CAPÍTULO 2.9.9.                                    SALMONELOSIS*                                                RESUMEN   ...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis          aislamientos a un laboratorio de referencia para confirmar por completo la identida...
Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisTambién se dan cambios de forma regular en la clasificación de los serotipos a medida que se ...
Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisEn muchos países se han llevado a cabo programas nacionales para controlar las infecciones an...
Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisOtro elemento esencial en la profilaxis de la salmonelosis humana es la educación del consumi...
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Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis     Substrato del enzima: Se disuelve una tableta de p-nitrofenil fosfato disódico (5 mg) en...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis     ii)    Inocuidad            Se debe determinar en ratones la LD50 (dosis letal 50%) o la...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis4.   Control de lotesa)   Esterilidad     Las pruebas para esterilidad y ausencia de contamin...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis     anticuerpos séricos son solamente una parte de los mecanismos de protección del hospedad...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis13. FELD N.C., EKEROTH L., GRADEL K.O., KABELL S. & MADSEN M. (2000). Evaluaton of a serologi...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis30. MALORNY B., HOORFAR J., BUNGE C. & HELMUTH R. (2003). Multicenter validation of the analy...
Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis50. SHELOBOLINA E.S., SULLIVAN S.A., O’NEILL K.R., NEVIN K.P. & LOVLEY D.R. (2004). Isolation...
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2.09.09. salmonelosis

  1. 1. CAPÍTULO 2.9.9. SALMONELOSIS* RESUMEN La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella está muy distribuida en el ambiente y se encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminación fecal. En el hombre, los microorganismos del género Salmonella son agentes etiológicos de infecciones intestinales y sistémicas, por lo general, como contaminantes secundarios de los alimentos, de origen animal y ambiental o, frecuentemente, como consecuencia de la infección subclínica en animales de abasto que provoca la contaminación de la carne, los huevos y la leche o la contaminación secundaria de frutas y verduras que se han fertilizado o regado con desechos orgánicos. La salmonelosis humana es una de las enfermedades zoonósicas más frecuentes y de mayor impacto económico causadas por estos microorganismos. Los agentes de Salmonella se pueden encontrar también en los alimentos y originando el transporte gastrointestinal asintomático o enfermedades infecciosas en los animales, particularmente en aves y en cerdos. En todos los países existe la salmonelosis, pero parece tener una mayor prevalencia en áreas de producción animal intensiva, especialmente de cerdos, de terneros y de algunos tipos de aves criadas en cautividad (con frecuencia, los reptiles son portadores asintomáticos de Salmonella). Varios serotipos son específicos del hospedador (ej. S. Abortusovis en ovejas o S. Typhi en humanos) o adaptados al hospedador (como por ejemplo S. Choleraesuis y S. Dublin). La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos; los más susceptibles son los animales jóvenes, en estado de gestación, o lactantes. La manifestación más común de la enfermedad es la entérica, pero se puede observar un espectro muy amplio de síntomas clínicos que incluye septicemia aguda, aborto, artritis y enfermedad respiratoria. Muchos animales, en especial los cerdos y las aves, pueden estar infectados sin manifestar la enfermedad clínica. Tales animales pueden ser importantes en la difusión de la enfermedad entre explotaciones y como fuentes de contaminación alimentaria y de infección humana. La tifosis aviar y la pullorosis, que son otras enfermedades aviares causadas por Salmonella, se presentan en el capítulo 2.3.11. de este Manual. Identificación del agente: El diagnóstico se basa en el aislamiento del microorganismo a partir de tejidos recogidos asépticamente en necropsias o de las heces, de frotis rectales o muestras ambientales, de productos alimenticios o de pienso; se puede diagnosticar también serológicamente la infección anterior o actual de animales por algunos serotipos. Cuando aparece infección en los órganos reproductores, en el embrión o en caso de aborto, es necesario cultivar el contenido del estómago fetal, de los frotis placentarios y vaginales y, en el caso de las aves, de los huevos embrionados. Salmonella puede aislarse utilizando varias técnicas, una de las cuales es un pre-enriquecimiento para recuperarlas con daño subletal, medios de enriquecimiento que contienen sustancias inhibidoras para evitar microorganismos competidores, y medios sólidos selectivos en placa para diferenciar Salmonella de otras enterobacterias. Para obtener una confirmación definitiva de la cepa aislada, se pueden aplicar varias pruebas bioquímicas, serológicas y moleculares a los cultivos puros. Salmonela posee antígenos llamados somáticos (O), flagelares (H) y de virulencia (Vi), que pueden identificarse mediante sueros específicos de tipo, y después puede determinarse el serotipo por referencia a la fórmula antigénica del esquema de Kauffman–White. Muchos laboratorios necesitan enviar losManual de la OIE sobre animales terrestres 2008 1
  2. 2. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis aislamientos a un laboratorio de referencia para confirmar por completo la identidad serológica y determinar, cuando sea posible, el fagotipo y el genotipo de la cepa. Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas deben realizarse en una muestra de la población que sea estadísticamente significativa, pero estas pruebas poseen un valor limitado si se utiliza la vacunación. En el diagnóstico rápido de S. Pullorum/Gallinarum en aves de granjas avícolas se utiliza la prueba de sangre completa, que es una prueba diagnóstica relativamente fiable en determinadas circunstancias. En el laboratorio, el método preferido para la exportación y el diagnóstico de muestras de todos los animales de granja es la prueba de aglutinación en tubo. Existen enzimoinmunoensayos para algunos serotipos, y pueden utilizarse para el diagnóstico serológico y el control, especialmente, en el caso de aves y cerdos. La vacunación puede comprometer el valor diagnóstico de las pruebas serológicas. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Contra la salmonelosis se utilizan muchas vacunas inactivadas y hay comercializadas algunas vacunas vivas. Debido a la baja eficacia de las vacunas inactivadas, se utilizan adyuvantes con aceite o hidróxido de aluminio para mejorar sus propiedades inmunógenas. A menudo se carece de datos sobre la eficacia en condiciones de campo, aunque las pruebas de laboratorio pueden servir como indicadoras. Las pruebas de inocuidad se realizan en animales de laboratorio y, en el caso de las vacunas inactivadas, se llevan a cabo pruebas de esterilidad con medios bacteriológicos de enriquecimiento. Para las vacunas producidas por manipulación genética se necesita más seguridad, por ejemplo en lo que respecta al impacto ambiental y a la estabilidad. Para reducir las infecciones por Salmonella en las aves y otras especies animales se puede emplear la exclusión competitiva. A. INTRODUCCIÓNDe acuerdo con la actual nomenclatura, que refleja avances recientes en la taxonomía (42), el género Salmonellaincluye solo dos especies importantes: S. enterica y S. bongori. Se ha propuesto también una supuesta terceraespecie, S. subterranea, tras el aislamiento de una única cepa ambiental poco usual (24, 27, 50, 54). Salmonellaenterica se divide en seis subespecies, que se distinguen por algunas características bioquímicas, y algunas deellas se corresponden con subgéneros anteriores. Estas subespecies son: Subgéneros originales Nomenclatura Actual • Subespecie I = subespecie enterica • Subespecie II = subespecie salamae • Subespecie IIIa = subespecie arizonae • Subespecie IIIb = subespecie diarizonae • Subespecie IV = subespecie houtenae • Subespecie VI = subespecie indicaEl símbolo V se reserva para los serotipos de S. bongori a fin de evitar confusiones con el nombre de serotipo deS. enterica subesp. enterica. Las cepas de Salmonella se clasifican en serotipos según la gran diversidad de losantígenos (O) del lipopolisacárido (LPS) y de los antígenos proteicos de los flagelos (H), de acuerdo con laclasificación de Kauffmann–White; en la actualidad se reconocen aproximadamente 2.500 serotipos (42). Estenúmero está en constante aumento. Los serotipos más comunes que causan infección en humanos y enanimales de abasto pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies tienen mayorprobabilidad de presentarse en animales poiquilotermos (de sangre fría) y en el ambiente, pero a veces se lesasocia con la enfermedad en humanos. Algunos serotipos de las subespecies S. arizonae y S. diarizonae se hanasociado con enfermedades en los pavos y en las ovejas, y otros pueden ser vehiculados por reptiles y anfibiossilvestres o en cautividad.Solo se conservan los nombres para los serotipos de la subespecie enterica. Estos nombres no deben escribirseen cursiva. La primera letra es mayúscula. En la práctica clínica, no es necesario indicar el nombre de lasubespecie, ya que solamente llevan nombre los serotipos de la subespecie enterica; por ejemplo, Typhimurium,London, o Montevideo son serotipos de la subespecie enterica. En la práctica rutinaria, se puede usar el géneroSalmonella seguido del nombre del serotipo (ej. Salmonella Typhimurium). La mayor parte de los serotipos deotras subespecies se designan mediante una fórmula antigénica que incluye la subespecie, designada mediantenúmeros romanos (ej. Salmonella IV 48:q.z51)En este capítulo se siguen las nuevas convenciones establecidas de forma abreviada; es decir, se usaS. Typhimurium en lugar de la nomenclatura más completa S. enterica, subesp. enterica serotipo Typhimurium.2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  3. 3. Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisTambién se dan cambios de forma regular en la clasificación de los serotipos a medida que se dispone de nuevaevidencia sobre el parentesco genético, ej. S. Pullorum se clasifica actualmente como S. gallinarum serotipoPullorum (42).La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales causada por microorganismos delas dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales,Salmonella está muy distribuida en el ambiente y se encuentra con frecuencia en vertidos de granjas, en lasaguas residuales humanas y en cualquier material con contaminación fecal. En todos los países existesalmonelosis, pero parece ser más prevalente en áreas de producción animal intensiva, especialmente de aves ycerdos.La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos, siendo más susceptibles los másjóvenes y los animales gestantes. La manifestación clínica más común es la enfermedad entérica, que a menudose presenta como una diarrea sanguinolenta y muy acuosa acompañada de fiebre, pero se puede observar unamplio espectro de síntomas clínicos, como septicemia aguda, aborto, artritis, necrosis de las extremidades yenfermedad respiratoria. Los síntomas y las lesiones no son patognomónicos. Muchos animales, especialmentelas aves y los cerdos, pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clínica (65). Tales animales puedenser importantes en la diseminación de la enfermedad entre explotaciones y ser causa de intoxicación alimentariahumana. En el último caso, esto puede suceder cuando estos animales entran en la cadena alimentaria yoriginan productos alimenticios contaminados (64, 65).El curso de la infección, los síntomas clínicos, los hallazgos post mórtem y los modelos epidemiológicos varíansegún el serotipo y la especie animal implicada. Algunos serotipos solo afectan a determinados hospedadores,por ejemplo S. Gallinarum a aves y S. Cholerasuis a cerdos, aunque la mayor parte pueden causar enfermedaden un amplio rango de especies animales (51). Se ha visto que muchos serotipos (incluyendo los que estánadaptados a hospedadores) tales como S. Coholeraesuis y S. Dublin originan la enfermedad en humanos, y lostrabajadores que asisten a los animales, los veterinarios y los empleados de mataderos, pueden infectarsedirectamente en el trabajo, así como el personal de laboratorio.Normalmente, la enfermedad se describe como salmonelosis, aunque se puede usar el término de fiebreparatifoidea, por ejemplo, la paratifoidea porcina. En la industria avícola, la pulorosis o diarrea blanca bacilar y latifosis aviar designan a menudo las infecciones causadas por S. Pullorum y S. Gallinarum, respectivamente (51).La tifosis aviar y la pulorosis se describen con detalle en el capítulo 2.3.11 del presente Manual.Para las investigaciones epidemiológicas detalladas es necesario identificar las cepas, y tales investigacioneshan descansado tradicionalmente en métodos bioquímicos y serológicos, en la fagotipificación de algunosserotipos y en los antibiogramas. En los últimos años se ha utilizado con éxito el análisis genotípico de losmicroorganismos mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) y ladeterminación molecular de las huellas del ADN. El análisis del perfil de plásmidos es un método rápido yrelativamente fácil para caracterizar cepas, y se ha empleado para estudiar la dispersión de Salmonella tanto enmedicina humana como en veterinaria. Esta técnica presenta limitaciones, pues no todas las cepas deSalmonella presentan plásmidos, y los plásmidos se pueden adquirir con facilidad o ser de un tamaño similarpero genéticamente diferentes. Sin embargo, ese procedimiento ha resultado ser útil para la investigación de losbrotes como complemento de otros métodos. Para suplementar los estudios del perfil de los plásmidos se hanutilizado otras técnicas genéticas alternativas, como la electroforesis en gel de campo pulsante, el AFLP(polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados), VNTR (número variable de repeticiones en tándem),análisis SNP (polimorfismo de nucleótido único) y ribotipificación automatizada (4, 32, 53. 56). La genotipificaciónes un campo de trabajo en expansión y, en los últimos años se han desarrollado muchos métodos nuevos. Debetenerse en cuenta que un único método puede no servir para todos los aislamientos y que puede ser necesarioevaluar diferentes técnicas hasta encontrar un método o combinación de métodos que resulte satisfactorio ycapaz de diferenciar clones de un serotipo o fagotipo particular (45, 55). A menudo las técnicas moleculares sonmás discriminatorias y rápidas y están sustituyendo a los métodos fenotípicos, tales como la serotipificación y latipificación mediante el fago, en las investigaciones epidemiológicas de algunos laboratorios. Sin embargo, estasherramientas moleculares no están disponibles necesariamente en todos los laboratorios o no han sidoestandarizadas para producir resultados replicables en diferentes laboratorios, y es posible que los aislamientostengan que enviarse a un laboratorio de referencia adecuado.Se están elaborando técnicas genéticas como la hibridación en microarrays y la PCR múltiple destinadas aidentificar serotipos específicos y a proporcionar información adicional sobre el contenido genético (18, 19, 44).El aislamiento de Salmonella y su posterior identificación depende no solo de la calidad de la muestra sinotambién del medio de cultivo y de las características de crecimiento del serotipo, particularmente, en aquelloscasos en que están adaptados a una especie hospedadora. Se ha publicado recientemente una revisióncompleta de la infección de animales domésticos por Salmonella (65).Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 3
  4. 4. Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisEn muchos países se han llevado a cabo programas nacionales para controlar las infecciones animales porSalmonella con vistas a proteger al consumidor. En la Unión Europea, la Directiva de Zoonosis 2003/99/ECestablece el control respecto a S. Enteritidis y S. Typhimurium de las explotaciones de más de 250 aves y de lasincubadoras. De acuerdo con la legislación adicional, S. Virchow, S. Infantis y S. Hadar también se someterán acontroles especiales (10). El mismo día de la llegada se realiza el cultivo de los revestimientos de las jaulas dereparto de las aves, de las aves muertas y de algunas al azar. A las 4 semanas de edad y 2 semanas antes de lapuesta de huevos, se cultivan las heces de hasta 60 muestras, dependiendo del tamaño de la explotación.Después, los adultos se muestrean cada 2 semanas. También se llevan a cabo cada 2 semanas, en lasincubadoras donde eclosionan los huevos, se cultiva el meconio y los animales muertos dentro del cascarón,aunque existen planes para sustituir lo anterior por la observación de los revestimietos de los compartimentos dela incubadora en la granja. La UE también está legislando sobre el control de Salmonella en parvadas deasentamientos comerciales, pollos de asar, pavos y cerdos. El análisis serológico está permitido como medidacomplementaria, pero no puede seguir reemplazando al análisis bacteriológico de las aves de corral. EnDinamarca se utiliza el control serológico de Salmonella en explotaciones porcinas y en explotacionescomerciales de aves ponedoras. En otros varios países existen actualmente programas de vigilancia parasacrificar piaras de cerdos utilizando muestras de “jugo de carne” o suero tomado en el matadero.Las infecciones de animales de abasto por Salmonella tienen un papel importante en la salud pública yparticularmente en la seguridad alimentaria, ya que los alimentos de origen animal se consideran como la fuenteprincipal de infecciones por Salmonella en el hombre (64). Se han realizado programas especiales para el controlde aves, cerdos y ganado bovino, que incluyen el control de animales sanos que pueden ser portadoressubclínicos de estos microorganismos. También se controla la contaminación cruzada durante el procesamientode los alimentos, ya que puede ocurrir contaminación por manipuladores de alimentos sanos (65). El pienso contaminado con Salmonella es la fuente más frecuente de infección en animales. Como lacontaminación del pienso se debe a menudo a serotipos de importancia para la salud pública, los piensos, sobretodo la harina de carne y huesos, deben analizarse para investigar la presencia de Salmonella (46).El pienso contaminado con Salmonella ha sido la fuente más común de introducción de nuevas cepas deSalmonella en las redes de producción de ganado, desde las que se disemina por los desplazamientos de losanimales portadores y por otras vías. En muchas situaciones la mayor amenaza puede provenir del comercionacional o internacional de ganado; puede ser que el pienso contenga serotipos “medioambientales” menospatógenos que no causen la enfermedad ni ciclos de infección en animales. Como la contaminación del piensose debe a menudo a serotipos de Salmonella de importancia para la salud pública, debe analizarse el mismopara detectar la presencia de Salmonella (65). Como los piensos se elaboran con mezclas de ingredientes deprocedencia variada, puede encontrase en los mismos una amplia gama de salmonelas “exóticas”. Una vezestablecidas en una instalación, la propagación de unos animales a otros, la contaminación ambiental y lasplagas de la granja se convierten en las principales causas de la continuidad y la propagación de la infección.Las muestras de pienso y de comida analizadas para investigar presencia de Salmonella deben serrepresentativas. Se deben tomar medidas adecuadas para evitar la contaminación durante el transporte o elalmacenamiento (20, 21). Debido a la amplia variedad de alimentos y de productos alimenticios no hay un únicométodo de muestreo que sea apropiado para todos los casos. Por lo tanto, se deben utilizar métodos diferentesque sean específicos para el producto (11, 22).La Organización Mundial de la Salud proporciona información sobre el desarrollo de medidas adecuadas para laprevención y el control de las enfermedades transmitidas por los alimentos, incluyendo las infecciones delhombre por Salmonella. Los vehículos más comunes de infección son los huevos y sus productos derivados, lacarne de pollo y de otros animales, así como los derivados cárnicos. Las cosechas de verduras contaminadas ylas especias también son causa de numerosos brotes. Los serotipos más frecuentes en muchos países europeosson S. Enteritidis y S. Typhimurium (aunque Salmonella es escasa en la producción de ganado, algunos paísesde la UE cuentan con estrictos programas de control), mientras que el serotipo dominante en Norteamérica esS. Typhimurium (64).Una política de control de Salmonella a efectos de la salud pública debe cubrir todas las etapas desde “el establoa la mesa”. Debe incluir la declaración obligatoria de todos los brotes de la enfermedad (13), y el control delpienso y la comida (65). El control de alimentos debe incluir el muestreo de los alimentos compuestos y de otrasmaterias primas no procesadas para alimentación, así como el muestreo durante el procesamiento de la comida.Deben realizarse investigaciones epidemiológicas a nivel mundial para analizar la transmisión de Salmonella ypara apoyar las políticas de control de Salmonella.Son esenciales los controles sanitarios e higiénicos en los mataderos, y se deben tomar precauciones especialesdurante el sacrificio de poblaciones animales potencialmente infectadas. Deben practicarse medidas dedescontaminación durante el procesamiento. Cada vez es mayor la utilización de vacunas para disminuirSalmonella en las aves de corral y es importante diferenciarla de las infecciones de campo para fines de control yasegurarse de que las vacunas no contagian a los animales no vacunados (60).4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  5. 5. Capítulo 2.9.9.- SalmonelosisOtro elemento esencial en la profilaxis de la salmonelosis humana es la educación del consumidor, en particular,la concienciación sobre el manejo y almacenamiento seguro del alimento, la higiene en la cocina y el tratamientoculinario adecuado para limitar el riesgo de infección. B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO1. Identificación del agenteLa frecuencia del muestreo y el tipo de muestras obtenidas dependerán en gran medida de los objetivos delprograma de pruebas (incluidos los requisitos estatutarios), los hallazgos clínicos, los niveles de detección o laprecisión necesaria en la estimación de la prevalencia, el coste y la disponibilidad de recursos para el muestreo yde instalaciones de laboratorio.Las muestras individuales para pruebas bacteriológicas se recogen tan asépticamente como sea posible y, encaso de enfermedad clínica o de control rutinario, deben recogerse antes de comenzar cualquier tratamientoantibiótico. Con preferencia, las muestras clínicas se recogen durante la fase aguda de la enfermedad o muypronto después de la muerte. En el caso de las parvadas de aves de corral o de otras especies avícolas, lasmuestras ambientales, como las heces agrupadas de forma natural, la basura y el polvo, los barridos o los frotisa partir de las superficies del suelo, pueden ser el modo más eficaz, en cuanto al coste, de identificar granjasinfectadas (5, 25). Se deben tomar precauciones para evitar la contaminación cruzada de las muestras durante larecogida, el desplazamiento y en el laboratorio. Los envíos deben mantenerse en frío y estar acompañados deuna información adecuada. Si es posible, en el caso de especies animales pequeñas, es preferible enviar allaboratorio un número representativo de animales enfermos o recién muertos (63). Normalmente, los serotiposadaptados al hospedador son más difíciles de aislar de las heces, de modo que, si se sospecha esta situación,se deben cultivar tejidos infectados siempre que sea posible.Se debe prestar una atención particular al aislamiento de Salmonella en animales con infecciones subclínicas, yaque estos pueden liberar bacterias solo de modo intermitente y en cantidades bajas. Se puede lograr aumentar lasensibilidad diagnóstica incrementando el tamaño de las muestras y el número de las muestras para querepresenten más individuos, todo ello combinado en algunos casos con la mezcla de las muestras y la repeticiónde los muestreos. En tales situaciones los métodos bacteriológicos o serológicos se deben utilizar para identificarpoblaciones infectadas más que para identificar animales individuales infectados. CultivoExisten muchos métodos para aislar Salmonella que son de uso universal (9, 14, 17, 29, 46, 63). Más adelantese describen algunos de los métodos más comunes. Las técnicas y medios de cultivo con los mejores resultadosen una situación diagnóstica concreta dependen de una variedad de factores que incluyen el tipo de Salmonella,el origen y tipo del ejemplar, la experiencia del microbiólogo y la disponibilidad de medios de enriquecimientoselectivo y de medios selectivos en placas.Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y permitir el crecimiento delmicroorganismo sospechoso a partir de un inóculo pequeño. El uso de la cepa de referencia en paralelo con lasmuestras rutinarias puede dar lugar a contaminación cruzada de las muestras por la utilización inadecuada de lastécnicas, así que debe utilizarse un serotipo escaso con características de cultivo típicas que sean semejantes alas de la cepa problema más prioritaria.El establecimiento progresivo de programas para la garantía externa de la calidad ha impulsado la utilizacióncreciente de métodos estándar, como la norma ISO 6579:2002; aunque esta no ha sido validada para muestrasfecales y ambientales y se estableció para los alimentos y los piensos. En los últimos años se ha elaborado yevaluado un método estándar para la detección de Salmonella a partir de la industria de producción animal, ycasi se ha adoptado un método ISO (35). Lo esencial del método estándar es el preenriquecimiento en agua depeptona tamponada, el enriquecimiento en Rappaport–Vassiliadis (MSRV) semi-sólido modificado, el aislamientoen agar xilosa-lisina-dexosicolato (XLD) y un medio selectivo de cultivo en placa.a) Medios de preenriquecimiento El número de salmonelas es normalmente bajo en las heces de los animales asintomáticos, en muestras ambientales, en los alimentos para el ganado y en los alimentos, por lo que es necesario utilizar medios de preenriquecimiento para facilitar el aislamiento, tal como el agua de peptona tamponada o el caldo universal de preenriquecimiento. Esto puede permitir que un escaso número de Salmonella se multipliquen sin que mueran por los efectos tóxicos de los medios de enriquecimiento, o puede ayudar a la recuperación de las que presentan daños subletales, como los debidos a la congelación, el calentamiento, la exposición a las substancias microbicidas o a la desecación El preenriquecimeinto puede que no sea el mejor método para aislar cepas poco vigorosas de Salmonella de las heces, como el caso de las cepas adaptadas alManual de la OIE sobre animales terrestres 2008 5
  6. 6. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis hospedador, debido a un sobrecrecimiento de microorganismos competidores durante un preenriquecimiento no selectivo.b) Medios de enriquecimiento Los medios de enriquecimiento son medios líquidos o semisólidos que contienen substancias que permiten el crecimiento selectivo de las salmonelas a la vez que inhiben el crecimiento de otras bacterias. Algunos, sin embargo, son también relativamente tóxicos para algunos serotipos de Salmonella, por ejemplo, el selenito inhibe S. Cholerasuis, y el colorante verde brillante es tóxico para muchas cepas de S. Dublin. También se han utilizado las temperaturas elevadas para aumentar la selectividad del medio de enriquecimiento. En algunos laboratorios se utiliza una temperatura de 43°C, aunque con algunos medios puede resultar inhibidora; por ejemplo, los medios de tetrationato y de Rappaport–Vassiliadis inhiben las cepas termosensibles, especialmente S. dublin, y ahora se recomienda 41.5°C para incubación en caldo de Rappaport–Vassiliadis (22). También se puede emplear el enriquecimiento selectivo por movilidad para aumentar la sensibilidad del aislamiento de Salmonella y la utilización de medios de enriquecimiento semisólidos, como MSRV o medio semisólido para el diagnóstico de Salmonella (DIASALM), que pueden proporcionar mayor sensibilidad (59). La composición del medio, que puede variar de un proveedor a otro, o incluso en algunos casos de un lote a otro, la temperatura y la duración de la incubación, y el volumen de las muestras utilizadas como inóculo del medio, pueden servir para influir en la tasa de aislamiento, y se deben tener siempre en cuenta estas variables. Ejemplos de medios selectivos de enriquecimiento son el de tetrationato sódico, como en el caldo de Muller–Kauffman, los caldos con selenito F, con selenito cisteína, con verde brillante, el de Rappaport–Vassiliadis o el medio semisólido de Rappaport–Vassiliadis. En algunos casos puede resultar ventajosa la utilización de más de un caldo selectivo o el cultivo mediante preenriquecimiento y el enriquecimiento y la siembra directa, aunque a menudo el beneficio no justifica el aumento de los costes. Se pueden añadir a los medios selectivos substancias como la Ferrioxamina E para mejorar el aislamiento de Salmonella en muestras con limitación de hierro o de nutrientes como los huevos, el agua o el suelo (46), o pueden añadirse antibióticos para mejorar el aislamiento de las cepas resistentes a los antimicrobianos.c) Medios selectivos en placa Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un crecimiento diferencial en varios aspectos. Inhiben el crecimiento de bacterias distintas a Salmonella y suministran información sobre algunas de las principales características bioquímicas diferenciales – normalmente la incapacidad de fermentar de la lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S). Los resultados se obtienen después de 24 y 48 horas de cultivo a 37°C. En dichos medios Salmonella forma colonias características que son distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la posible excepción de Proteus, Pseudomonas y Citrobacter. En ocasiones, se pueden aislar salmonelas fermentadoras de la lactosa y la producción de H2S puede ser variable. Se pueden detectar de modo más eficaz tales cepas atípicas cuando se utilizan medios selectivos semisólidos. A este respecto, el medio DIASALM es particularmente útil ya que se puede realizar una confirmación provisional por aglutinación en porta utilizando antisueros polivalentes anti-O, anti-H o específicos, con líquido de la zona de crecimiento de la placa. Salmonella Abortusovis es un serotipo de crecimiento lento, y es normal incubar las placas durante 72 horas y utilizar el medio no selectivo de agar-sangre. Ejemplos de medios selectivos sólidos son el agar verde brillante, el agar xilosa- lisina-desoxicolato, el agar desoxicolato/citrato, el agar Rambach, y el agar sulfito de bismuto, aunque en la literatura y en los catálogos de medios pueden encontrarse muchos más. Actualmente se dispone de una amplia variedad de medios sólidos. Muchos de estos pueden servir de ayuda para la diferenciación entre colonias sospechosas, pero deben ser validados para las matrices de muestra, los sistemas de cultivo, y la gama de serotipos utilizados, ya que, bajo ciertas condiciones, la sensibilidad puede ser pobre. Identificación de colonias sospechosasLas colonias sospechosas se subcultivan en medios sólidos selectivos y no selectivos para asegurar la ausenciade posibles contaminantes como Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las coloniassospechosas se pueden probar por aglutinación en porta con sueros polivalentes para la tipificación deSalmonella (28). En algunos casos, la colonia sospechosa puede no aglutinar o autoaglutinar y es necesarioentonces utilizar pruebas bioquímicas para confirmar la identificación. Estas pruebas se pueden realizar conazúcares en agua de peptona o con sistemas comerciales (tales como el sistema Índice de Perfil Analítico [API]),la prueba OBIS o en medios compuestos (tales como el agar triple azúcar-hierro [TSI]) (12).La identificación de los antígenos O y H, y, en circunstancias especiales, del antígeno Vi, se realiza medianteaglutinación directa en porta o por aglutinación en tubo utilizando antisueros específicos. En el caso demicroorganismos bifásicos, es necesario identificar ambas fases mediante el uso de la inversión de fase lo queimplica el pase por medio semisólido que contenga antisuero contra la fase conocida. La detección se facilita porla disponibilidad de antisueros dirigidos contra varios factores, y puede mejorarse utilizando sueros monovalentesde tipificación. Aunque muchos de los laboratorios puede identificar los serotipos más comunes, se necesita6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  7. 7. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosisutilizar los servicios de un laboratorio de referencia para confirmar la identidad de un aislamiento y, posiblemente,para obtener información sobre la fagotipia, si existe una clasificación disponible, y sobre el perfil genético.Se pueden necesitar pruebas bioquímicas adicionales para identificar algunas variantes serotípicas, por ejemplo,la del d-tartrato que permite diferenciar S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Los aislamientos se debenprobar en cuanto a su sensibilidad a un conjunto de agentes antimicrobianos ya que existe una preocupacióncreciente por la emergencia de múltiples cepas nuevas resistentes que albergan genes de resistenciatransferibles a las cefalosporinas y las fluoroquinolonas (26, 43, 61). Las cepas vacunales vivas también seidentifican mediante marcadores de resistencia a antimicrobianos y por cambios bioquímicos como elauxotrofismo o rugosidad. Métodos de reconocimiento inmunológicos y de ácidos nucleicosSe usan y comercializan numerosos métodos alternativos de detección de Salmonella (6, 8, 12, 48, 49, 52, 57,66). Estos incluyen métodos basados en la conductancia/impedancia eléctrica, en la separacióninmunomagnética (IMS), en los enzimoinmunoensayos (ELISA), métodos de la PCR con sondas génicas,incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (6) y en la PCR en tiempo real(16, 31, 40) o cuantitativa (41). Muchos de estos métodos no han sido validados para muestras fecales yambientales, y resultan más adecuados para el análisis de alimentos humanos (39). Los métodos rápidos suelenser más costosos que los cultivos convencionales, pero pueden resultar económicamente viables para analizarmateriales donde se espera una prevalencia baja de contaminación o donde los materiales, como los alimentos,están pendientes de una prueba negativa. Un método de enriquecimiento/IMS en combinación con un ELISA oPCR puede proporcionar resultados en 24 horas. En la actualidad, ninguno de los métodos rápidos se hamostrado adecuado para la detección directa de Salmonella, de modo que se necesitan etapas deenriquecimiento selectivo o no selectivo (37). Esto introduce más pasos en el proceso de detección y requieremás tiempo para el operador. En los métodos basados en el ADN, la inhibición de la reacción de la PCR porelementos de la matriz de la muestra, especialmente en el caso de las heces, resulta problemática y requieretécnicas adecuadas de extracción del ADN (23). Los métodos de aislamiento rápido pueden también estarligados a sistemas de detección sofisticados, como biosensores (38). En los métodos rápidos para detección deSalmonella hay muchas variaciones y avances, pero ninguno parece reemplazar satisfactoriamente al cultivo entodas las circunstancias. Por tanto, no es posible dar detalles de todos los métodos en este capítulo o hacerrecomendaciones, pero los artículos de revisión citados más arriba contienen información adicional. Actualmentese están haciendo esfuerzos para estandarizar a nivel internacional el empleo de algunos métodos rápidos (30),pero todavía existe una cantidad considerable de trabajo pendiente. Ejemplo de procedimiento de un método para aislar Salmonella de alimentos, piensos, muestras fecales y ambientales i) Se añade una muestra de 10–25 g a ×10 volúmenes de agua de peptona tamponada a temperatura ambiente. (NB: en el caso de muchos serotipos adaptados a un hospedador, y algunos serotipos arizonae, es preferible añadir la muestra a un medio selectivo de enriquecimiento, como caldo selenito-cisteína, y probar muestras de tejido cuando sea posible [incluyendo la siembra directa; véase el método de cultivo para S. Pullorum/Gallinarum en el capítulo 2.3.11 de este Manual]. ii) Se incuba el agua de peptona tamponada durante 16–20 horas a 37°C. iii) Se inocula, con 0,2 ml del agua de peptona tamponada incubada, 20 ml de medio semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM en una placa de Petri. iv) Se inocula, con 1ml del agua de peptona tamponada incubada, 10 ml de caldo de tetrationato. v) Se incuba el medio semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM a 41,5°C y el caldo de tetrationato a 37°C (se ha de estar seguro de que se utiliza una marca fiable de tetrationato para uso a 37°C). vi) Después de 24 y 48 horas de enriquecimiento selectivo, se resiembra del medio semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis tomando material del borde de la zona turbia con el asa de 1 µl y extendiéndolo por siembra en estría sobre una placa con agar de Rambach o agar verde brillante y sobre una placa con agar xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina. vii) Se resiembran 10 µl del caldo de tetrationato sobre agar de Rambach o agar verde brillante y sobre agar xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina. viii) Se incuban las placas a 37°C durante 24 horas. ix) Se examinan cinco colonias sospechosas (rojas/rosas con enrojecimiento del medio en el caso de agar verde brillante, carmesí con bordes pálidos o naranjas/sin color en agar Rambach, rojas con centro negro en agar xilosa-lisina-desoxicolato) utilizando antisuero poli “O” y poli “H” (fase 1 y fase 2) o medios bioquímicos compuestos.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 7
  8. 8. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis x) Se subcultivan las colonias muy sospechosas que no aglutinen con antisueros poli H en medios no selectivos y se repeten después las pruebas. Si se obtiene una aglutinación fuerte con poli O y poli H, esto es suficiente para una confirmación preliminar. Tales aislamientos se pueden luego seroagrupar. Si los resultados de la aglutinación no son claros, hay que realizar más pruebas bioquímicas utilizando medios compuestos como el TSI o emplear ONPG (o-nitrofenil-beta-d-galactopiranósido) y urea o pruebas bioquímicas comerciales, como el API ID 32 E.2. Pruebas serológicas Identificación serológica de animales y de explotaciones infectadasSe han desarrollado varias pruebas serológicas para diagnosticar las infecciones por Salmonella en animales. Enaves, para la identificación de granjas infectadas con S. Pullorum/Gallinarum, se han utilizado con éxito durantemás de 50 años la prueba de sangre completa, que utiliza un antígeno teñido, y la prueba de aglutinación sérica(SAT). Como S. Enteridis posee el mismo antígeno somático del grupo D que S. Pullorum/Gallinarum, la pruebade sangre completa y otras relacionadas pueden utilizarse en el diagnóstico de la infección, pero la sensibilidades baja. Recientemente se han desarrollado otras pruebas, como las de tipo ELISA (58), para el diagnóstico delas infecciones por S. Enteritidis y S. Typhimurium y para otros serotipos de animales de granja. Los ensayosELISA se han utilizado con eficacia para identificar serológicamente ganado portador de S. Dublin y se puedenaplicar a la leche sin tratar, para analizar ganado estabulado de producción láctea. En Dinamarca se utiliza unELISA mixto con suero o fluido tisular liberado por congelación y descongelación de muestras de músculo paradetectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Se utiliza una prueba similar para detectar anticuerpos contraS. Enteritidis y S. Typhimurium en la yema de huevo de explotaciones comerciales de ponedoras (13).Algunas pruebas ELISA son ahora de uso rutinario y se han comercializado varias, y ahora se requiere laestandarización de su utilización. La finalidad de esta sección es considerar las pruebas serológicas que se hanevaluado por completo y que son de uso rutinario en el diagnóstico de la salmonelosis en animales. Por tanto, nose considerarán otras pruebas que están aún en fase de desarrollo. Con frecuencia se presentan nuevaspruebas para el diagnóstico de Salmonella, de modo que una búsqueda en Internet es a menudo el mejor modode obtener una información actualizada. Factores que influyen en el diagnóstico serológico1. Los métodos serológicos deben utilizarse para identificar poblaciones infectadas más que para identificar animales individuales infectados, aunque se pueden emplear pruebas repetidas en la explotación como una ayuda para seleccionar los animales portadores crónicos. Normalmente, las pruebas serológicas se diseñan para detectar un número limitado de serotipos o serogrupos de Salmonella.2. Se sabe que algunos animales con respuesta serológica positiva no pueden ser infectados de nuevo por Salmonella. De modo similar, animales que excretan activamente Salmonella pueden ser serológicamente negativos. También se aplican consideraciones similares a los métodos de cultivo bacteriológico, y así, los cultivos fecales con resultados negativos no indican necesariamente que el animal no está infectado. Sin embargo, ninguna de estas situaciones debe considerarse como un problema importante si se realizan suficientes pruebas. Los animales que son serológicamente positivos pueden haber cesado de excretar Salmonella aunque las concentraciones de inmunoglobulinas circulantes pueden permanecer altas. Otros animales de la granja pueden estar todavía infectados. Los animales serológicamente negativos pueden ser el resultado de una infección reciente que origine la excreción antes de que la producción de inmunoglobulinas sea máxima, o de una infección con serotipos menos invasivos. Con toda probabilidad, los animales que han sido infectados recientemente serán detectados serológicamente por un programa adecuado de análisis a lo largo de la vida de la explotación.3. Los animales recién nacidos son inmunológicamente inmaduros y no responden serológicamente al antígeno somático LPS hasta las 2–3 semanas de edad. Sin embargo, sí producen una respuesta serológica a los antígenos de la proteína flagelar. El ganado bovino puede no responder serológicamente hasta las 10–12 semanas de edad y es posible que los lechones no desarrollen una respuesta inmune o posean una respuesta de anticuerpos que refleja la inmunidad materna. Las respuestas diferenciadas que implican diferentes clases de anticuerpos (IgM, IgA, IgG) pueden utilizarse en cerdos para distinguir las infecciones recientes de las antiguas, pero con frecuencia eso no es de utilidad para ensayar piaras en las que los individuos se hallan normalmente en diferentes fases de la infección. La mayoría de las pruebas se basan en la IgG, y es típico que aparezcan elevados niveles de anticuerpos entre 1 y 3 semanas después de la infección y que duren entre 2 y 3 meses. Los pollos pueden también adquirir pasivamente anticuerpos anti-salmonella de sus progenitores a través del saco vitelino; esto puede indicar que la población de los padres estaba infectada. Los mamíferos pueden adquirir anticuerpos de la madre a través del calostro.8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  9. 9. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis4. Durante muchos años se ha utilizado la inmunización para controlar ciertas infecciones por Salmonella en animales de granja y, si se emplea serología en el diagnóstico, es necesario diferenciar entre la respuesta a la vacuna y a una infección real. Muchas vacunas vivas que se administran oralmente no proporcionan una respuesta de anticuerpos séricos significativa en la mayoría de los animales, pero puede haber excepciones ocasionales. Las vacunas muertas inyectables utilizadas para el control de S. Enteritidis en pollos pueden producir una respuesta de anticuerpos muy prolongada. Sería muy provechoso que se pudiera fabricar una vacuna viva marcada que se pudiera diferenciar del desafío de campo mediante pruebas serológicas.5. El efecto de la terapia con antibióticos en la respuesta serológica no está claro. Algunos investigadores encuentran títulos reducidos después de la terapia, mientras que otros no detectan efecto alguno. No obstante, si se ha empleado terapia antimicrobiana, la serología puede ser una técnica de diagnóstico para la salmonelosis más útil que el cultivo.6. Existen aproximadamente 2.500 serotipos diferentes de Salmonella. Dependiendo del antígeno y de la prueba utilizada, pueden ocurrir reacciones serológicas cruzadas entre diferentes serotipos, por ejemplo entre S. Typhimurium, S. Pullorum y S. Enteritidis. En algunos casos pueden ocurrir reacciones cruzadas como resultado de la exposición a microorganismos distintos de Salmonella.7. En las aves, la yema del huevo se puede probar para detectar inmunoglobulinas frente a Salmonella, y los huevos representan, por tanto, un método para analizar explotaciones. En Dinamarca se emplea esta estrategia para controlar explotaciones comerciales de ponedoras. En el ganado bovino, se puede utilizar la leche para la detección de anticuerpos anti-Salmonella para analizar las explotaciones de producción láctea.8. La utilización de discos de papel de filtro para recoger suero elimina la necesidad de separar el suero. Los discos también permiten la conservación a largo plazo y reducen los costes de transporte al laboratorio. La sensibilidad de la prueba puede resultar levemente reducida en comparación con las pruebas realizadas con suero fresco.a) La prueba de sangre completa La prueba de sangre completa es una prueba rápida para la tifosis aviar y la pulorosis que puede utilizarse en la granja. La sensibilidad de esta prueba es baja y, sin experiencia, se pueden registrar muchos resultados como falsos positivos y falsos negativos. Para una descripción detallada de la prueba de sangre completa, véase el capítulo 2.3.11 Tifosis aviar y pulorosis.b) Prueba rápida de aglutinación en porta El suero (0,02 ml) se mezcla con antígeno polivalente teñido con cristal violeta (0,02 ml). El porta se mueve cuidadosamente durante 2 minutos, tras los cuales se ve el resultado de la prueba. Los componentes de la prueba se guardan a 4°C y antes de usarlos deben alcanzar la temperatura ambiente. Los sueros problema deben estar libres de contaminantes y de hemolisis. Puede ser conveniente centrifugar las muestras de suero que se hayan mantenido guardadas por algún tiempo. Si se sospecha la existencia de reacciones falsas positivas inespecíficas, los sueros positivo/sospechosos deben probarse de nuevo después de una inactivación térmica a 56°C durante 30 minutos.c) Prueba de aglutinación sérica La SAT es relativamente poco sensible, y muchos animales viejos tienen niveles bajos de aglutininas en sus sueros debido a enterobacterias distintas a Salmonella. Las muestras aisladas carecen de valor diagnóstico excepto como muestras para el examen inicial del rebaño. Se necesitan muestras pareadas como requisito mínimo para confirmar una infección activa. La prueba es relativamente barata; los antígenos se pueden preparar con facilidad y no se requiere un equipo costoso. La SAT se puede adaptar a formato de microtitulación y se puede utilizar para determinar títulos somáticos o flagelares. Se recomienda utilizar para SAT un suero estándar y otros métodos confirmativos para el control de la pureza y la inmunogenicidad de las preparaciones de antígeno(s) para SAT, que no dependan de los sueros producidos a partir de dichos antígenos. • Preparación del antígeno somático i) Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio agar- sangre base (BAB), u otro medio adecuado, para crecimiento de colonias aisladas. Incubar durante toda la noche a 37°C (±2°C).Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 9
  10. 10. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis ii) Se selecciona una colonia lisa y realizar una prueba de aglutinación en porta para confirmar que está presente el antígeno somático requerido. iii) Mediante un asa estéril, se inocula con la colonia seleccionada un tubo de agar nutritivo inclinado. iv) Se incuba el cultivo durante 8–12 horas a 37°C (±2°C). v) Con una pipeta Pasteur, se retira el crecimiento, preferentemente en una cabina de seguridad, con aproximadamente 2 ml de alcohol absoluto y se transfiere el contenido a un tubo estéril. vi) Se deja el antígeno a temperatura ambiente durante 4–6 horas para que el alcohol mate las bacterias y suelte los flagelos. vii) Se centrifuga el tubo en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 1.000 g. Se vierte el líquido y se añade suficiente solución salina con fenol para conseguir que el antígeno alcance una opacidad equivalente a la de un tubo No. 2 en la escala de Braun (aproximadamente 108 unidades formadoras de colonias/ml) u otro estándar apropiado. viii) Se realiza una titulación estándar con un suero conocido para confirmar que el antígeno es positivo para el factor requerido. ix) Se guarda en un refrigerador a 4°C hasta su utilización.  Preparación de antígenos flagelares i) Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio BAB, u otro medio adecuado. Incubar durante toda la noche a 37°C (±2°C). ii) Se realiza un pase en medio semisólido (con aproximadamente 0,3% de agar) en un tubo de Craigie, u otro contenedor adecuado, para inducir la expresión óptima del antígeno flagelar apropiado. Si el serotipo es bifásico, se añade al medio antisuero H que corresponda a la fase a suprimir. iii) Se utiliza la aglutinación en porta para comprobar que Salmonella está en la fase requerida. Si es así, se inocula con un asa de cultivo 20 ml de caldo nutritivo. Se incuba durante 12–18 horas a 37°C (±2°C) para un crecimiento óptimo. (Si la fase es incorrecta, se vuelve a pasar por el medio semisólido). iv) Se pipetean en la suspensión de antígeno 250 µl de formaldehído al 40% (se deben usar guantes y se debe trabajar preferiblemente en una cabina de seguridad), y se deja toda la noche. v) Se prueba el antígeno por SAT utilizando el suero de tipificación apropiado.  Procedimiento de la prueba i) Es más fácil analizar los sueros a una dilución de 1/20; se añaden 0,25 ml de antígeno a 0,25 ml de suero prediluido a 1/10 en solución salina normal. ii) Las mezclas se incuban en un baño de agua a 50°C durante 24 horas en el caso de los antígenos somáticos, y durante 4 horas, para los antígenos flagelares. La dilución y el tiempo de incubación puede variar dependiendo del antisuero usado. iii) Los sueros que dan reacción positiva se diluyen luego de 1/20 a 1/320 y se vuelven a probar con el antígeno apropiado.d) ELISA para Salmonella Enteritidis Para la detección de IgG (IgY) específica para S. Enteritidis, existen dos sistemas básicos principales: el ELISA indirecto (2) y el ELISA competitivo “ tipo sandwich” (58). El ELISA indirecto supone el uso de un antígeno detector que recubre los pocillos de una placa de microtitulación. Después de aplicar un reactivo bloqueante para reducir uniones inespecíficas, se añaden a los pocillos las muestras problema. El anticuerpo de la muestra que se une específicamente se detecta con un conjugado anticuerpo/enzima. Se han utilizado varios antígenos, incluyendo LPS, flagelos, fimbrias SEF 14, proteínas de la membrana externa y preparaciones de antígenos celulares totales. El ELISA sándwich competitivo emplea un reactivo específico – un anticuerpo monoclonal (MAb) o policlonal – para recubrir los pocillos de antígeno. Luego se añade una preparación pura o cruda de antígeno. Después se aplican las muestras problema seguidas por el anticuerpo conjugado, que no se unirá al antígeno si la muestra contiene anticuerpos específicos. El tiempo de ensayo se puede acortar añadiendo simultáneamente la muestra problema y el conjugado. Se ha preparado MAb de LPS, flagelos y SEF14 de S. Enteritidis. Ambos sistemas presentan ventajas y desventajas. El ensayo indirecto es más simple y hay reactivos disponibles para todos los serotipos de Salmonella de pollos, pavos, patos y mamíferos. El ELISA10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  11. 11. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis competitivo se puede aplicar a todas las especies animales y, en general, muestra mayor especificidad. Sin embargo, no hay reactivos comercializados para todos los serotipos. También hay algunos problemas de afinidad y puede ser menos sensible que las técnicas indirectas. En condiciones de campo, ambos sistemas han producido reacciones positivas falsas y en algunos casos el análisis con un ELISA indirecto con LPS puede confirmarse después con un ELISA competitivo flagelar. Ambos tipos de ensayo pueden utilizarse con suero, yema de huevo o sangre seca reconstituida eluida de discos de papel de filtro. En Dinamarca y otros países se emplea un ELISA mixto (o ELISA de jugo de carne) para detectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Este ELISA contiene los antígenos “O” de tipo 1, 4, 5, 6, 7 y 12 del LPS de S. Typhimurium y S. Cholerasuis, lo que capacita al ensayo para detectar serológicamente el 95% de los serogrupos de Salmonella que se encuentran en los cerdos de la mayoría de países europeos. También se han añadido antígenos del grupo D a algunos kits para ELISA. El suero se utiliza para analizar granjas de producción y multiplicación, mientras que, para cerdos en el matadero, se realiza el ensayo con el fluido tisular (“jugo de carne”) que se libera cuando se descongelan 10 g de muestra de músculo congelado. Con algunos ELISA se puede diferenciar entre las infecciones producidas por serotipos de Salmonella de diferentes serogrupos. Entre los grupos B y D y otros serotipos invasivos se produce alguna reacción cruzada. Sin embargo, normalmente hay una mayor respuesta de anticuerpos cuando en el ELISA se utiliza LPS del serotipo homólogo. Aún no se ha decidido ni existe acuerdo internacional sobre cuál es el mejor método para establecer un valor de “corte” en la absorbancia, por encima del cual los sueros se designan como procedentes de una población afectada por S. Enteritidis, sin que se produzca un nivel inaceptable de resultados positivos falsos. Los ELISA están adaptados a la automatización y, por tanto, a programas de muestreo a gran escala. Un problema importante es que se necesita un equipo costoso, y muchos de los reactivos son también caros. Hay varias preparaciones ELISA y ELISA-mixtas comercializadas para S. Enteritidis, S. Typhimurium y Grupo B/C. En teoría, estas deberían validarse mediante ensayos internacionales coordinados antes de adoptarse a efectos de control. Un ejemplo de un ELISA validado es el desarrollado por el Laboratorio de Referencia de la OIE de VLA Weybridge (ver dirección en el Cuadro de la parte 3 de este Manual). Los requisitos se indican a continuación.  Equipo Placas de PVC, tipo Falcon microprueba III; pipetas apropiadas y cilindros de medida; lavador de placas de microprueba; lector de placas ELISA; filtro de prueba de 405–410 nm y filtro de referencia de 630 nm.  Antígeno i) El LPS de S. Enteritidis extraído con fenol está comercialmente disponible (Catálogo Sigma No. L6011). Este se reconstituye en 1 ml de agua desionizada y se guarda a –20°C en alícuotas de 100 µl en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7, a una concentración de 2,5 mg/ml. Para su uso, el antígeno debe ser descongelado en tampón de recubrimiento a la concentración apropiada. ii) El antígeno LPS también se puede preparar por la técnica de Westphal & Luderitz (62) y estandarizar, en lo que respecta a su concentración en carbohidrato, por el método de Gerhardt (15) a una concentración ajustada a 1.000 µg/ml.  Diluyente del suero y del conjugado Se añade seroalbúmina bovina (BSA) (2 g) y Tween 20 (0,05 ml) a PBS (100 ml) (Alternativamente, la leche en polvo [1 g] puede reemplazar a la BSA). Se guarda a 4°C y se hacen soluciones frescas cada semana. Tampón de recubrimiento: Se añade carbonato sódico (1.59 g) y bicarbonato sódico (2.93 g) a agua desionizada (1 litro) y se ajusta a pH 9,6. (Alternativamente, se disuelve una tableta de tampón 0,05 M carbonato/bicarbonato de Sigma [No. Catálogo C-3041] en agua desionizada [100 ml]). Se guarda a 4°C y se renueva cada 2 semanas. Tampón de substrato: Se prepara una solución de dietanolamina al 10% (v/v) en agua desionizada. La dietanolamina debe precalentarse a 37°C antes de distribuirse, y el pH de la solución debe ajustarse a pH 9,8 con ácido clorhídrico 1 M. Se guarda a 4°C y se renueva cada 2 semanas. Conjugado enzimático: Inmunoglobulina anti-pollo de cabra conjugada a fosfatasa alcalina (por ejemplo, ICN Immunobiologicals, o como suministro alternativo de Sigma: A9171) o globulina anti-pollo de otras especies. Se guarda a 4°C diluida en diluyente a la concentración apropiada y se renueva cada semana.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 11
  12. 12. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis Substrato del enzima: Se disuelve una tableta de p-nitrofenil fosfato disódico (5 mg) en tampón de substrato (5 ml) no antes de 30 minutos de su uso, y se mantiene en la oscuridad.  Estándares i) Antisuero control positivo preparado por inoculación intramuscular de cuatro pollos libres de patógenos específicos (SPF) de 1 semana de edad con un inóculo que contenga 106 S. Enteritidis. El suero se obtiene 3–4 semanas después, cuando los títulos de anticuerpo son máximos. ii) Suero control negativo A de cuatro aves SPF de 1 semana de edad. iii) Suero control negativo B de 58 productoras de 1 semana de edad que estén libres de infecciones por Salmonella. Se juntan los sueros y se guardan en volúmenes de 100 µl a –20°C. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICOSe utilizan muchas vacunas inactivadas contra la salmonelosis causada por serotipos diferentes en variasespecies animales, incluyendo una vacuna combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium para empleo enaves. La inactivación se realiza normalmente por calentamiento o por tratamiento con formalina y se suele utilizarun adyuvante, como el hidróxido alumínico. En varios países también se han utilizado vacunas vivas; estasincluyen las cepas semi-rugosas, tales como la 9R para la tifosis aviar y la HWS51 para las infecciones porS. dublin (33). Otras vacunas atenuadas incluyen mutantes autotróficos y “de deriva metabólica”, que se usan enAlemania para evitar infecciones por Salmonella en animales de granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis yS. Typhimurium en aves de corral. Se han desarrollado vacunas mutantes, atenuadas racionalmente porsupresión de genes mediante técnicas de biología molecular, para aves de corral y para otras especies; estascomprenden los mutantes aroA y las cepas con mutaciones en los genes que codifican la adenilato ciclasa (cya)y la proteína receptora del adenosín monofosfato cíclico (crp) (7), disponibles en los EE.UU. Normalmente, enEuropa no se permite el uso como vacunas de microorganismos genéticamente modificados.Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8. Principios deproducción de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aquí y en el capítulo 1.1.8 son de caráctergeneral y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.1. Control del inóculoa) Características del inóculo Para vacunas vivas o muertas, la cepa bacteriana debe de estar lo más estrechamente relacionada que sea posible con las cepas salvajes de circulación actual. Debe escogerse cuidadosamente de casos de enfermedad clínica grave y debe determinarse su virulencia y la producción de antígeno. Es mejor evaluar varias cepas potenciales de este modo antes de probar la selección+ final. Las cepas vacunales finales deben identificarse por documentación histórica y caracterizarse por marcadores fenotípicos y/o genéticos estables. Las cepas de vacunas vivas deberán poseer caracteres estables que permitan su distinción de las cepas salvajes. Se pueden usar marcadores de resistencia a antimicrobianos, por ejemplo a rifampicina. La atenuación de la virulencia debe ser estable y lograrse preferiblemente por dos mutaciones independientes definidas. La estabilidad de las cepas vacunales vivas puede verificarse mediante comprobaciones periódicas utilizando la determinación molecular sensible (de las huellas de ADN) y las técnicas de hibridación en microarrays.b) Método de cultivo El cultivo de inóculo se propaga y mantiene utilizando medios adecuados, muchos de los cuales se han descrito (en libros de texto) para el crecimiento de Salmonella. Los medios empleados no deben contener suero ni tejidos animales. El cultivo puede ser en medio sólido, en frascos de Roux, o en medio líquido, en cuyo caso se puede utilizar un equipo de fermentación a gran escala. La limitación de hierro o la incubación a baja temperatura en un medio mínimo puede aumentar la producción de antígeno LPS por la cepa vacunal.c) Validación como una vacuna i) Pureza La cepa vacunal debe comprobarse del siguiente modo:  Tinción de un frotis de suspensión bacteriana en un porta de vidrio empleando la tinción de Gram.  Homogeneidad del cultivo en medios no selectivos.  Requerimientos metabólicos indicados por pruebas bioquímicas.  Detección de marcadores, y fagotipia.  Aglutinación con antisuero específico.12 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  13. 13. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis ii) Inocuidad Se debe determinar en ratones la LD50 (dosis letal 50%) o la ID50 (dosis infectiva 50%). A la especie a vacunar se le debe suministrar diez veces la dosis de campo de vacuna viva, o el doble de la dosis de vacuna inactivada, a la edad y por la ruta recomendadas. Los animales se observan para comprobar la ausencia de reacciones adversas. Para las vacunas vivas debe demostrarse su estabilidad y la ausencia de reversión a la virulencia después de pases seriados en especies susceptibles. También es necesario considerar vacunaciones repetidas. Debe demostrarse que las vacunas vivas no persisten por mucho tiempo en los animales vacunados o que no se transmitan a la leche o a los huevos que puedan consumirse, y el método de aplicación no debería presentar riesgos a los operadores. iii) Eficacia Para demostrar que la vacuna es eficaz deben utilizarse experimentos de laboratorio y ensayos de campo. Los experimentos de laboratorio consisten en pruebas de vacunación e inoculaciones de desafío en la especie a vacunar, a las dosis y edad recomendadas. Los datos sobre eficacia también pueden utilizarse como base para la prueba de potencia de los lotes. Los ensayos de campo para probar la eficacia son más difíciles de realizar, debido a las dificultades para estandarizar las condiciones del desafío y disponer de los controles apropiados. iv) Aspectos ambientales Las vacunas vivas deben probarse respecto a su capacidad para persistir en el ambiente e infectar otras especies, como roedores o aves salvajes que puedan resultar expuestas. La supervivencia prolongada de algunas vacunas vivas en las heces y en las camas puede representar un riesgo ambiental inaceptable cuando el material se extrae de los habitáculos animales. No deberían usarse vacunas vivas durante la puesta de huevos.2. Método de producciónLas vacunas deben producirse en habitaciones limpias y adecuadas a las que solo tenga acceso personalautorizado. Se debe tener cuidado en evitar la contaminación cruzada entre áreas donde se procesanmicroorganismos vivos y otras zonas. Debe evitarse la contaminación de los operadores y del medio, y lapreparación de las vacunas debe tener lugar en una zona separada de la de trabajo con cultivos paradiagnóstico. Los operarios no deben manejar la vacuna mientras estén enfermos y no deben estar sometidos acondiciones inmunosupresoras o a medicación. En las áreas de producción y en las habitaciones para animalesse debe suministrar ropa protectora al personal.A partir del cultivo del inóculo primario se preparan lotes de cultivos de siembra, y el número de pases dependede la validación del proceso. La vacuna se puede preparar por inoculación de un medio adecuado, como caldonutritivo, con un cultivo reciente y mediante incubación en un agitador a 37°C durante 24 horas, con o sinaireación. Los microorganismos se recogen por sedimentación o centrifugación. Alternativamente, losmicroorganismos se pueden cultivar y recoger tanto de medios sólidos, como de agar nutritivo. En el caso devacunas vivas, la suspensión se diluye en PBS, pH 7,0, y se puede liofilizar.El tiempo de inactivación para una vacuna muerta debe ser al menos un 33% superior al necesario para reducirel número de viables a un nivel indetectable. El proceso de inactivación se debe aplicar a todo el volumen decélulas recogidas como vacuna.Los conservantes, excipientes para la liofilización, estabilizadores para recipientes multidosis y otras substanciasañadidas o en combinación con las vacunas no deben tener efecto perjudicial sobre la potencia inmunizante delproducto.3. Control internoLos siguientes aspectos requieren atención: Control visual de la suspensión, homogeneidad por la tinción de Gram, cultivo en medio no selectivo. Aglutinación en porta con antisueros específicos. Titulación de bacterias por turbidimetría y/o recuento en placa. Prueba de inactivación eficaz (vacunas muertas) sembrando en medio no selectivo o utilizando un medio que proporcione óptimo crecimiento, por ejemplo, medio de producción con la neutralización del compuesto inactivante. Titulación de bacterias viables (vacunas vivas) antes y después de la liofilización.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 13
  14. 14. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis4. Control de lotesa) Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos se encuentran en el capítulo 1.1.9.b) Inocuidad Se puede utilizar una prueba de laboratorio en ratones, que previamente se haya visto que se correlaciona con la seguridad en la especie a vacunar, para determinar la LD50 y/o la ID50. Cada lote se debe probar en la especie que se ha de vacunar, a la edad y por la vía recomendada, utilizando al menos dos veces la dosis de campo para vacunas muertas y diez veces la dosis para vacunas vivas.c) Potencia La potencia se prueba utilizando ensayos de vacunación-desafío en ratones y otras especies, incluyendo (si es posible) la especie que se ha de vacunar y la respuesta inmunológica en la especie que se ha de vacunar.d) Duración de la inmunidad La duración de la inmunidad suele variar considerablemente según los productos, los regímenes de vacunación y los animales individuales vacunados. La inmunidad a Salmonella es normalmente específica de serogrupo. Las consultas entre colegas sugieren que la mayoría de las vacunas muertas proporcionan protección durante 6 meses, mientras que algunas vacunas vivas administradas mediante inyección inducen una inmunidad más fuerte, que puede persistir durante 1 año o más. Debe recordarse, sin embargo, que un desafío fuerte como el asociado a granjas de ocupación continua o a roedores infectados puede superar la inmunidad vacunal y las vacunas vivas comerciales pueden ser atenuadas para reducir la supervivencia ambiental de forma tal que disminuya la respuesta inmune. También pueden presentarse problemas con la administración oral eficaz de la vacuna, con las vacunas vacías o con la precisión de la inyección de vacunas inyectables vivas y muertas.e) Estabilidad Se carece de información sobre la estabilidad de las vacunas muertas. La estabilidad está afectada por las condiciones de conservación y por la presencia de microorganismos contaminantes creciendo en el producto. La estabilidad se determina por pruebas de potencia repetidas a intervalos temporales adecuados. La estabilidad de las vacunas vivas se puede determinar realizando un recuento del número de microorganismos viables de modo repetitivo a intervalos temporales adecuados.f) Conservantes En las vacunas bacterianas muertas se incluyen a menudo compuestos con actividad antimicrobiana como conservantes, del tipo del tiomersal, fenol o cristal violeta.g) Precauciones En ocasiones, algunas vacunas muertas pueden causar aborto en hembras preñadas debido a su contenido en LPS, y las vacunas vivas deben utilizarse también con precaución en estos animales. A veces, sin embargo, es necesario vacunar hembras preñadas para proporcionar inmunidad maternal a su descendencia. Puede resultar útil incluir en el programa de pruebas de seguridad un ensayo de endotoxinas, de modo que se puedan comparar los niveles con aquellos que se muestran seguros en las pruebas de doble dosis. Las vacunas también pueden causar inflamación en el sitio de la inyección.5. Pruebas del producto finala) Inocuidad Las vacunas muertas se ensayan en una prueba de dosis doble y las vacunas vivas en una prueba que utiliza diez veces la dosis, en la especie a vacunar.b) Potencia La prueba de potencia debe relacionarse con la eficacia de la vacuna en la especie a la que va dirigida, si es posible, y se deben aplicar criterios adecuados para aprobar los lotes. Es posible estimar las vacunas muertas por la respuesta producida de anticuerpos anti O-H, aunque debe tenerse en cuenta que los14 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
  15. 15. Capítulo 2.9.9.- Salmonelosis anticuerpos séricos son solamente una parte de los mecanismos de protección del hospedador contra Salmonella. Alternativamente, la potencia de la vacuna se puede estimar por su efecto sobre la LD50 en ratones. D. EXCLUSIÓN COMPETITIVAEn las aves de corral, la susceptibilidad a la infección por Salmonella puede reducirse notablemente mediante untratamiento oral o en aerosol – antes de su exposición al microorganismo (es ideal en la eclosión del huevo) –con un cultivo de microflora anaeróbica del ciego, que inhibe la colonización de Salmonella, ocupando los sitiosde la colonización intestinal, produciendo ácidos y otras sustancias inhibidoras y estimulando las respuestasinmunes generalizadas de tipo local y mucosal. En algunos países este tratamiento se utiliza con frecuencia,pero en otros solo se emplea como ayuda para descontaminar granjas con infección persistente. También es útilminimizar la alteración de la flora intestinal tras el tratamiento microbiano o el estrés y potenciar el efecto de lasvacunas administradas a continuación. Al igual que ocurría con el tratamiento que disminuye la prevalencia o lascantidades de microorganismos de Salmonella excretados por grupos de animales infectados, puede ocurriralguna interferencia con programas de vigilancia y puede tener que ajustarse el muestreo y la sensibilidad de laprueba para compensar ese inconveniente (1, 34, 47). REFERENCIAS1. ANDREATTI R.L., SAMPAIO H.M., BARROS M.R., GRATAO P.R. & CATANEO A. (2003). Use of caecal microflora cultured under aerobic or anaerobic conditions in the control of experimental infection of chicks with Salmonella Enteritidis. Vet. Microbiol., 92, 237–244.2. BARROW P.A. (1994). Serological diagnosis of Salmonella serotype Enteritidis infections in poultry by ELISA and other tests. Int. J. Food Microbiol., 21, 55–68.3. BLACKBURN C DE W. (1993). A Review: Rapid and alternative methods for the detection of salmonellas in foods. J. Appl. Bacteriol., 75, 199–214.4. BOXRUD D., PEDERSON-GULRUD K., WOTTON J., MEDUS C., LYSZKOWICZ E., BESSER J. & BARTKUS J.M. (2007). Comparison of multiple-locus variable-number tandem repeat analysis, pulsed-field gel electrophoresis, and phage typing for subtype analysis of Salmonella enterica serotype Enteritidis. J. Clin. Microbiol., 45, 536– 543.5. CALDWELL D.J., HARGIS B.M., CORRIER D.E. & DELOACH J.R. (1998). Frequency of isolation of Salmonella from protective foot covers worn in broiler houses as compared with diagnostic sampling. Avian Dis. 42, 381–384.6. COOK N. (2003). The use of NASBA for the detection of microbial pathogens in food and environmental samples. J. Appl. Microbiol., 53, 165–174.7. COOPER G.L. (1994). Salmonellosis – infections in man and the chicken: pathogenesis and the development of live vaccines – a review. Vet. Bull., 64, 123–143.8. DE BOER E. & BEUMER, R.R. (1999). Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol., 50, 119–130.9. ELLIS E.M., WILLIAMS J.E., MALLINSON E.T., SNOEYENBOS G.H. & MARTIN W.J. (1976). Culture Methods for the Detection of Animal Salmonellosis and Arizonosis. Iowa State University Press, Ames, USA.10. EUROPEAN UNION (2003). Directive 2003/99/EC of the European Parliament and of the Council of 17 November 2003 on the monitoring of zoonoses and zoonotic agents, amending Council Decision 90/424/EEC and repealing Council Directive 92/117/EEC (Official Journal of the European Union: Legislation, 325 [12.12.2003], 31–40).11. EUROPEAN UNION (1995). Council Directive 95/53/EEC of 25 October 1995 fixing the principles governing the organisation of official inspection in the field of animal nutrition.12. EWING W.H. (1986). Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae, Fourth Edition. Elsevier, New York, USA, London, UK, and Amsterdam, The Netherlands.Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 15
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