HSP-27 fosforilata è capace di interagire con Daxx, una proteina contenente un death domain. Il legame con Daxx previene l’attivazione di Ask-1, una serina/treonina chinasi capace di indurre apoptosi attraverso la via mediata da Fas.
  14. 14. Apoptosi caspasi-dipendente  Citosol HSP-72 è un inibitore diretto di Ask-1, favorendo la sopravvivenza della cellula in seguito a stress ossidativo. L’espressione di HSP-72 induce inoltre inibizione di JNK (c-Jun N-terminal kinase, famiglia delle protein-chinasi indotte da stress).
  15. 15. Apoptosi caspasi-dipendente  Citosol HSP-105a è capace di legare JNK, provocando inibizione della apoptosi in linee cellulari PC12 sottoposte a diversi stressor ambientali. Tuttavia, l’espressione di HSP-105a favorisce l’apoptosi mediata da danno ossidativo in cellule di embrione di topo.
  16. 16. Apoptosi caspasi-dipendente  Citosol HSP-90 è capace di modulare Raf1. Se Raf1 è legato a HSP-90 è incapace di avviare l’apoptosi. Viceversa, la dissociazione del complesso HSP90/Raf1 avvia la morte cellulare programmata in mastociti e in linfociti-B.
  17. 17. Apoptosi caspasi-dipendente  Nucleo Le HSP giocano un ruolo fondamentale nel prevenire l’apoptosi prodotta da lesioni nucleari. HSP-27 e -70 migrano nel nucleo a seguito di stress ossidativo. HSP-72 compare nel nucleo di cellule alveolari umane L-132 a seguito di danni al DNA prodotti da acido dimetilarsenico.
  18. 18. Apoptosi caspasi-dipendente  Nucleo HSP-90 interagisce direttamente con la telomerasi stimolandone l’attività. Si è visto che HSP-90 può facilitare la sopravvivenza cellulare nel carcinoma della prostata.
  19. 19. Apoptosi caspasi-dipendente  Mitocondri Possiedono un ruolo centrale nello svolgimento del processo apoptotico. Molti segnali proapoptotici convergono nella permeabilizzazione della membrana esterna. Ciò provoca la traslocazione e multimerizzazione della proteina Bax (B-cell lymphoma-2 protein associated X protein) all’interno del mitocondrio.
  20. 20. Apoptosi caspasi-dipendente  Mitocondri Bax a sua volta induce la permeabilizzazione della membrana interna. Altri fattori: -Smac/DIABLO (second mitocondriaderived activator of caspases), è capace di inibire IAP; -IAP (inhibitors of apoptosis protein), ad es. XIAP, c-IAP1 e c-IAP2; -HtrA2/Omi, inibisce IAP.
  21. 21. Apoptosi caspasi-dipendente  Mitocondri HSP-27 lega il citocromo-c prevenendo l’interazione citocromo-c-mediata tra Apaf-1 e procaspasi 9, interferendo quindi con l’apoptosi. Studi successivi hanno dimostrato la localizzazione di HSP-27 nel mitocondrio a trattenere il citocromo-c. HSP-27 inibisce anche il rilascio di Smac/DIABLO ed è in grado di legare alcuni RNA inibitori dell’apoptosi al fine di impedirne la degragdazione.
  22. 22. Apoptosi caspasi-dipendente  Mitocondri HSP-60 e la sua co-chaperone HSP-10 sono capaci di legare la procaspasi-3 a livello mitocondriale. Viceversa, HSP-60 citoplasmatica sembra sequestrare alcuni fattori proapoptotici quali Bax o Bak. HSP-70 sopprime l’apoptosi direttamente associandosi ad Apaf-1 e impedendo il normale assemblaggio dell’apoptosoma.
  23. 23. Apoptosi caspasi-dipendente  Mitocondri Al contrario HSP-105a, un omologo di HSP-70, favorisce l’apoptosi inducendo il rilascio del citocromo-c, l’attivazione della caspasi-3 e la dissociazione della PARP (poly-ADP ribose polymerase) in cellule embrionali di topo. HSP-90 lega direttamente Apaf-1 e previene la formazione dell’apoptosoma.
  24. 24. Apoptosi caspasi-dipendente  Reticolo endoplasmatico (RE) Interviene nell’apoptosi in almeno due modalità: -in risposta a proteine alterate; -con alterazioni della permeabilità al Ca++. Recenti studi suggeriscono il coinvolgimento delle proteasi del RE, come le caspasi 7 e 12. La risposta ad alterazioni proteiche induce inoltre il fattore di trascrizione CHOP/GADD153 il quale promuove l’apoptosi.
  25. 25. Apoptosi caspasi-dipendente  Reticolo endoplasmatico (RE) Grp78, appartenente alle HSP-70, sembra inibire direttamente l’apoptosi RE mediata attraverso il legame delle caspasi 7 e 12. Grp78 è stata anche associata all’attivazione del fattore NF-kB e all’inibizione dei disturbi del flusso del Ca++.
  26. 26. Apoptosi caspasi-indipendente Prevede l’entrata in gioco di mediatori che agiscono in parallelo all’attivazione delle caspasi. E’ ovvio che le vie possono talora convergere. Sono interessati i seguenti fattori: -granzimi; -catepsine; -calpaine; -ceramide; -AIF (apoptosis-inducing factors).
  27. 27. Apoptosi caspasi-indipendente  Granzimi Famiglia di serin-proteasi spesso associati alle perforine nei linfociti T attivati e nelle cellule NK. Granzima B è fra i più rappresentati nell’uomo. In vivo amplificano le vie apoptotiche caspasidipendenti, ma possono anche indurre l’attivazione della proteina Bid senza coinvolgere il reclutamento delle caspasi. Bid produce alterazioni della membrana mitocondriale e il rilascio del citocromo-c.
  28. 28. The Granzymes are serine protease family members structurally related to Chymotrypsin and exhibit the characteristic catalytic triad His-Asp-Ser at the active site.76 They are key components of the lytic granule, and are responsible for initiating many of the apoptosis-associated events that occur in cells targeted for destruction by cytotoxic cells.
  29. 29. Apoptosi caspasi-indipendente  Granzimi Ancora poco chiare sono le interazioni con le HSP. HSP-70 espresso a livello di membrana interviene nell’apoptosi di cellule tumorali attraverso il legame e trasporto del granzima B.
  30. 30. Apoptosi caspasi-indipendente  Catepsine Classe di enzimi proteolitici contenenti vari tipi di proteasi: cistin-proteasi (catepsine B,C,L,H,S e O), aspartato proteasi (catepsine D,E e F) e serinproteasi (catepsina G). Hanno origine nei lisosomi. La catepsina B è rilasciata dai lisosomi di epatociti trattati con TNF-alfa o nell’apoptosi indotta da p53. La sua attivazione viene prevenuta da NF-kB.
  31. 31. Apoptosi caspasi-indipendente  Catepsine Relazione con le HSP ancora da approfondire. HSP-73 e HSP-90 si accumulano in lisosomi di cellule epiteliali tubulari di rene di topi trattati con alte dosi di gentamicina.
  32. 32. Apoptosi caspasi-indipendente  Calpaine Proteasi calcio-dipendenti implicate nell’organizzazione del citoscheletro e nella degradazione preoteica. Esistono come eterodimeri formati da una piccola subunità regolatrice e una delle tre grandi subunità catalitiche: calpaina-1, -2 e -3. Agiscono spesso in sinergia con le caspasi, soprattutto nel neurone.
  33. 33. Apoptosi caspasi-indipendente  Calpaine In diversi tumori (mammario e ovarico) così come nell’apoptosi cisplatino-mediata del melanoma le calpaine hanno un ruolo chiave. Le calpaine attivano infatti Bid indipendentemente dalla attivazione delle caspasi. Grp-94 sembra inibire l’apoptosi mediata dalle Calpaine in diverse situazioni quali stress da ipossia/riossigenazione e apoptosi etoposidemediata. Il cisplatino può legare Grp-94 inibendolo.
  34. 34. Apoptosi caspasi-indipendente  Ceramide Mediatore lipidico formato da sfingosina Nacetilata capace di indurre l’apoptosi attraverso varie strade: -caspasi dipendenti: attivazione caspasi-9 e -3; -catepsine dipendenti; -calpaine dipendenti. L’apoptosi ceramide mediata può essere inibita da Bcl-2. HSP-70 protegge la cellula dall’apoptosi indotta da ceramide.
  35. 35. Ceramide leads to loss of mitochondrial transmembrane potential (DYm). Translocation of Bax to mitochondria, activation of Bax and release of cytochrome c are all late events in this form of apoptosis. Loss of DYm is illustrated as the thin black lines surrounding the mitochondria.
  36. 36. Apoptosi caspasi-indipendente  AIF-Apoptosis Inducing Factors Mediatori di recente identificazione, traslocano dai mitocondri al citosol e al nucleo. AIF nucleari inducono la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA. Bcl-2, Hsp-70 e Hsc-70 inibisce la migrazione di AIF al nucleo. La deplezione di Hsp-70 attraverso oligonucletidi antisenso sensibilizza le cellule all’apoptosi AIF mediata.
  37. 37. Anoikisi “Senza casa”: apoptosi indotta dalla mancanza di segnali intercellulari e/o di connessioni con la matrice extracellulare. Predominante è la via Fas-mediata che conduce quindi all’apoptosi caspasi-dipendente. Tuttavia presenta anche altre vie di induzione.
  38. 38. Anoikisi Vie “alternative”: -reclutamento diretto della caspasi-8 da recettori per le integrine; -FADD (Fas-associated death domain protein) può essere attivato da alterazioni del citoscheletro che inducono il rilascio di “recettori di morte” (death receptors) che si trovavano in uno stato di sequestro. HSP-27 fosforilato, HSP-70 e -90 stabilizzano le integrine nei trombociti.
  39. 39. Anoikisi HSP-27 fosforilato sembra inibire il potenziale metastatico del melanoma mentre HSP-60 attiva un’alfa3beta1-integrina coinvolta nell’adesione di cellule metastatiche di ca. mammario a linfonodi e osteoblasti. BAG, una co-chaperone di HSP-70/HSC-70, lega e sequestra FADD, inibendo così l’anoikisi. Molti tumori metatstatici sembrano avere alta espressione di BAG.
  40. 40. Considerazioni finali Il processo apoptotico è finemente regolato e le HSP svolgono un ruolo fondamentale nella sua evoluzione, talvolta favorendo altre volte ostacolando l’apoptosi. La biologia molecolare sta mettendo in luce come sia fondamentale capire nel dettaglio i passaggi che conducono alla morte o alla sopravvivenza di una cellula al fine di poter sperimentare nuove strategie terapeutiche. Le HSP si propongono come un possibile importante bersaglio visto il loro ruolo chiave nei processi cellulari.
  41. 41. Alcuni esempi HSP-27 aumenta la ‘aggressività di cellule di ca. colico mentre HSP-70 è altamente espresso in tumori della mammella nella donna. HSP-90 è implicato nella aggressività del ca. prostatico. Le HSP vengono espresse da molte cellule tumorali a livello di membrana e possono agire da adiuvanti del sistema immunitario aspecifico.

×