4. IV
Nuevo mecanismo de evasión a estrés
energético en melanoma
Memoria presentada por
Rosaura Esteve Puig
Para optar al grado de
Doctora por la Universitat de Barcelona
Tesis realizada en el Programa de Recerca en Oncologia Mèdica
Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron
dirigida por el Dr. Juan Ángel Recio Conde
Tesis adscrita en la Universitat de Barcelona
Facultat de Biologia
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular
tutorizada por la Dra. Maria Neus Carbó Carbó
Programa de Doctorado en Biomedicina
Bienio 2005-2007
Barcelona, Julio de 2011
Dr. Juan Ángel Recio Conde Dra. Maria Neus Carbó Carbó Rosaura Esteve Puig
Director Tutora Doctoranda
16. 6
ÍNDICE 6
Índice de figuras 10
Índice de tablas 14
ABREVIATURAS 15
Símbolos 22
INTRODUCCIÓN 23
CÁNCER 26
MELANOMA 28
Generalidades del melanoma 28
Aspectos clínicos 29
Biología del melanocito 29
Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del
melanoma 30
Progresión del melanoma cutáneo 31
Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma
maligno 33
MC1R 34
CdkN2A (p16INK4a
y p14ARF
) 34
PTEN 35
RAS 35
BRAF 35
LKB1/STK11 36
MITF 36
Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK 37
Vía de señalización PI3K/AKT/PKB 37
Otras vías de señalización 40
Tratamiento del melanoma 40
Dianas terapéuticas 41
BRAF 44
Generalidades del gen BRAF 44
BRAF mutante en tumores malignos y benignos 45
BRAF y melanoma 45
Senescencia y BRAF 46
Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia
tumoral 46
17. 7
LKB1/STK11 48
Generalidades del gen LKB1/STK11 48
Complejo LKB1:STRAD:MO25 49
LKB1 como multicinasa 50
LKB1 como supresor tumoral 51
Modificaciones postraduccionales de LKB1 52
Funciones de LKB1 53
Sensor del metabolismo energético 53
Control de la polarización celular 54
Control del ciclo celular 55
MODELOS DE MELANOMA MURINOS 55
OBJETIVOS 59
RESULTADOS 63
Identificación de fosfoproteínas implicadas en la señalización del Factor de
Crecimiento de Hepatocitos (HGF) mediante el análisis proteómico DIGE y MALDI
TOF/TOF 66
El HGF induce la fosforilación de LKB1S428
de manera dependiente de la vía de
señalización RAS/RAF/MEK/ERK/p90RSK
69
LKB1S428
se fosforila en respuesta a diferentes factores de crecimiento y se
encuentra constitutivamente fosforilada en líneas celulares de melanoma
mutantes en BRAFV600E
y en muestras tumorales 74
Las células de melanoma mutantes en BRAFV600E
tienen alterada la respuesta a
estrés metabólico 79
El tratamiento con factores de crecimiento induce el desacoplamiento del
complejo LKB1-AMPKα 84
El efecto oncogénico de BRAFV600E
induce el desacoplamiento del complejo LKB1-
AMPKα 90
La reconstitución de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 por la inhibición del
efecto oncogénico de BRAFV600E
en condiciones de estrés energético induce
apoptosis 93
18. 8
La apoptosis inducida por estrés metabólico tras la inactivación del oncogén
BRAFV600E
está mediada por miembros de la subfamilia BH3 98
La inhibición de la vía de RAS/MEK/ERK bajo estrés energético restaura la
respuesta a estrés energético en células de melanoma mutantes en NRASQ61R
99
Agonistas de AMPK como posibles terapias en cáncer 102
El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto
oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis
102
El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto
oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis
en células de melanoma mutantes en NRASQ61K
u otras mutaciones derivadas de
pacientes 106
DISCUSIÓN 111
CONCLUSIONES 125
MATERIALES Y MÉTODOS 129
Plásmidos 132
Generación de plásmidos 132
Diseño de los cebadores 132
Amplificación del gen de interés 133
Purificación del producto de la PCR y de la digestión enzimática 134
Defosforilación 134
Ligación 134
Transformación bacteriana 135
Maxipreps 135
Secuenciación del gen de interés clonado en el vector correspondiente
136
Generación de plásmidos mutantes 136
Generación de los plásmidos shRNA 137
Cultivos celulares 138
Líneas celulares 138
19. 9
Congelación 139
Tripsinización 139
Muestras tumorales 140
Reactivos y anticuerpos 140
Inhibidores, factores de crecimiento y fármacos 140
Anticuerpos para western blot 141
Anticuerpos para inmunoprecipitación 142
Transfección, infección retroviral y lentiviral 142
Transfección transitoria de plásmidos 142
Transfección transitoria de siRNA 143
Infección retroviral 143
Infección lentiviral 143
Purificación de fosfoproteínas 144
Análisis proteómico: DIGE y MALDI TOF/TOF 145
Inmunoprecipitación y Western Blot 146
Inmunoprecipitación 146
Western Blot 147
Ensayo de viabilidad celular y apoptosis 148
Ensayo de formación de colonias 149
Análisis de imagen 150
BIBLIOGRAFÍA 151
ANEXO 173
Figuras Anexo 176
Tablas Anexo 181
Publicación 194
20. 10
Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo
fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones
somáticas que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de
los procesos medioambientales que contribuyen en ésta 27
Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito 32
Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma 39
Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de
la organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios
funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína
LKB1 de Mus musculus 49
Figura 5I/ Representación gráfica de una parte del dendograma del cinoma
humano 50
Figura 1R/ Validación de los candidatos identificados por MALDI TOF/TOF
implicados en la señalización del HGF/c-Met 68
Figura 2R/ El HGF induce la fosforilación de LKB1S428
de manera dependiente de
la vía de señalización de RAS/MEK/ERK e independientemente de la línea
celular 70
Figura 3R/ El perfil de fosforilación LKB1S428
en respuesta al HGF a lo largo
del tiempo correlaciona con el perfil de fosforilación de p90RSK
(T359/S363) y
de ERK1/2T202/Y204
71
Figura 4R/ La inhibición total de MEK1/2 suprime los niveles de fosforilación
de ERK1/2, de p90RSK
y de LKB1 71
Figura 5R/ La defosforilación del residuo Ser431 de Lkb1 está mediada por
fosfatasas de residuos Ser/Thr 72
Figura 6R/ La inhibición total de p90RSK
suprime parcialmente los niveles de
fosforilación de Lkb1S431
73
21. 11
Figura 7R/ El residuo Ser431 murino/Ser428 humano de LKB1 se fosforila en
respuesta a distintos factores de crecimiento 74
Figura 8R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E
muestran una
fosforilación constitutiva de la Ser428 de LKB1 75
Figura 9R/ Correlación positiva entre los niveles de fosforilación de LKB1 y
de ERK1/2 en muestras tumorales murinas 76
Figura 10R/ Los tumores de mama HER-2 positivos presentan elevados niveles de
fosforilación de la Ser428 de LKB1 respecto los tumores HER-2 negativos 77
Figura 11R/ Las muestras tumorales de carcinoma endometrial respecto las
muestras normales del paciente presentan elevados niveles de fosforilación de
la Ser428 de LKB1 78
Figura 12R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E
presentan
una mínima respuesta a estrés energético, y la anulación del efecto
oncogénico de BRAF mediante el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126)
recupera la respuesta a estrés energético 80
Figura 13R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAF en las líneas
celulares de melanoma BRAFV600E
aumenta la respuesta a estrés energético por
AICAR 81
Figura 14R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E
mediante el
tratamiento con sorafenib o el silenciamiento génico de BRAF restaura la vía
de estrés energético en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E
82
Figura 15R/ La inhibición de p90RSK
en las líneas celulares de melanoma
BRAFV600E
no restaura la vía de estrés energético 84
Figura 16R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPK 86
Figura 17R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα
independientemente de la actividad catalítica de LKB1 y dependientemente de
la integridad del residuo Ser428 de LKB1 88
Figura 18R/ AMPKα se une directamente o indirectamente al dominio C-terminal
de LKB1 89
22. 12
Figura 19R/ La inhibición de la señalización de BRAFV600E
reasocia los
complejos de LKB1-AMPKα en respuesta a estrés energético 91
Figura 20R/ El efecto oncogénico de BRAFV600E
induce la disociación del
complejo LKB1-AMPKα 92
Figura 21R/ La restauración de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en las células
de melanoma BRAFV600E
por la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E
induce
apoptosis en condiciones de estrés energético 94
Figura 22R/ Las células de melanoma BRAFV600E
se sensibilizan a estrés
energético a partir de las 4 horas de tratamiento por inhibición del efecto
oncogénico de BRAFV600E
presentando un mecanismo apoptótico independiente de
p53 96
Figura 23R/ AMPK (AMPKα1 y AMPKα2) se encuentra implicado en la restauración
de la vía de estrés energético y en la activación de la apoptosis bajo estrés
energético 97
Figura 24R/ Miembros de la subfamilia BH3 median la apoptosis inducida por la
inactivación del efecto oncogénico de BRAFV600E
bajo estrés metabólico 98
Figura 25R/ La inhibición del efecto oncogénico de NRASQ61R
permite la
restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 100
Figura 26R/ La sensibilización a la apoptosis en células de melanoma mutantes
en NRASQ61R
está mediada por la restauración de la vía de estrés energético
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 101
Figura 27R/ Restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
en respuesta a metformina e inhibición de la vía de RAS 103
Figura 28R/ Citotoxicidad en las líneas celulares de melanoma humanas BRAFV600E
y NRASQ61R
en respuesta a metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS
105
Figura 29R/ Restauración de la vía de estrés energético en células de
melanoma NRASQ61K/WT
derivadas de pacientes mediante el tratamiento que combina
la metformina/phenformin junto la inhibición de la vía de RAS 107
23. 13
Figura 30R/ Restauración de la vía de estrés energético en las líneas
celulares de melanoma NRASQ61K
derivadas de pacientes en respuesta a
metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS 108
Figura 1D/ Modelo de restauración del metabolismo «normal» en melanoma.
Restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 por la
inhibición de la vía de RAS en condiciones de estrés energético induce
apoptosis 115
Figura 2D/ Modelo de la señalización oncogénica de BRAFV600E
, NRASQ61R
, u otras
alteraciones en la actividad de los receptores tirosina cinasa en cáncer
118
Figura 3D/ Modelo de regulación negativa de la actividad de la vía de
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediado por la señalización oncogénica de BRAFV600E
o
NRASQ61R
120
Figura 1A/ Esquema del procedimiento experimental de purificación de
fosfoproteínas y del análisis proteómico; e imagen del gel DIGE de los
complejos de fosfoproteínas purificados en respuesta al Factor de Crecimiento
de Hepatocitos (HGF) 176
Figura 2A/ Listado de parte de los candidatos identificados implicados en la
señalización del HGF/c-Met por espectometría de masas (MALDI TOF/TOF) 177
Figura 3A/ El inhibidor de MEK1/2 U0126 no tiene efecto sobre la activación
de AMPKα a las concentraciones de 1µM hasta 10µM 178
Figura 4A/ Las líneas celulares de melanoma murinas y humanas silenciadas de
manera estable para LKB1 muestran que tan sólo una pequeña población de LKB1
se modifica en respuesta al HGF 179
24. 14
Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno 33
Tabla 1A/ Modelos murinos de melanoma 181
Tabla 2A/ Secuencias de los oligonucleótidos o cebadores utilizados para el
clonaje y para la mutagénesis dirigida 183
Tabla 3A/ Características de los vectores plasmídicos generados 184
Tabla 4A/ Líneas celulares y sus características 186
Tabla 5A/ Anticuerpos específicos para WB e inmunoprecipitación (IP) 189
28. 18
A
ADN Ácido Desoxiribonucleico
AKT3 Oncogén viral del timoma murino AKT homólogo 3 (proteína cinasa
B, gamma), del inglés v-akt murine thymoma viral oncogene
homolog 3 (protein kinase B, gamma)
AMP Adenosina monofosfato, del inglés adenosine monophosphate
AMPc Monofosfato de Adenosina Cíclico, del inglés cyclic Adenosine
3’-5’-Monophosphate o cAMP
AMPK Proteína Cinasa Activada por 5’-AMP, siglas del inglés 5’-AMP
activated Protein Kinase
ARN Ácido Ribonucleico
ARNm Ácido Ribonucleico mensajero, del inglés messenger ribonucleic
acid (mRNA)
ATM Del inglés Ataxia-Telangiectasia-Mutated
ATP Trifosfato de Adenosina, del inglés Adenosine Triphosphate
B
BCL-2 Del inglés B-Cell Leukaemia/lymphoma 2
BRAF Oncogén viral de sarcoma murino, del inglés v-raf murine
sarcoma viral oncogene homolog B1
BRG1 Del inglés Brahma/SWI2-Related Gene 1
BSA Albúmina Sérica Bovina, del inglés Bovine Serum Albumin
C
CDK Cinasa Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin Dependent
protein Kinases
CdkN2A Inhibidor de Cinasas Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin-
Dependent Kinase inhibitor 2A
CDS Secuencia codificante, del inglés coding sequence
CREB Elemento de respuesta de unión a AMPc, del inglés cAMP-
Responsive Element Binding
D/E
DIGE Electroferesis Bidimensional Diferencial Cuantitativa en Gel
con tinción Fluorescente, del inglés Fluorescence 2-D
Difference In Gel Electrophoresis
DMEM Del inglés Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Del inglés Dimethyl sulfoxide
EGF Factor de Crecimiento Epidérmico, del inglés Epidermal Growth
Factor
29. 19
EGFP Proteína de Fluorescencia Destacadamente Verde, del inglés
Enhanced Green Fluorescent Protein
ERK Cinasa Regulada por señales Extracelulares, del inglés
Extracellular-signal Regulated Kinase
F
FACS Del inglés Fluorescence Activated Cell Sorting
FBS Suero Fetal Bovino, del inglés Fetal Bovine Serum
FGF Factor de Crecimiento de Fibroblastos, del inglés Fibroblast
Growth Factor
FITC Isotiocianato Fluorescente, del inglés Fluorescein
Isothiocyanate
Forskolin Forskolin es un extracto que proviene del Coleus forskohlii,
7β-Acetoxy-8,13-epoxy-1α,6β,9α-trihydroxylabd-14-en-11-one
G
GFP Proteína Verde Fluorescente, del inglés Green Fluorescent
Protein
GP Genes virales gag (matriz, cápside y nucleocápside), y pol
(integrasa y transcriptasa reversa)
GPCR Receptor con 7 dominios transmembrana Acoplado a la Proteína G,
del inglés G Protein Coupled Receptor
GST Del inglés Glutathione-S-Transferase
H
HER-2 Receptor de tipo 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano,
del inglés Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
HGF Factor de Crecimiento de Hepatocitos, del inglés Hepatocyte
Growth Factor
HIF1α Del inglés Hypoxia Inducile Factor 1 alpha
Hsp90 Del inglés Heat-shock protein 90
I/J/K/L
IFN-α Interferón alpha, del inglés Interferon-α
IGF-1 Factor de Crecimiento similar a la Insulina de tipo 1, del
inglés Insulin like Growth Factor
IP Inmunoprecipitación
KD Inactividad catalítica de la cinasa, del inglés kinase dead
LKB1 Del inglés Liver Kinase B1 o Serine/threonine kinase 11 (Stk11)
30. 20
M/N
MAPK Del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase
MC1R Receptor de la Melanocortina de tipo 1, del inglés Melanocortin
Type 1 Receptor
Metformin 1,1-Dimethylbiguanide hydrochloride, fármaco antidiabético
MITF Factor de transcripción asociado a la microftalmia, del inglés
Microphtalmia-associated Transcription Factor
MO25 Del inglés Mouse protein 25
MSH-α Hormona Estimulante del Melanocito de tipo alpha, del inglés
Melanocyte Stimulating Hormone-alpha
mTOR Del inglés mammalian Target Of Rapamycin
NRAS Oncogén viral RAS de neuroblastoma, del inglés neuroblastoma
RAS viral oncogene homolog
NSCLC Del inglés Non-Small Cell Lung Carcinoma
O/P/Q
OA Del inglés okadaic acid, aislado en Halichondria okadai
OIS Oncogén inductor de senescencia, del inglés Oncogene-Induced
cellular Senescence
PBS Tampón Salino, del inglés Phosphate Buffered Saline
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa, del inglés Polymerase
Chain Reaction
PDGF Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas, del inglés
Platelet Derived Growth Factor
PDGFRβ Receptor-β del Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas,
del inglés Platelet Derived Growth Factor Receptor-β
PJS Del inglés Peutz-Jeghers Syndrome
PKA Del inglés Protein Kinase A
pRb Proteína del Retinoblastoma, del inglés Retinoblastoma protein
PTEN Fosfatasa lipídica PTEN, del inglés Phosphatase and Tensin
homolog
PVDF Fluoruro de Polivinilideno, del inglés polyvinyledene fluoride
R/S
RAF Del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene
RGP Fase de Crecimiento Radial, del inglés Radial-Growth Phase
RHEB Del inglés Ras Homologue Enriched in Brain
RTK Receptor Tirosina Cinasa, del inglés Receptor Tyrosine Kinase
S Fase de síntesis del ciclo celular
SCF Factor de Célula Madre, del inglés Stem-Cell Factor
31. 21
SDS-PAGE Electroforesis en gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato, del
inglés Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
Ser Serina, del inglés serine
shRNA Del inglés small hairpin ribonucleic acid
siRNA Del inglés small interfering ribonucleic acid (RNA)
STK11 Cinasa 11 de residuos serina y treonina, del inglés
Serine/Threonine Kinase 11 o LKB1
STRAD Del inglés STE20-Related Adaptor
T
TB Del inglés Terrific Broth
TBS Del inglés Tris Buffered Saline
TBST TBS-0,1%Tween
TERT Transcriptasa Reversa de la Telomerasa, del inglés Telomerase
Reverse Transcriptase
Thr Treonina, del inglés Threonine
Tm Temperatura de fusión, del inglés melting Temperature
TNFα Factor alpha de Necrosis Tumoral, del inglés Tumor Necrosis
Factor-alpha
TPA Promotor Tumoral de Éster-Forbol, del inglés Phorbol-ester
Tumor Promoter
TPM1 Tropomiosina de tipo 1
Tyr Tirosina, del inglés Tyrosine
TYR Tirosinasa
U/V
UV Ultravioleta, del inglés Ultraviolet
VEGF Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR-2 Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2
VGP Fase de Crecimiento Vertical, del inglés Vertical-Growth Phase
W/X/Y/Z
WB Del inglés Western Blot
wt Tipo Salvaje, del inglés wild type
32. 22
A Alanina
AA Aminoácido
D Ácido aspártico
Da Dalton
E Ácido glutámico
ºC Grados Celsius
h Hora
K Lisina
kb Kilobase
KDa Kilo Dalton
µg Microgramo
min Minuto
µl Microlitro
ml Mililitro
µM Micro Molar
M Molar
ng Nanogramo
nm Nanómetro
pb Pares de bases nucletotídicas
% Porcentaje o tanto por ciento
Q Glutamina
R Arginina
rcf o g Fuerza de centrífuga relativa, del inglés Relative Centrifugal
Force or g-force
rpm Revoluciones por minuto
S Serina
T Treonina
U Unidad/unidades
V Valina
V Volt
Algunas de las siglas y abreviaturas se describen en su lengua de origen, el inglés, y
figuran con la tipología en cursiva, por no tener una clara traducción a la lengua
castellana, o ser ésta poco empleada.
36. 26
CÁNCER
El cáncer es una enfermedad biológica y clínicamente compleja que engloba a
más de 100 enfermedades distintas con diversos factores de riesgo.
Responsable de una de cada ocho muertes en todo el mundo1
y de una de cada
cinco en Estados Unidos2
.
Los diferentes tipos de cáncer comparten una patogénesis común, representando
cada uno de ellos el resultado de un proceso de evolución Darwiniano. Así,
inspirado en la teoría evolutiva, los primeros pasos del desarrollo
neoplásico tumoral son debido a un proceso de selección natural. De modo que
la inestabilidad genómica produce poblaciones celulares genéticamente
distintas, generándose así, clones agresivos emergentes con distintos grados
de metástasis como restultado final del proceso evolutivo3,4
.
De manera genérica, la tumorogenésis implica múltiples pasos limitados al
mismo linaje celular, que tiene como resultado la conversión de una célula
normal en una tumoral. Esta conversión se basa en dos procesos, la
adquisición continua de alteraciones genéticas y la selección natural que
actúa sobre la diversidad fenotípica resultante (Figura 1I (Introducción)).
En muchos cánceres, la regulación de las moléculas implicadas en la
señalización celular se encuentra alterada, afectando a otras proteínas y a
distintos procesos biológicos celulares. De este modo, la mayor parte de los
tumores adquieren un conjunto de mutaciones ventajosas que son reflejo de los
efectos de los mutágenos internos de la propia célula, y de los mutágenos
externos a la célula. Consideramos mutágenos internos los defectos en la
reparación del ADN que contribuyen en incrementar la carga mutacional5
, y
mutágenos externos los factores medioambientales que participan activamente
en el aumento del riesgo de cáncer. Consecuentemente, estos efectos en el
genoma de la célula normal provocan transformaciones en la célula tumoral
maligna que permiten una proliferación celular autónoma no restrictiva, fase
conocida como expansión clonal que puede desencadenar una fase de invasión
tumoral fuera de los límites del tejido normal, hasta llegar a una fase
metastática a órganos distantes. Además, en el genoma de la célula tumoral se
han descrito mutaciones que se seleccionan durante el inicio de los procesos
terapéuticos, confiriendo una resistencia al tratamiento (Fig.1I). También
indicar que el ambiente tumoral crea unas condiciones de estrés, como son los
bajos niveles de oxígeno y de nutrientes, y los elevados niveles de productos
residuales tóxicos que proceden del metabolismo celular tumoral, donde las
37. 27
células tumorales se adaptan para sobrevivir, se transforman en un fenotipo
tumoral resistente a la muerte celular, e incluso prometastático.
Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo
fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones somáticas
que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de los procesos
medioambientales que contribuyen en ésta6
.
Las mutaciones pueden ser adquiridas mientras el linaje celular es fenotípicamente normal,
reflejo de las mutaciones intrínsicas adquiridas y de los efectos de los mutágenos exógenos
durante la división celular normal. Así, el ADN de las células normales se encuentra
continuamente dañado por los mutágenos de origen interno y externo, pero la mayor parte de
este daño se repara. En contra, durante el desarrollo del cáncer los defectos en la
reparación del daño al ADN pueden contribuir en la carga mutacional de la célula tumoral5
.
En azul mutaciones intrínsecas, en naranja mutaciones por exposición a mutágenos externos
medioambientales, en rojo mutaciones dirigidas, en gris mutaciones que confieren resistencia a
la quimioterapia.
En la tumorogénesis, el genoma de la célula tumoral maligna adquiere seis
alteraciones esenciales como son la autosuficiencia a las señales de
crecimiento, la insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento, la
evasión del programa de muerte celular, la adquisición del potencial de
replicación ilimitado, la sostenida angiogénesis, la invasión a tejidos y la
metástasis7
.
Además, se ha añadido una séptima alteración esencial en el genoma de la
célula tumoral8
, la adquisición de un metabolismo aberrante, descrita por Otto
Warburg en 19569
y revisada recientemente, donde se sugiere que puede ser
clave en el tratamiento del cáncer. Según Warburg, las células tumorales
pueden obtener la misma cantidad de energía de la fermentación como de la
respiración9
, utilizando una cantidad muy elevada de glucosa. Así, las células
tumorales utilizan diez veces más de glucosa respecto las células normales,
metabolizándola principalmente a lactato bajo condiciones normales de
38. 28
oxígeno, proceso denominado glucólisis aeróbica, ya que «fermentan» en
presencia de oxígeno. No obstante, en células normales la fermentación o
glucólisis es un proceso bioenergético ineficiente comparado con la
respiración o fosforilación oxidativa mitocondrial. Así, la glucólisis
aeróbica es un fenómeno característico de las células tumorales, necesario
para sostener el elevado índice de proliferación, y asegurar el crecimiento y
la división celular, procesos que requieren una fuente extra energética y
nutricional.
De este modo, la alteración del metabolismo celular de la célula tumoral
junto a las seis alteraciones descritas previamente, permiten retratar de
manera más completa el fenotipo transformante maligno. De manera que algunas
de las nuevas aproximaciones terapéuticas actuales en cáncer son terapias que
consisten en dianas implicadas en la transformación metabólica tumoral, que
en la actualidad se están investigando en ensayos preclínicos y clínicos10
.
Otra subclase de alteraciones en cáncer son las mutaciones que confieren a
algunos tumores resistencia a la radioterapia y quimioterapia, alteraciones
que se pueden atribuir al metabolismo aberrante. De este modo, la
reactivación del metabolismo «normal» en el tumor podría resensibilizar a las
células tumorales, provocando un estado de quiescencia, y ser finalmente más
favorable a otras intervenciones.
MELANOMA
Generalidades del melanoma
El melanoma cutáneo es uno de los cánceres de piel menos frecuente, y
representa el más letal. Su incidencia ha aumentado en la población
occidental hasta triplicarse el número de casos en los últimos 30 años11,12
,
siendo la sexta causa de malignidad más frecuente en humanos11
.
Como ocurre en muchos cánceres, en el melanoma cutáneo existe una
predisposición genética y un riesgo asociado a ciertos agentes
medioambientales. De esta manera, el aumento de la incidencia del melanoma
cutáneo, y la elevada letalidad asociada a su progresión, ha motivado grandes
esfuerzos para definir los factores genéticos y medioambientales que conducen
a la génesis y a la progresión del melanoma.
El melanoma junto con el carcinoma de células basales y el carcinoma de
células escamosas comprenden los distintos tipos de cáncer de piel. Respecto
a su etiología en relación a los factores medioambientales, estudios
epidemiológicos revelan que el carcinoma de células escamosas y el de células
basales se encuentran asociados a la acumulación del daño al ADN mediado por
39. 29
la radiación ultravioleta (UV) a lo largo de la vida, mientras que el
melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a exposiciones de
radiación UV intensas e intermitentes.
En función del tipo de exposición a la radiación UV y su distribución
anatómica, el melanoma cutáneo se clasifica en diferentes tipos, como son el
melanoma de extensión superficial, el melanoma nodular, el melanoma
lentiginoso, el melanoma lentiginoso maligno, el melanoma mucoso acral, el
melanoma lentiginoso acral, y otros subtipos menos comunes como el nevus
celular maligno azul, el melanoma desmoplásico, y el melanoma nevoide.
Aspectos clínicos
Los signos clínicos clásicos del melanoma son la asimetría, la irregularidad
del perímetro, el color, el diámetro, la elevación, el sangrado y el índice
mitótico13
, signo añadido recientemente. Un examen regular de los signos
clínicos clásicos del melanoma permite el diagnóstico del melanoma en una
fase precoz, que junto una resección quirúrgica del melanoma hacen que el
tratamiento sea eficaz en un 80 % de los casos. Sin embargo, la deficiencia
de un examen regular de los signos clínicos del melanoma aumenta las
probabilidades que el primer diagnóstico de un melanoma maligno cutáneo
corresponda a un melanoma de fase avanzada. Desgraciadamente, la inexistencia
de terapias eficaces en el melanoma de fase avanzada conduce a un mal
pronóstico, con un índice de supervivencia de 6 meses; donde solamente un 5 %
de estos casos muestran un índice de supervivencia de 5 años14
. Estos datos
indican el requerimiento urgente de nuevas estrategias terapéuticas efectivas
para el melanoma.
Biología del melanocito
El melanoma cutáneo proviene de los melanocitos cutáneos, células pigmentadas
especializadas en la producción del principal pigmento responsable de la
coloración de la piel, denominado melanina. Los melanocitos cutáneos derivan
de la cresta neural y migran hasta la piel durante el desarrollo embrionario,
y éstos finalmente residen en los folículos pilosos y en la lámina basal de
la epidermis, donde se encuentran como células individualizadas intercaladas
entre los queratinocitos basales, existiendo una homeostasis regulada por los
queratinocitos15
.
En respuesta a la radiación UV, los queratinocitos secretan factores que
regulan la supervivencia, la diferenciación, la proliferación y la motilidad
del melanocito. Y además, estimulan la producción de melanina en los
melanocitos que tiene como resultado el bronceado de la piel. Concretamente,
en respuesta a la radiación UV los queratinocitos secretan la hormona
40. 30
estimulante del melanocito (MSH-α) que activa a la enzima adenilil ciclasa
(AC) a través de la vía de la activación del receptor de la melanocortina de
tipo 1 (MC1R) del melanocito, donde la vía MC1R es la vía de señalización
reguladora más importante de pigmentación. La activación del MC1R por MSH-α
promueve el aumento intracelular del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc),
que tiene como resultado la activación transcripcional de múltiples genes
diana, como el factor de transcripción de la microftalmia (MITF), de la
tirosinasa (TYR) y de otras enzimas necesarias para la síntesis de melanina16
.
Así, los melanocitos tienen una función protectora clave en la piel frente al
daño al ADN por efecto de la radiación UV.
En la biología del melanocito, el AMPc juega un papel muy importante en la
proliferación y en la diferenciación, donde el AMPc activa la vía de ERK de
manera dependiente de RAS y de BRAF17,18
. La señalización por AMPc promueve la
fosforilación de CRAF, la incapacidad de unión a RAS, y finalmente su
inactividad19,17
. Por este motivo, los melanocitos utilizan BRAF como efector
principal de RAS, y de manera semejante, los melanocitos malignos presentan
predominantemente mutaciones en BRAF y no en CRAF.
Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del
melanoma
En el melanoma, como en la mayoría de cánceres, los factores de riesgo
incluyen componentes genéticos y medioambientales.
El melanoma es un tumor heterogéneo y con una elevada complejidad genética
que incluye lesiones genéticas como la pérdida de supresores tumorales y/o la
activación de oncogenes. Además, existen elementos genéticos adicionales que
dirigen el proceso de melanomagénesis.
El melanoma se encuentra asociado a la radiación solar, uno de los agentes
carcinogénicos esencial para el desarrollo de lesiones premalignas en la
piel. Por consiguiente, la exposición a la radiación solar se encuentra
fuertemente implicada en la etiología del melanoma maligno cutáneo, siendo el
máximo responsable la porción de radiación UV que proviene del espectro
solar. La radiación solar está compuesta por radiación visible, infrarroja y
UV, entre otras. Existen tres tipos de radiación UV, radiación UV de tipo A
(UV-A, 400-320nm), UV-B (320-290nm) y UV-C (290-200nm), donde únicamente las
radiaciones de tipo UV-A y UV-B alcanzan la superficie terrestre. La
radiación UV-A y UV-B ejercen muchos tipos de efectos sobre la piel,
incluyendo el bronceado, la carcinogénesis, la inmunomodulación y la
producción de vitamina D.
El aumento de la incidencia de melanoma se ha asociado epidemiológicamente
con la disminución del grosor de la capa de ozono estratosférica durante
estos últimos 30 años20,21
, ya que la reducción de la capa de ozono ocasiona un
41. 31
aumento de la radiación UV-A y UV-B en la superfície terrestre22
, causando
efectos mutagénicos y carcinogénicos sobre la piel23
. Así, la mayor exposición
y el aumento de la intensidad en la superficie terrestre de la radiación UV
inducirían un mayor daño al ADN de los melanocitos, y facilitarían
potencialmente la melanomagénesis. En este sentido, estudios epidemiológicos
indican que una elevada e intensa exposición a la radiación UV,
particularmente en neonatos, puede tener como consecuencia un aumento de la
formación de melanomas cutáneos malignos24,25
. En cambio la exposición
acumulativa y crónica a la radiación UV a lo largo de la vida se puede
encontrar asociada al desarrollo de otras formas de cáncer de piel, como son
los carcinomas de células escamosas.
Progresión del melanoma cutáneo
El melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a mutaciones críticas
en los genes reguladores del crecimiento, como los onocogenes BRAF y NRAS, y
en los genes reguladores del ciclo celular, como el gen CdkN2A que codifica
dos supresores tumorales p16INK4a
y p14ARF
. También se encuentra asociado a la
producción autocrina de los factores de crecimiento, como son el factor de
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de crecimiento que
deriva de plaquetas de tipo A (PDGF-A) y el factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF); a la pérdida de los receptores de adhesión que contribuyen
en la disrupción de la señalización intracelular de los melanocitos, como la
molécula de adhesión celular en melanoma (MCAM) y E-cadherina; y en la
capacidad del melanocito a escapar de la regulación fisiológica que existe
por parte de los queratinocitos26
. Por lo tanto, la adquisición de las
mutaciones críticas citadas anteriormente en los melanocitos normales son
responsables del desarrollo y progresión del melanoma.
Así, existe un modelo de desarrollo y progresión del melanoma cutáneo
globalmente admitido. En una primera fase, los melanocitos pueden proliferar
y extenderse provocando la formación de un nevus (Fig.2I). Esta proliferación
en los melanocitos puede ser restrictiva en la epidermis, dando lugar al
nevus de adhesión epidérmico; en la dermis, formando el nevus dérmico; o en
ambos compartimientos, sucediendo el nevus compuesto. Los nevus son
generalmente benignos pero pueden progresar a la fase de crecimiento radial
del melanoma cutáneo (Radial Growth Phase, RGP), e incluso pueden dar lugar a
una lesión intraepidérmica con una microinvasión local de la dermis. Las
células de la fase RGP pueden progresar hasta llegar a la fase de crecimiento
vertical (Vertical Growth Phase, VGP), siendo el estadio más peligroso debido
al potencial metastático de las células. Así, entre otras características,
las células en VGP presentan una pérdida de expresión de E-cadherina, y un
42. 32
aumento de expresión de N-cadherina, características que confieren la
capacidad de invadir la dermis, e incluso pudiendo conferir la capacidad de
infiltrarse al sistema vascular y linfático (Fig.2I). No obstante, no todos
los melanomas cutáneos pasan por cada una de estas fases, ya que un 50 % de
los melanomas cutáneos no provienen de la progresión maligna del nevus.
Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito
(A) Piel normal. Con una distribución de los melanocitos dendríticos en la lámina basal de
la epidermis. (B) Nevus. Como primer estadio del melanoma, el nevus melanocítico benigno
presenta un aumento del número de melanocitos dendríticos. (C) Fase de crecimiento radial
(RGP) del melanoma. Se considera como la primera fase del melanoma maligno con la migración
de los melanocitos a la epidermis, formando nidos de melanocitos que no pueden penetrar la
membrana basal epidérmica. (D) Fase de crecimiento vertical (VGP) del melanoma maligno.
43. 33
Fase con un elevado potencial maligno y metastático, debido a la invasión de los
melanocitos en la dermis y a la capacidad de infiltración de los melanocitos al sistema
vascular linfático.
Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma
maligno
El melanoma es una enfermedad genéticamente compleja. Las alteraciones
genéticas más frecuentes en melanoma son los polimorfismos en el gen receptor
de la melanocortina de tipo 1 (MC1R)27,28,29,30
; las mutaciones en los oncogenes
como el oncogén viral del sarcoma murino RAF homólogo B1 (BRAF)31
y el oncogén
viral RAS de neuroblastoma (NRAS)31,32
; la sobreexpresión del oncogén viral del
timoma murino AKT homólogo 3 (AKT3)33
; las deleciones de los supresores
tumorales como el inhibidor de cinasas dependiente de ciclinas 2A (CdkN2A)34
,
la fosfatasa lipídica PTEN33,35
, el APAF-136
, el p5337
y el LKB138
; y además, la
amplificación de otros genes como la ciclina D139
y el factor de transcripción
asociado a la microftalmia (MITF)40
(Tabla 1I (Introducción)).
Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno
Tipos de genes Gen
Frecuencia (%)/
alteración en melanoma
Referencias
Oncogenes BRAF 50-70 % /mutado 31
NRAS 15-30 % /mutado 31,32
AKT3 Sobreexpresado 33
Supresores
tumorales
CDKN2A 30-70 % /delecionado, mutado o
silenciado
34
PTEN 5-20 % /delecionado o mutado 33,35
APAF-1 40 %/ silenciado 36
p53 10 % /pérdida o mutado 37
Stk11 (LKB1) 10 % /mutado 38
Otros Ciclina D1 6-44 % /amplificado 39
MC1R polimorfismos 27,28,29,30
MITF 10-16 % /amplificado 40
El resultado de numerosas investigaciones en los últimos años, indican que la
vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK y la vía de señalización PI3K/AKT son las
vías de señalización más importantes en el desarrollo y mantenimiento del
melanoma. Estas vías de señalización son reguladoras claves en la
proliferación del melanoma. De este modo, la vía de RAS/RAF/MEK/ERK se
encuentra hiperactivada en un 90 % de los melanomas humanos presentando
mutaciones en el oncogén BRAF con un 50-70 %, o en NRAS con un 15-30 %, y la
vía de PI3K/AKT se encuentra hiperactivada por la pérdida del supresor
tumoral PTEN con un 5-20 % (Tabla 1I). Sorprendentemente, una única mutación
en estas vías de señalización no es suficiente para promover el desarrollo
44. 34
del melanoma, pero la combinación de mutaciones en ambas vías de señalización
promueve la melanomagénesis32,17,41
.
Además, destacar que el factor de transcripción asociado a la microftalmia
(MITF), considerado por ser un regulador clave en la biología del melanocito,
se encuentra amplificado con una frecuencia de un 16 % de los melanomas
humanos40
.
Receptor de la melanocortina de tipo 1 (MC1R)
El riesgo de melanoma se modula por alteraciones en los patrones de
pigmentación de la piel, debido a alteraciones genéticas que pueden tener una
función en la formación del melanoma y por exposición a la radiación UV.
Dentro de las alteraciones más comunes en los patrones de pigmentación de la
piel se ecuentran los polimorfismos del MC1R y las amplificaciones en MITF.
MC1R es un regulador clave en la diferenciación, proliferación y pigmentación
del melanocito. MC1R es un receptor con 7 dominios transmembrana acoplado a
la proteína G (GPCR) que se expresa en los melanocitos epidérmicos. MSH-α es
el ligando del MC1R, responsable de estimular la formación de AMPc a través
de la vía del MC1R. Concretamente, MSH-α se une al MC1R que estimula al AC,
induciendo la producción de AMPc42
, y los altos niveles de AMPc fosforilan y
activan a la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB). CREB
activa transcripcionalmente a varios genes, incluyendo a MITF43,44
, que activa
transcripcionalmente a un grupo de genes que catalizan la conversión de la
tirosina (Tyr) en melanina45
.
La región que codifica por el MC1R humano es altamente polimórfica, y se
conocen tres variantes del MC1R, MC1R R151C, R160W y D294H asociadas al
aumento del riesgo de melanoma debido a una sensibilidad a los efectos
citotóxicos de la radiación UV, como es el aumento de la generación de los
radicales de oxígeno27,28,29,30
. Adicionalmente, estudios epidemiológicos muestran
una correlación entre la presencia de las variantes de MC1R, y de los genes
CdkN2A y BRAF, comúnmente mutados en melanoma46,47,27,48
.
CdkN2A (p16INK4a
i p14ARF
)
El locus CdkN2A se asocia fuertemente al desarrollo del melanoma. Los
melanomas familiares presentan mutaciones germinales de CdkN2A con una
frecuencia del 30-70 % 34
(Tabla 1I).
El gen CdkN2A codifica dos supresores tumorales p16INK4a
y p14ARF (49)
. El supresor
tumoral p16INK4a
inhibe la actividad cinasa de la proteína cinasa dependiente
de ciclina 4/6 (CDK4 y CDK6, respectivamente), uniéndose y secuestrando a
CDK4 y CDK6, y previniendo así la fosforilación de la proteína del
Retinoblastoma (pRb)50
que tiene como resultado la inhibición de la progresión
del ciclo celular. El supresor tumoral p14ARF
estabiliza a p53 mediante la
45. 35
inhibición de la degradación por HDM2, ligasa E3 de ubicuitinas específica
para p5351,52,53,54
.
En el melanoma familiar, el gen CdkN2A generalmente se encuentra mutado
alterando únicamente al supresor tumoral p16INK4a
, o ambos supresores tumorales
p16INK4a
y p14ARF
. Además, este gen también se encuentra mutado en muchos
melanomas esporádicos. La inactivación de p16INK4a
por mutaciones puntuales,
deleciones, metilación del promotor o por silenciamiento transcripcional
promueve la liberación de CDK4 y CDK6 que se unen a ciclina D1 y a pRb, donde
pRb fosforilada por CDK4 y CDK6 libera el factor de transcripción E2F
promoviendo la transición de la fase G1 a la fase de síntesis (S) del ciclo
celular (Fig.3I). Así, la vía de señalización p16INK4a
/pRb es un regulador
clave de la senescencia del melanocito, y en consecuencia, la inactivación de
esta vía conduce a la progresión del ciclo celular contribuyendo en el
proceso de melanomagénesis.
PTEN
La pérdida del supresor tumoral PTEN se detecta aproximadamente entre un 5-20
% de las lesiones melanocíticas33,35
(Tabla 1I). PTEN es una fosfatasa lipídica
que inhibe la activación de AKT por PI3K (Fig.3I). El gen PTEN reside en la
región del cromosoma 10q, una área cromosómica comúnmente delecionada en
melanoma, siendo PTEN una de las dianas somáticas más alteradas de la vía de
PI3K/AKT. La pérdida de PTEN conduce a la hiperactivación de la vía de PI3K
afectando a procesos biológicos importantes como son la supervivencia
celular, proliferación, crecimiento (como aumento de la masa celular) y
motilidad.
En el melanoma las deleciones en PTEN pueden ser concomitantes a mutaciones
en BRAF, pero no con mutaciones en NRAS55
.
RAS
El oncogén RAS activa las vías de señalización RAF/MEK/ERK y PI3K/AKT, ambas
vías son efectoras de RAS e importantes en el desarrollo del melanoma
(Fig.3I). La activación mutacional del oncogén RAS se asocia entre un 15-30 %
al melanoma humano (Tabla 1I), y además, destacar que las mutaciones en NRAS
y BRAF son mutuamente excluyentes en el melanoma56
. Las mutaciones en el gen
RAS se producen más frecuentemente en la isoforma NRAS. Concretamente, la
mutación más predominante en NRAS es la sustitución de una glutamina (Q) por
una leucina (L) en la posición 61 (NRASQ61L
)31
.
BRAF
Las mutaciones somáticas en el gen BRAF prevalecen en el melanoma. BRAF es el
principal componente más comúnmente mutado de la vía RAS/RAF/MEK/ERK, con una
46. 36
frecuencia entre el 50-70 % de los melanomas cutáneos (Tabla 1I). La mutación
más observada en BRAF es la sustitución de la valina (V) por un ácido
glutámico (E) en la posición 600 (BRAFV600E
)31
.
BRAFV600E
activa constitutivamente la señalización de ERK, responsable de la
estimulación de la proliferación y de la supervivencia, y esencialmente del
crecimiento tumoral y del mantenimento de las funciones biológicas celulares57
(Fig.3I). Paradójicamente, el efecto oncogénico de BRAFV600E
es insuficiente en
melanocitos para la conversión plenamente maligna, ya que la expresión del
mutante BRAFV600E
en melanocitos normales promueve senescencia58,59
, y el modelo
murino condicional para la expresión específica de BRAFV600E
en melanonitos
propuesto por Dankort y sus colaboradores desarrolla hiperplasias
melanocíticas benignas41
. Por el contrario, la expresión de BRAFV600E
combinada
con el silenciamiento del supresor tumoral PTEN desarrola melanomas con una
penetrancia del 100 %, y con metástasis observadas en nódulos linfáticos y
pulmón41
.
En función de las áreas expuestas a la radiación solar, existen claras
diferencias genéticas entre los distintos tipos de melanoma. Concretamente,
en los melanomas sin daño crónico inducido por la radiación solar poseen
frecuentemente mutaciones en el gen BRAF asociadas a la pérdida de PTEN, o
únicamente mutaciones en NRAS. Además, los melanomas que presentan mutaciones
en BRAF tienen un número menor de copias del supresor tumoral PTEN respecto
los melanomas con mutaciones en NRAS56
. Mientras que los melanomas con daño
crónico inducido por la radiación solar tienen raramente mutaciones en el gen
BRAF y frecuentemente muestran un aumento del número de copias de la ciclina
D1.
LKB1/Stk11
El gen LKB1 se localiza en el cromosoma 19p13.3. Codifica para una proteína
con actividad serina/treonina (Ser/Thr) cinasa y además, es un supresor de
tumores asociado al desarrollo de distintos tipos de cánceres humanos.
Concretamente, en el melanoma maligno cutáneo esporádico se ha detectado
mutaciones somáticas del gen LKB1/STK11 con una frecuencia del 10 %60,61,38
(Tabla 1I). En el melanoma primario y en el nevus melanocítico benigno, se
encuentra con una baja frecuencia la pérdida de heterozigosidad del cromosoma
19p, sugiriendo que podría ser LKB1 un gen relevante en el desarrollo y
progresión del melanoma maligno.
Factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF)
MITF tiene una función clave en el melanoma humano. Es uno de los genes más
importantes para la pigmentación, el crecimiento y la supervivencia del
melanocito, la transcripción de factores de diferenciación, y de numerosas
47. 37
enzimas de pigmentación 45
. MITF se expresa en muchos melanomas humanos, y es
un gen diana y un marcador de diagnóstico para esta enfermedad.
Existe una gran controversia acerca del mecanismo tumorigénico de MITF. Por
un lado, en líneas celulares de melanoma los niveles de expresión de MITF son
significativamente bajos, donde el aumento de los niveles de expresión de
MITF reduce la proliferación celular del melanoma e incluso en presencia del
oncogén BRAF62
. De este modo, estos niveles altos de expresión de MITF reducen
la tumorigenicidad de la célula de melanoma63
, predisponiendo la parada del
ciclo celular y la diferenciación a través del control de los reguladores del
ciclo celular como son p16INK4a
, CDK2 y p21Cip (45)
. Por otro lado, y de manera
crítica los bajos niveles de MITF también promueven apoptosis y parada del
ciclo celular.
Estudios recientes muestran que MITF coopera con BRAFV600E
en la
inmortalización de los melanocitos normales mediante la expresión de
distintas proteínas, como la transcriptasa reversa de la telomerasa (TERT),
el mutante dominante negativo de p53 (p53DD) o la proteína cinasa CDK4
activada40
. Así, se ha observando que entre un 10-16 % de los melanomas
malignos mutados en BRAF presentan amplificaciones de MITF, y contrariamente,
el 84-90 % restante de los melanomas malignos mutantes en BRAF se
caracterizan por una degradación de MITF mediada por la hiperactivación de
ERK.
Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK
La vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK regula las decisiones del destino
celular por debajo de receptores tirosina cinasa (RTK), citocinas y
receptores GPCR (Fig.3I). En melanocitos, esta vía de señalización se
encuentra activada por factores de crecimiento como el factor de célula madre
(SCF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el HGF64
.
Individualmente estos factores de crecimiento inducen una activación
transitoria de ERK, promoviendo un efecto mitogénico modesto. Así, la
desregulación de esta vía es clave para la proliferación celular del
melanoma, ya que un 90 % de los melanomas humanos presentan una
hiperactivación de ERK.
En el melanoma, la activación de ERK se puede producir por diferentes causas
que incluyen la producción autocrina de los factores de crecimiento65
,
raramente por mutaciones activantes del receptor del factor de crecimiento
como c-Kit66
o alteraciones mutacionales en los componentes de la vía de ERK.
El componente más comúnmente mutado de esta vía es BRAF, mutado en la
posición 600 (V600E)31
. BRAFV600E
estimula constitutivamente la señalización de
ERK, estimulando la proliferación y supervivencia; promoviendo el crecimiento
48. 38
tumoral; y el mantenimento de funciones esenciales57
. Paradójicamente, el
efecto oncogénico de BRAFV600E
es insuficiente para la conversión plenamente
maligna en melanocitos, ya que BRAFV600E
induce senescencia58,59
, lo que le ha
dado el atributo de oncogén inductor de senescencia celular (OIS).
Así, en la progresión del melanoma maligno el oncogén BRAFV600E
se encuentra
asociado al silenciamiento de uno o más genes supresores de tumores, siendo
los más comunes PTEN o CdkN2A40,67,17,68
. En referencia a este suceso,
recientemente se ha descrito que BRAFV600E
coopera con la pérdida de PTEN para
la inducción del melanoma metastático41
. Además, existen otros genes que
cooperan y se encuentran por debajo de BRAFV600E
, como son MITF62,69
, BRN-2,
ciclina D170
, p16INK4a (71,58)
, metaloproteínasa de matriz enzimática para el
mantenimiento tumoral (MMP-1)72
y sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS)69
.
Como se ha mencionado anteriormente, otro mecanismo frecuentemente asociado a
la activación de la vía de RAS/RAF/MEK/ERK son las mutaciones activantes en
NRAS. Donde se ha demostrado que el oncogén RAS que estimula las vías de
señalización que controlan la superivencia celular, la proliferación y la
diferenciación, puede inducir el melanoma en ratones deficientes en p16INK4a
.
De manera que RAS tiene una función relevante en el mantenimiento tumoral73,74
.
Además, a diferencia de los tumores BRAFV600E
, el oncogén RAS presenta más
opciones de supervivencia celular porqué activa a múltiples efectores de
distintas vías de señalización como ERK y PI3K67
(Fig.3I).
Vía de señalización PI3K/AKT/PKB
La vía de señalización PI3K regula multitud de respuestas biológicas
celulares como la supervivencia celular75,76
, la proliferación celular77,78,79
, el
crecimiento celular80
, el ciclo celular, la migración celular y la invasión de
la matriz extracelular81,82
. Por este motivo, esta vía se encuentra alterada en
una gran variedad de cánceres83
. Concretamente, se ha detectado la
hiperactivación de la vía de PI3K en una cierta proporción de melanomas,
donde un 3 % de las lesiones melanocíticas metastáticas poseen mutaciones en
PI3K84
; y un 5-20 % de los melanomas avanzados presentan la pérdida de función
del supresor tumoral PTEN, responsable de la hiperactivación de la vía de
PI3K35
. Además, se ha observado que AKT3 se encuentra sobreexpresado entre un
43-60 % de los melanomas esporádicos33
.
Curiosamente, en el melanoma no coinciden las mutaciones en NRAS y BRAF, o en
NRAS y PTEN, ya que son mutuamente excluyentes debido a que NRAS debido a que
se encuentra por encima de la vía de señalización de los componentes BRAF y
PI3K (Fig.3I). Así, la presencia del oncogén NRAS con mutaciones adicionales
en BRAF o en PTEN son innecesarias, ya que BRAF y PI3K siempre se
encontrarían activadas por el oncogén NRAS (Fig.3I).
49. 39
Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma
Esquema de las vías de señalización claves en melanoma. En la parte superior de la figura
se encuentran los fármacos que se han desarrollado para el tratamiento del melanoma y las
dianas para las diversas vías de señalización más importantes implicadas en el melanoma
maligno.
No obstante, las mutaciones en BRAF y PTEN son coincidentes en más de un 20 %
de los casos32
, donde la activación de ambas vías, la vía de señalización de
BRAF y de PI3K, cooperan para la estimulación de la proliferación (Fig.3I).
En experimentos in vitro donde reproducen el melanoma en cultivos
tridimensionales, se requiere la inhibición de las vías de señalización de
ERK y de PI3K para la supresión del crecimiento celular, demostrando que
estas dos vías de señalización son muy importantes en la melanomagénesis85
. De
acuerdo a este modelo, se observa que el oncogén transformante de melanocitos
RAS es más eficente respecto el oncogén BRAF67
, debido a que el oncogén RAS se
encuentra activando la vía de RAF/MEK/ERK y la vía de PI3K/AKT (Fig.3I).
Curiosamente, las mutaciones en BRAF son más frecuentes en melanoma respecto
las mutaciones en NRAS. Este hecho probablemente refleja otras presiones
genéticas y biológicas que se desconocen que favorecen la progresión del
melanoma con mutaciones prevalentes en BRAF respecto mutaciones en NRAS.
50. 40
Otras vías de señalización
Las alteraciones genéticas más importantes en melanoma que contribuyen a la
reducción de la apoptosis incluyen mutaciones en NRAS y BRAF; a la pérdida de
PTEN; a la sobreexpresión de AKT3, de limfoma 2 /leucemia de células B (BCL-
2), del factor nuclear κB (NF-κB); y a la activación de β-catenina. De este
modo, no sorprende que algunas de estas vías de señalización promuevan el
crecimiento, ya que existe una coordinación simultánea de las vías de
proliferación y de supervivencia celular con el crecimiento celular (Fig.3I).
Tratamiento del melanoma
El melanoma es una enfermedad extremadamente agresiva con un elevado
potencial metastático y con una resistencia notable a agentes citotóxicos.
Consecuentemente, las células de melanoma tienen bajos niveles de apoptosis
espontánea in vivo frente a otros tipos de células tumorales, y son
relativamente resistentes a la inducción de apoptosis inducida por fármacos
in vitro86
.
Esta resistencia a la apoptosis en melanoma coincide con el hecho que
aproximadamente un 70 % de los melanomas presentan mutaciones en BRAF.
Preferentemente, en melanoma se encuentra el mutante BRAFV600E
, responsable de
la activación de manera constitutiva de la vía MEK/ERK y de la inhibición de
la apoptosis mediante la regulación de los miembros de la familia BH3 a
través de la activación dependiente de ERK87
.
Muchos fármacos quimioterapéuticos se utilizan para la inducción de apoptosis
en células malignas. Pero en melanoma la resistencia a la apoptosis
desencadena una resistencia farmacológica86
, y por este motivo actualmente
existe una gran barrera para el tratamiento del melanoma debido a esta
extraordinaria resistencia a la quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia.
La mayoría de los protocolos terapéuticos aprovados para el melanoma maligno
se reducen a terapias adyuvantes postoperatorias. El interferón alpha (IFN-α)
es una de las inmunoterapias adyuvantes utilizada más común, aunque su
eficacia es cuestionable. La dacarbazina (DTIC) es una referencia como agente
quimioterapéutico para el tratamiento del melanoma avanzado, y fármacos como
la carmustina (BiCNU), paclitaxel (Taxol), temozolomida y cisplatino se usan
como agentes únicos con actividad en cánceres metastáticos88
.
Desafortunadamente, todas estas terapias son ineficaces, contribuyendo poco
en la supervivencia del paciente, y por lo tanto, la identificación de nuevas
vías de señalización centrales en la iniciación y progresión del melanoma es
una nueva área excitante de investigación para el tratamiento del melanoma.
51. 41
Así, conocer y entender la biología del melanoma da la oportunidad de
desarrollar terapias dirigidas.
Dianas terapéuticas
Las dianas tumorales más atractivas son aquellas que hacen a la célula
cancerígena dependiente de la progresión tumoral. De manera que esta
dependencia muchas veces recae en la adicción de la célula tumoral al
oncogén, debido a que le da una fuerte hiperactivación de la vía de
señalización respecto a la célula normal. Así, debido a la fuerte dependencia
de les células cancerígenas a los oncogenes, éstas presentan una mayor
sensibilidad a la inhibición de los oncogenes frente las células normales
(Fig.3I). Sin embargo, no todos los oncogenes pueden ser dianas tratables,
pero las enzimas como las cinasas, las proteasas y las fosfatasas son
altamente estudiadas, porqué éstas poseen un dominio catalítico con profundos
bolsillos, susceptible de ser inhibido catalíticamente (Fig.3I). Los fármacos
se diseñan contra este dominio catalítico, de manera que la unión selectiva
al dominio catalítico inhibe la actividad enzimática del oncogén. Por este
motivo, las cinasas NRAS y BRAF son dianas terapéuticas validadas en melanoma
y tienen un notable interés. Los primeros fármacos utilizados en clínica
dirigidos contra la vía de señalización de RAS, fueron los inhibidores
farnesil transferasa de RAS, diseñados para bloquear una modificación
postraduccional esencial en RAS89
. Aunque estos fármacos no resultaron muy
específicos, éstos se pudieron combinar con cisplatino, mejorando su
eficacia90
.
Posteriormente, se generó el inhibidor multicinasa sorafenib o BAY 43-9006
(Nexavar
, Bayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven, CT, USA) que
inicialmente fue desarrollado como inhibidor de las cinasas de Ser/Thr de RAF
(CRAF y BRAF)91
. Pero resultados de distintos estudios in vitro mostraron que
el inhibidor sorafenib tiene como dianas BRAF, CRAF y receptores de tirosina
cinasa del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y del factor de
crecimiento que deriva de plaquetas (PDGF)91
. Sorafenib previene el
crecimiento tumoral mediante la combinación de dos actividades antitumorales,
la inhibición de la proliferación celular tumoral y de la angiogénesis
tumoral. Así, sorafenib ejerce un efecto farmacológico dual que sugirió en el
año 2006 que este componente podría ser potencialmente efectivo en un amplio
rango de cánceres, especialmente en aquéllos que estuviesen vascularizados.
Como monoterapia, sorafenib muestra una modesta actividad contra el melanoma,
donde su IC50 en humanos es de aproximadamente 5µM92
, siendo inefectiva en
pacientes con melanoma. En ensayos farmacocinéticos monoterapéuticos del
52. 42
sorafenib muestran una IC50 por encima de 5µM92
. Sin embargo, la combinación
con carboplatina y paclitaxel presenta un resultado más esperanzador93
.
Aunque BRAF sea el centro para el desarrollo de fármacos de RAF, otras
isoformas de RAF no pueden ser obviadas, ya que BRAF activa a CRAF en células
de mamífero94
; y pese a que CRAF no se requiere para la activación de MEK en
la presencia del mutante BRAFV600E
, éste se requiere para la proliferación
celular57
. Además, cuando en el melanoma se encuentran mutaciones activantes
en RAS, el responsable de la activación de MEK es CRAF y no BRAF17
. Por lo
tanto, estos hechos sugieren que los fármacos para los diversos RAF
(panspecific Raf drugs) podrían ser mejores agentes antimelanoma respecto los
fármacos específicos para BRAF.
Posteriormente, se iniciaron ensayos clínicos con el inhibidor BRAF CHIR-265
para el melanoma cutáneo. En la actualidad, existen distintos inhibidores de
segunda generación de BRAF como son RAF265 (Novartis)95
, XL281
(Exelixis/Bristol Myers Squibb)96
, AZ628 (AstraZeneca)97
, SB-590885
(GlaxoSmithkline) y PLX-4720 (Plexxikon/Roche)98
.
Un nuevo fármaco para el tratamiento del melanoma metastático es el PLX-4032
de estructura análoga a PLX-4720 (Plexxikon Inc and Hoffman-La Roche Ltd). Es
un inhibidor selectivo de la cinasa mutada BRAF, desarrollado para el
tratamiento de los cánceres con mutaciones activantes en BRAF, concretamente
para el mutante BRAFV600E
, inhibiendo así a BRAFV600E
con una IC50 de 13nM98
. En la
actualidad, PLX-4032 se utiliza en investigaciones clínicas de fase II y fase
III, siendo uno de los fármacos para el tratamiento de melanoma con más
expectativas99,100,101,102
.
Una alternativa a estos fármacos son los que tienen como diana a MEK1/2, como
PD0325901 y AZD6244, responsables de la inhibición in vitro de la
proliferación, de la formación de colonias en agar y de la invasión en
matrigel de células de melanoma humanas mutantes en BRAFV600E
. Y estos fármacos
son efectivos in vivo contra el melanoma mutante BRAFV600E
de ratones
xenografts103
. Además, las células de melanoma BRAF mutantes son más sensibles
a los inhibidores de MEK respecto las células de melanoma RAS mutantes104
. Por
lo tanto, las células mutantes en BRAF son más adictivas a la señalización de
MEK, respondiendo mejor a la inhibición de MEK respecto las células mutantes
en RAS. Los fármacos AZD6244 y PD0325901 fueron testados en ensayos clínicos
en pacientes con melanoma avanzado105,106,107
.
En referencia a la inhibición de esta vía de señalización, también se utilizó
la toxina letal del ántrax para la degradación selectiva e inactivación de
MEK1 y MEK2108
, la cuál fue testada en ensayos clínicos.
53. 43
Otra vía de señalización diana importante para el tratamiento del melanoma es
la vía de PI3K, que tiene como agentes diana las proteínas PKB, AKT y otros
componentes por debajo de la vía de señalización de PI3K, como la diana de
mamífero rapamicina (mTOR). Los inhibidores de mTOR como CCI-779 o RAD001 son
los más avanzados, ya que inhiben mTOR, PTEN, y PI3K/AKT. Así, la correcta
combinación de inhibidores de mTOR con otras dianas terapéuticas podría ser
muy beneficiosa en determinados pacientes, debido a que ambas vías de
señalización RAS/ERK y PI3K/AKT contribuyen en la supervivencia celular del
melanoma. Por este motivo, es interesante la combinación de los fármacos anti
RAS/ERK y anti PI3K/PKB con fármacos que induzcan apoptosis, como los
fármacos anti NF-κB o BCL-2 como señales de supervivencia.
La pérdida de función de p16INK4a
en multitud de melanomas, aseñalan CDK4 y
CDK6 como otras dianas potencialmente terapéuticas. Los inhibidores pan CDKs
como los flavopiridol son ámpliamente inactivos y no hay ninguna evidencia de
la actividad clínica en el melanoma maligno, pero éstos podrían ser efectivos
en algunos pacientes, porqué la inhibición de las CDKs preferencialmente
suprime la expresión del ARNm de proteínas antiapoptóticas. Así, la
combinación de estos fármacos con otros agentes terapéuticos podrían ser una
oportunidad para tratar el melanoma.
Otras aproximaciones serían el uso de agentes diana que se encuentran en
diversas vías de señalización. Como la chaperona o proteína de choque
caliente 90 (Hsp90) que regula el plegamiento y la función de nuevas
proteínas sintetizadas, como por ejemplo de muchas proteínas cinasa como
CRAF, BRAF, CDK4 y CDK6. La inhibición de la Hsp90 por la anisomicina
benzoquinona (17AAG) causa la degradación de las proteínas que requieren la
presencia de Hsp90 para su estabilidad y/o función, a través de la
señalización al proteasoma dependiente de la ubicuitinización.
Sorprendentemente, la inhibición de la Hsp90 no promueve altos niveles de
toxicidad, ya que debido a que la Hsp90 es una chaperona que regula a
muchísimas proteínas, se esperaba una alta toxicidad. De manera importante,
el mutante BRAFV600E
respecto a BRAF salvaje (wt) parece ser más sensible a la
inhibición de la Hsp90 por 17AAG, pero 17AAG también es diana de las
proteínas BRAF y CRAF wt que se encuentran por debajo del oncogén RAS109,110
.
Así, 17AAG como diana de muchas proteínas de distintas vías de señalización,
es un tratamiento que no aumenta la sensibilidad en las células de melanoma
mutantes para BRAF. Y de manera semejante, la inhibición del proteasoma
mediante PS-341 demostró una mínima actividad del fármaco contra el melanoma
in vitro e in vivo111
.
54. 44
Así, mejorar el entendimiento de la biología del melanoma es ahora una nueva
y excitante aproximación terapéutica.
BRAF
Generalidades del gen BRAF
BRAF (del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) es una
proteína cinasa citoplasmática específica de residuos Ser y Thr, y es uno de
los miembros de la familia de proteínas cinasa RAF (v-raf murine sarcoma
viral oncogene). La familia RAF consta de tres miembros, ARAF, BRAF y CRAF112
.
Es uno de los componentes de cinasas reguladas por señales extracelulares
(ERK) de la vía de señalización mitogen-activated protein kinase
(MAPK)113,114,57
. Los productos genéticos de RAF son los efectores de RAS, los
cuales participan en la vía de señalización de las MAPK y conectan las
señales extracelulares con la regulación transcripcional. Las proteínas RAF
(MAPKKKs) se reclutan en la membrana plasmática, y las cinasas RAF son
activadas por una serie de fosforilaciones y defosforilaciones. Las proteínas
RAF activas fosforilan y activan a MEK1 y MEK2 (MAPKKs), las cuales
fosforilan y activan seguidamente a ERK1 y ERK2 (MAPKs). Finalmente, éstas
fosforilan diversas dianas citoplasmáticas y nucleares, incluyendo los
factores de transcripción Ets-1, c-Jun y c-Myc. Así, estos múltiples pasos en
la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK proporcionan un mecanismo de
amplificación de señal.
BRAF respecto ARAF y CRAF, en lugar de presentar residuos Tyr en la posición
448 y 449, codifica por residuos de ácido aspártico (D448
y D449
,
respectivamente), mimetizando tirosinas fosforiladas. Así, la activación de
BRAF requiere pocos pasos de fosforilación. De manera relevante, BRAF es la
única proteína de la familia RAF que se encuentra frecuentemente mutada en
cáncer, probablemente debido a que la activación constitutiva de BRAF
requiere pocos sucesos mutacionales.
BRAF se encuentra mutado en multitud de tumores humanos, incluyendo el
melanoma con un 70 %, el cáncer de colon, de tiroides, de carcinoma de ovario
y algunos sarcomas con un porcentaje menor31,115
, datos que estimulan el estudio
intensivo de este gen. A lo largo de estos últimos 8 años, se han
identificado en la proteína BRAF 35 aminoácidos diana mutados en melanoma116
.
El aminoácido mutante diana más predominante en BRAF, que representa un 95 %
de todas las mutaciones de BRAF en melanoma, es la valina en posición 600. La
mutación en el aminoácido valina consiste por el cambio de la timina por una
alanina en la posición nucleotídica 1799, resultado de la sustitución del
residuo valina (V) por un glutamato (E) en la posición aminoacídica 600 de la
55. 45
proteína BRAF (BRAFV600E
). Se cree que esta mutación mimetiza la fosforilación
de los residuos T599
/S602
que se encuentran flanqueando la posición 600,
causando así la activación constitutiva de BRAF.
BRAF mutante en tumores malignos y benignos
BRAF es un oncogén que dependiendo del contexto celular puede actuar como un
clásico oncogén inductor de senescencia celular. De modo que por un lado
BRAFV600E
mutante puede actuar como oncogén promoviendo una fuerte
proliferación celular, y por otro lado como OIS promoviendo la parada del
ciclo celular.
El oncogén BRAFV600E
se puede encontrar en distintos tipos de melanomas junto
con la adquisición de mutaciones adicionales en otros genes117
. Concretamente,
en un 50-70 % de los casos de melanoma cutáneo son BRAFV600E
mutante, donde
BRAFV600E
es responsable de la estimulación constitutiva de la vía de
señalización RAF/MEK/ERK, de la proliferación independiente de factores de
crecimiento y de la transformación de los melanocitos normales en inmortales.
También se puede encontrar BRAFV600E
en un 82 % de los nevus benignos118
,
lesiones melanocíticas benignas que permanecen inalterables a lo largo del
tiempo. De esta manera, en los nevus benignos BRAFV600E
se comporta como un OIS
debido a la exposición continua de la activación de la señalización
RAF/MEK/ERK, sugiriendo que la mutación única en BRAF es insuficiente para la
transformación oncogénica maligna.
Así, mientras BRAFV600E
estimula la proliferación celular en melanoma, en
melanocitos induce senescencia.
BRAF y melanoma
En melanocitos el factor transcripcional MITF se encuentra por debajo del
control de señales dependientes de BRAF para la producción de melanina en
respuesta a MSH-α, y además, los niveles de MITF se encuentran
significativamente disminuídos en los melanocitos respecto las células de
melanoma.
Así, en melanocitos normales BRAF puede ser activado por la vía de AMPc,
teniendo un papel clave en la proliferación y diferenciación del melanocito,
ya que el AMPc activa la vía de ERK a través de la vía dependiente de RAS y
de BRAF. De manera que por un lado, la vía de AMPc a través de PKA promueve
la fosforilación dependiente de CRAF, causando la incapacidad de unión de RAS
con CRAF y la inactivación de CRAF, y por otro lado, la vía de AMPc induce la
activación de BRAF. Como consecuencia, probablemente los melanocitos normales
utilizan preferentemente BRAF como principal efector de RAS, y de manera
56. 46
similar en células de melanoma se encuentran frecuentemente mutaciones en
BRAF y no en CRAF. De este modo, mutaciones en RAS excluyen mutaciones en
BRAF, pero no en CRAF.
Senescencia y BRAF
La senescencia es el mecanismo clave de protección celular contra el cáncer,
provocando la parada irreversible de la proliferación celular debido a una
proliferación extensa, una activación oncogénica o por algún tipo de estrés
celular119,120
.
Las células tumorales presentan una proliferación celular aberrante y no
entran en estado de senescencia, debido a la inactivación de las vías de
señalización claves como son las vías de los supresores tumorales p16INK4a
/pRb
y p53.
Intrigantemente, BRAF se encuentra mutado por encima del 80 % de los nevus
benignos118
, y aunque muchos de los nevus permanezcan indolentes durante
décadas pueden progresar raramente en melanoma. Sin embargo, BRAF se
encuentra frecuentemente mutado en los melanomas cutáneos malignos, indicando
que la molécula BRAF se comporta como un OIS en los nevus benignos, y como
oncogén en el melanoma cutáneo maligno, paradoja desarrollada anteriormente.
Se conoce que BRAFV600E
induce la expresión del supresor tumoral p16INK4a
induciendo senescencia en melanocitos primarios humanos in vitro71,58
, y por
el contrario, en ratones deficientes del p16INK4a
el efecto oncogénico de
BRAFV600E
es esencial para la transformación de los melanocitos llegando a la
inducción del melanoma maligno74
.
Así, estos estudios sugieren que la pérdida del p16INK4a
contribuye en la
transformación del melanocito normal al melanocito mutante en BRAFV600E
o
célula de melanoma. Por lo tanto, para la progresión del melanoma se requiere
la inactivación de la vía p16INK4a
y pRb, ya que la adquisición de las
mutaciones en NRAS o BRAF promueven una hiperproliferación y una consecuente
senescencia mediada por el supresor tumoral p16INK4a
.
Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia
tumoral
La vía de transducción de señales RAF/MEK/ERK és una vía evolutivamente
conservada que estimula la supervivencia celular, y la proliferación celular
mediante la coordinación del crecimiento celular y de la división celular. De
manera relevante, un 30 % de los cánceres humanos tienen alterada la vía de
RAF/MEK/ERK, donde la activación constitutiva de uno de los componentes de la
vía de señalización de ERK media la estimulación de la proliferación celular
57. 47
y la protección frente la apoptosis o muerte celular, controlando la
actividad y la abundancia de los miembros de la familia BCL-2 para promover
la supervivencia celular.
La familia BCL-2 consta de proteínas proapoptóticas y de proteínas
prosupervivencia. Las proteínas proapoptóticas se subdividen en dos
subfamilias, la subfamilia de las proteínas BAX o BAK; y la subfamilia de
BAD, BIK/NBK, BID, BIM/BOD y BMF. Las proteínas proapoptóticas BCL-2
presentan únicamente un dominio BH3, y éstas se encuentran formando complejos
con las proteínas prosupervivencia, reflejo de la regulación en respuesta al
estrés energético o a las señales de supervivencia celular.
Las proteínas prosupervivencia son las BCL-2, BCL-xL, y MCL-1, que presentan
un dominio BH1-3 que puede unirse al dominio BH3 de la otra familia de
proteínas proapoptóticas. Frecuentemente, la expresión de las proteínas
prosupervivencia BCL-2 se encuentra elevada en tumores, y en tumores
asociados a una pobre prognosis y resistencia terapéutica121
.
De manera importante, la señalización de ERK regula las proteínas BCL-2 para
promover la supervivencia. Pues la activación de ERK puede reprimir los
niveles del ARNm de BIM122
, puede fosforilar a FOXO3A, e inducir su degradación
por el proteasoma123
; y consecuentemente reprimir la transcripción de la
proteína proapoptótica BIM. Más recientemente, se ha demostrado que la
activación de ERK puede inhibir la unión de la forma extra larga de BIM a
miembros de la familia de prosupervivencia BCL-2, como son BCL-xL y MCL-1124,124
.
También la activación de ERK puede promover la ubicuitinización y la
degradación de la proteína proapoptótica BAD por el proteasoma, mediante la
fosforilación de BAD en la Ser 112 de manera dependiente de p90RSK
(RSK)125
. Los
factores de crecimiento que utilizan la vía de ERK estabilizan y aumentan la
expresión de las distintas proteínas BCL-2 de supervivencia, siendo
notablemente las proteínas BCL-2, BCL-xL y MCL-1126
. Las proteínas de la
familia BCL-2 tienen un lugar de unión a CREB en la región reguladora 5', y
pueden ser fosforidas por RSK o MSK, cinasas dependientes de ERK, que
fosforilan y activan a CREB127
.
De manera adicional, la expresión de los mutantes HRAS, MEK2, PI3K o PKB
protegen a la célula del proceso de anoikis mediante una reducción en los
niveles de ARNm de BMF128
.
Así, el oncogén BRAF aumenta la resistencia a apoptosis inducida por agentes
quimioterapéuticos, promoviendo la fosforilación e inactivación dependiente
de ERK de las proteínas proapoptóticas BAD y BIM. En coherencia con estos
hechos, la inhibición del oncogén BRAF provoca la estabilización de BIM y la
58. 48
defosforilación de BAD, que tiene como resultado la inducción de la
apoptosis. En cambio, la inhibición de la vía de PI3K no promueve una
acumulación dramática de las proteínas proapoptóticas BIM y BAD, ni una
activación de BIM, ni una defosforilación de BAD. De esta manera, se sugiere
que la activación constitutiva de ERK como resultado de mutaciones en la vía
de RAS/RAF/MEK/ERK, modifica directamente la señalización de muerte celular a
través de la fosforilación e inactivación de BAD y BIM, respectivamente129
.
LKB1/STK11
Generalidades del gen LKB1/STK11
LKB1/Stk11 es una cinasa de tipo B1 de residuos Ser/Thr del hígado, conocida
como una proteína supresora de tumores, donde su pérdida o alteración fue
asociada originalmente al síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), enfermedad
hereditaria de carácter autosómico dominante130,131
. LKB1 es uno de los genes
más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos como en
cáncer de pulmón132
, de cérvix133
, de piel38
, de mama, de páncreas, de próstata y
de ovario. Concretamente, entre un 15-35 % de los casos de cáncer de pulmón
humano esporádico presentan lesiones en LKB1, particularmente en múltiples
subtipos de carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)132
. Además,
recientemente se han encontrado mutaciones somáticas en un 20 % de los
carcinomas de cérvix133
y mutaciones somáticas en un 10 % de los melanomas
malignos cutáneos esporádicos38
.
LKB1 se localiza en el brazo pequeño del cromosoma 19, concretamente en la
región 19p13.3134
. Su estructura génica consta de 10 exones, donde 9 de ellos
son codificantes, pudiéndose encontrar dos variantes por splicing
diferencial. Las dos proteínas son productos del mismo gen LKB1, cuyas
diferencias residen en la secuencia aminoacídica del extremo carboxi terminal
de la proteína LKB1. La isoforma pequeña es LKB1s, producto de los exones del
1 al 8 y del exón 9a, isoforma de 48KDa. La otra isoforma es más larga,
nombrada LKB1L, producto de los exones del 1 al 8 y del exón 9b, isoforma de
50KDa135
.
Así, LKB1L humano consta de 433 residuos aminoacídicos, y en ratón de 436. En
el extremo N-terminal posee un dominio regulador (residuos del 1 al 48) y una
señal de localización nuclear entre los residuos 38-43. Es una proteína con
actividad cinasa en residuos Ser/Thr, cuyo dominio catalítico se situa entre
los residuos 49-309, y su dominio regulador en el extremo C-terminal entre
los residuos 310-436 (Fig.4I).
59. 49
Complejo LKB1:STRAD:MO25
En su forma activa, LKB1 se encuentra formando un complejo con dos proteínas,
la pseudocinasa adaptadora relacionada con STE20 (STRADα o STRADβ) y la
proteína adaptadora de ratón 25 (MO25α o MO25β). Este complejo
heterotrimérico le confiere a LKB1 la actividad catalítica y la translocación
del núcleo al citoplasma. En los complejos, estas tres moléculas
LKB1:STRAD:MO25 se encuentran presentes en cantidades equimolares
semejantes136
.
LKB1 se une a STRADα a través del dominio catalítico, donde la interacción
promueve la actividad catalítica cinasa in vivo de LKB1 y la translocación de
LKB1 del núcleo al citoplasma137
.
MO25α se une al complejo LKB1:STRAD a través de STRAD, y tiene una función
muy importante en la estabilización del complejo al citoplasma celular,
promoviendo la actividad catalítica de LKB1.
LKB1 se localiza en el núcleo y en el citoplasma. De manera que LKB1 posee
una señal de localización nuclear (NLS) muy conservada, donde la mutación o
carencia de la NLS provoca la incapacidad de entrada de LKB1 al núcleo y la
completa función de LKB1 como supresor tumoral138,139
, sugiriendo que la
Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de la
organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios
funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína
LKB1 de Mus musculus
En rojo se representa los lugares de autofosforilación, en gris los lugares de
fosforilación por otras cinasas y en verde la farnesilación de la cisteína 433 (C433).
60. 50
localización citoplasmática de LKB1 es importante para su función como
supresor tumoral140
.
LKB1 como multicinasa
LKB1 es una máster cinasa localizada en el centro del dendograma del cinoma
humano141
, que en su forma activa forma el complejo LKB1:STRAD:MO25, y es capaz
de fosforilar y activar a otras cinasas o proteínas.
La búsqueda de sustratos de LKB1 que median su función como supresor tumoral
permitió identificar a la proteína cinasa activada por 5'-AMP (AMPK) como
sustrato directo de LKB1143,144,145
. AMPK es un heterotrímero, compuesto por una
subunidad catalítica (AMPKα) y dos subunidades reguladoras (AMPKβ y AMPKγ).
AMPK se activa cuando los niveles intracelulares de ATP disminuyen y los
niveles intracelulares de AMP aumentan, debido a una privación de nutrientes
o hipoxia146,147,148
. Análisis bioquímicos y genéticos en distintas especies
(Drosophila melanogaster, Mus musculus...) mostraron que LKB1 es la cinasa
que fosforila a AMPKα y que activa el T-loop en condiciones de estrés
energético143,149
. LKB1 fosforila directamente y activa a AMPK, un sensor del
metabolismo central que regula el metabolismo de los lípidos, del colesterol
y de la glucosa en tejidos metabólicos especializados, como el tejido
hepático, adiposo y muscular. Así, AMPK coordina las actividades celulares
anabólicas y catabólicas en células normales y en células
transformantes150,151,152
.
Figura 5I/ Representación
gráfica de una parte del
dendograma del cinoma humano
LKB1 se localiza en el centro del
dendograma del cinoma humano. LKB1
fosforila y activa a AMPK (AMPKα1
y AMPKα2) y puede fosforilar el T-
loop de todos los miembros de la
subfamilia AMPK (NUAK1, NUAK2,
BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK,
MARK1, MARK2/3 i MARK4)142
.
Representados en color los
sustratos para LKB1, en gris los
que no son sustratos para LKB1.
61. 51
LKB1 como cinasa de residuos Ser/Thr fosforila a AMPKα en el residuo Thr 172,
en consecuencia activa a AMPK en respuesta a las alteraciones en los niveles
energéticos intracelulares y en la disponibilidad de nutrientes, controlando
el crecimiento celular y el metabolismo celular.
Adicionalmente, LKB1 es capaz de fosforilar y activar a 13 cinasas de la
subfamilia de la proteína cinasa AMPK, un total de 12 cinasas humanas NUAK1,
NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 y MELK,
relacionadas con AMPK142
(Fig.5I). De manera singular, 4 de las 14 cinasas son
miembros de la familia de proteínas asociadas a microtúbulos (microtubule-
associated protein, MAP) y de la familia de las cinasas microtubule affinity-
regulating kinase (MARK), requiriéndose en los estadios tempranos
embrionarios, y siendo claves en el establecimiento de la polaridad celular153
.
LKB1 como supresor tumoral
Primeramente, LKB1 fue descrito como supresor tumoral, ya que es uno de los
genes más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos.
Además, se observó que la sobreexpresión de la proteína LKB1WT
en líneas
celulares que no expresan endógenamente LKB1, como son la línea celular de
melanoma humano G361 y la línea celular de cáncer de cérvix humana HeLa,
tienen como resultado la parada del ciclo celular en la fase G1154
.
En estos últimos años, los estudios de LKB1 muestran que participa en nuevas
vías de señalización que podrían enlazar el metabolismo celular con el
control del crecimiento celular y en la polaridad celular. Así, LKB1 y AMPK
controlan el crecimiento celular y el metabolismo celular, y ambas proteínas
tienen funciones conservadas en la polaridad celular, donde la disrupción de
estos procesos están implicados en la carcinogénesis. De manera relevante, en
todas las células el requerimiento fundamental es el acoplamiento de la
disponibilidad de nutrientes con las señales extracelulares, y que únicamente
los factores de crecimiento estimulan la proliferación si los nutrientes son
suficientes para garantizar la división celular, procesos donde LKB1
participa. Así, LKB1 podría ser el nuevo enlace directo que conectara el
metabolismo celular con el cáncer.
En relación a su capacidad como supresor tumoral, otros estudios muestran que
los mutantes inactivos para el dominio catalítico de LKB1, mutantes aislados
a partir de los pacientes con PJS, se localizan única y exclusivamente al
compartimiento nuclear y son incapaces de inhibir la proliferación celular.
Por lo tanto, se asume que la actividad catalítica intrínseca de la cinasa de
Ser/Thr de LKB1 se requiere para el bloqueo de la división celular.
62. 52
Asimismo, LKB1 tiene una función clave en el desarrollo embrionario temprano
en mamíferos. Así, los ratones que carecen de las dos copias de alelos LKB1 o
LKB1-/-
son inviables a partir del 8,5-11 días del embrión, debido a la
deficiencia en la vasculogénesis, en el desarrollo de la placenta, en el
cerramiento del tubo neural y entre otras155
. Pero de manera importante, un
estudio realizado en ratones con una única copia del alelo LKB1 (LKB1+/-
)
muestra que estos ratones a las 45 semanas de edad desarrollan pólipos en el
tracto gastrointestinal, donde los análisis histológicos revelan que los
pólipos gastrointestinales son remarcablemente semejantes a los de los
pacientes con PJS156,157,158,159
. Además, estos ratones LKB1+/-
que desarrollan
pólipos muestran una pérdida del alelo de LKB1WT (159)
, sugiriendo que la pérdida
total de LKB1 se requiere para la formación del pólipo, siendo éste un
supresor tumoral.
Modificaciones postraduccionales de LKB1
LKB1 se fosforila en 8 residuos (Fig.4I), y la fosforilación de estos
residuos no tienen efecto sobre la actividad catalítica cinasa de LKB1. El
residuo Ser 428 de LKB1 humano (LKB1S428
) se fosforila en respuesta a elevados
niveles de AMPc a través de la cinasa PKA160,161
, en respuesta al EGF a través
de la cinasa p90RSK (162)
, o por PKCζ163,164
.
La mutación de la Ser 428 por una alanina en LKB1 (LKB1S428A
), mutación que
impide la fosforilación de este residuo, tiene como consecuencia la supresión
de la proliferación celular en ser sobreexpresado este mutante en la línea
celular G361. Resultados que sugieren que la fosforilación de la Ser 428 es
esencial para la inhibición de la proliferación celular en la línea celular
G361 que no expresa LKB1 endógeno originariamente160
. Por el contrario, las
mutaciones en la Ser 31 y 325, y la Thr 366 de LKB1 no tienen ningún efecto
sobre la capacidad de suprimir la proliferación celular en G361161
.
De manera singular, la fosforilación del residuo Thr 366 es diana única en
las células expuestas a la radiación ionizante y a la radiación UV. La
irradiación induce el daño al ADN, y por consiguiente provoca la activación
de la cinasa Mutante-Ataxia-Telangiectasia (ATM) responsable de la
fosforilación in vivo de la T366 de LKB1138
. Además, se conoce que en respuesta
al daño al ADN por irradiación, LKB1 se une en el dominio N-terminal de unión
a sustratos de la proteína ATM165
.
LKB1 presenta una secuencia aminoacídica consenso para la prenilación. Esta
secuencia está conservada en Xenopus y Drosophila, pero no en Caenorhaditis
elegans. Esta forma de prenilación se farnesila y raramente se
geranilgeranilila. La fosforilación del residuo S431 murino/S428 humano por
63. 53
PKA, y la prenilación de la cisteína 433 de LKB1 son esenciales para la
regulación de la polaridad celular166
.
Funciones de LKB1
LKB1 es una cinasa multifunción con un potencial ilimitado orquestando la
actividad celular. De esta manera, LKB1 tiene un papel clave en el
metabolismo energético intracelular, regulando la respuesta a estrés
metabólico y la proliferación celular a través de la vía LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2/mTORC1167,168,169
. Además, como ya se ha indicado, LKB1 es importante en la
inducción de la polaridad celular170
, teniendo una función central en la
polarización de las células epiteliales171
, y en el control del ciclo celular,
mediando la parada del ciclo celular en G1 por inducción de la expresión de
p21 dependientemente de p53140
.
Sensor del metabolismo energético
LKB1 es una cinasa multifunción implicada en el metabolismo celular y en la
proliferación celular a través de la regulación de la cinasa de estrés
metabólico AMPK. De este modo, LKB1 como sensor del metabolismo energético
regula la vía de estrés y de proliferación LKB1/AMPK a través de la
fosforilación del acetil coenzima A carboxilasa (ACC) y de los supresores
tumorales, como son Tuberous Sclerosis 2 (TSC2) y p53167,168,169
.
El descubrimiento de LKB1 como cinasa reguladora de AMPK, fue un dato
relevante que enlazó dos procesos íntimamente relacionados, la tumorogénesis
y la regulación del metabolismo energético. Conexión sugerida por Otto
Warburg9
, aproximadamente hace unos 60 años.
Durante el estrés metabólico energético el índice de AMP/ATP intracelular
aumenta, y estos cambios se detectan mediante el sensor LKB1, que en
respuesta a estrés energético se activa la vía de estrés LKB1/AMPK
disminuyendo el consumo de energía celular para la inhibición de las vías
anabólicas como la síntesis proteica, y aumentando la producción de energía
por la activación de las vías catabólicas como la glucólisis y la oxidación
de ácidos grasos. La AMPK puede ser fosforilada y activada por LKB1143,144,145
y
por la proteína Ca2+
-calmodulin-dependent protein kinase kinases
(CaMKKs)172,173,174
, existiendo distintas vías de señalización alternativas que
pueden activar a AMPK.
LKB1 fosforila y activa directamente al residuo Thr 172 que se encuentra en
la región T-loop de la subunidad catalítica α de AMPK, esta modificación es
absolutamente esencial para la actividad catalítica de AMPK142
. Así, el aumento
de los niveles celulares de AMP activan al sensor energético LKB1, que activa
a la cinasa AMPK que inhibe directamente a mTORC1 a través de la
64. 54
fosforilación de Raptor175
. También se ha descrito que altos niveles celulares
de AMP activan a AMPK, responsable de la fosforilación de los sustratos
TSC1/TSC2 que inhiben a Rheb y por último a mTORC1176,177,167
. TSC1/TSC2 y Rheb
tienen una función importante en la activación de la vía de mTORC1,
activación que sucede debido a la pérdida de los supresores tumorales PTEN,
NF1, LKB1 o p53. Concretamente, TSC2 inhibe indirectamente a mTORC1 a través
de la regulación de las pequeñas GTPasas Ras homologue enriched in brain
(RHEB), ya que la pérdida de TSC1 o TSC2 promueve la hiperactivación de
mTORC1178
. Así, la vía de mTORC1 regula el crecimiento celular incluyendo la
síntesis proteica, la biogénesis ribosomal, la angiogénesis y la autofagia a
través de los efectores por debajo de mTORC1. Los efectores por debajo de
mTORC1 son el regulador de traducción de proteína de tipo 1 de unión al
factor de iniciación de traducción eucariota 4E (4EBP1), y la cinasa 1
ribosomal S6 (S6K1) que contribuyen en la regulación de la traducción de
proteínas dependiente de mTORC1179
. También podemos encontrar que mTORC1
controla la traducción de reguladores del crecimiento celular como la Ciclina
D1, el Factor Inducible de Hipoxia 1 alpha (HIF1α) y de Myc, que a su vez
promueven procesos como la progresión del ciclo celular, crecimiento celular
y angiogénesis180
. De este modo, no es sorprendente encontrar en líneas
celulares de melanoma la activación de la vía de mTORC1181
.
Control de la polarización celular
LKB1 es un regulador de polaridad celular conservado evolutivamente.
Primeramente, LKB1 fue descrito en la regulación de la polaridad en
Caenorhabditis elegans, conocido como PAR-4. En distintos estudios
describieron que PAR-4 se requiere para las divisiones asimétricas que
promueven la formación del eje anteroposterior del embrión primerizo. En
Drosophila melanogaster, LKB1 se identificó como un mutante de deleción donde
su carencia, pérdida de la localización posterior del ARNm materno de LKB1,
afecta al desarrollo del eje anteroposterior, mostrando defectos en la
polarización del citoesqueleto de microtúbulos. La capacidad de LKB1 como
regulador de la polaridad celular se encuentra conservada en células de
mamífero, como las células neuronales y las células epiteliales pancreáticas.
Esta capacidad se encuentra mediada por la translocación de LKB1 del núcleo
al citoplasma a través de STRAD, de esta manera, puede inducir polaridad
celular en células intestinales no polarizadas mediante la remodelación del
citoesqueleto de actina, la relocalización de la catenina p120 y la zona
occludens 1 a la formación de complejos de unión, y la clasificación de las
proteínas de superficie de los dominios apicales a los basolaterales171
.
Además, LKB1 se requiere en la migración neuronal y en la posición del
centrosoma182
.
65. 55
Control del ciclo celular
LKB1 se encuentra implicado en el control del ciclo celular, mediando la
parada del ciclo celular en la fase G1 por inducción de la expresión de p21,
resultado de la asociación de LKB1 al promotor p21 de manera dependiente de
p53140
. Contrariamente, otros estudios a partir del análisis del mutante para
el dominio catalítico de LKB1 que se caracteriza por encontrarse
exclusivamente en el núcleo e incapaz de ser relocalizado al citoplasma,
demostraron que el mutante para el dominio catalítico de LKB1 promueve la
expresión de proteínas necesarias para la transición del ciclo celular, como
son pRb, Ciclina E, y Ciclina A2, y además LKB1 media la parada en G1
independientemente de p21 y/o p53183
.
Otros trabajos documentan que LKB1 suprime el crecimiento tumoral debido a la
asociación de LKB1 con Brahma/SWI2-related gene 1 (BRG1), una asociación
necesaria para la inducción de la parada del ciclo celular184
.
MODELOS DE MELANOMA MURINOS
En esta última década, la secuenciación del genoma humano ha permitido
acelerar la investigación biomédica, su análisis genómico ha sido una
explosión de conocimiento en la biología y en la genética molecular del
melanoma, con la identificación de nuevas dianas y vías de señalización
críticas en la iniciación y en la progresión de esta enfermedad. Sin embargo,
en la actualidad el melanoma cutáneo es uno de los cánceres humanos que
presenta un elevado potencial metastático y una notable resistencia a agentes
terapéuticos86
. Datos que indican que la excelente selección de los oncogenes
y de las vías claves que intervienen en el desarrollo y progresión del
melanoma es extremamente importante para el éxito de las aproximaciones
terapéuticas.
Actualmente, la ingeniería genética aplicada en modelos animales ha permitido
entender mejor el desarrollo y progresión tumoral in vivo. Así, el diseño de
un excelente modelo de melanoma cutáneo maligno murino es clave para permitir
el test experimental directo de las distintas hipótesis para la búsqueda de
nuevas dianas moleculares y de exitosas aproximaciones terapéuticas.
El modelo ideal de melanoma murino debería recapitular la etiología de la
radiación UV, la histopatología y la cronología de los distintos estadios de
la progresión del melanoma cutáneo maligno humano, y mimetizar la genética
del melanoma humano a través de manipulaciones genéticas e inmunológicas.
Mayoritariamente, los modelos de melanoma de ratón existentes presentan
grandes dificultades para inducir el melanoma (Tabla 1A (Anexo)), típicamente
estos modelos desarrollan melanomas dérmicos y no muestran una similitud
66. 56
histopatológica de los estadios de la progresión del melanoma humano (Tabla
1A). Esto es debido a que desafortunadamente, la piel del ratón en neonatos y
en adultos presenta una localización y distribución de los melanocitos que no
coincide con la piel humana185,186
. Además, los melanocitos murinos son
altamente resistentes a la inducción del melanoma por radiación UV, y que
curiosamente, la mayoría de los modelos de melanoma que son capaces de
iniciar el melanoma se caracterizan por el uso de carcinógenos químicos o por
la combinación de estos con radiación UV187,188,189,190,191
. Por ejemplo, el modelo
de ratón deficiente en p16INK4a
es altamente susceptible a la inducción del
melanoma dérmico metastático mediante el carcinógeno químico DMBA192
. El modelo
condicional de ratón de BRAFV600E
inducible y PTEN deficiente es capaz de
recapitular los aspectos clave patofisiológicos del melanoma humano mediante
la administración tópica del carcinógeno 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), un
componente no medioambiental41
. Y la no administración de 4-HT en este modelo
murino, no muestra ningún tipo de lesión por encima de los 18 meses de edad41
(Tabla 1A).
Únicamente, el modelo de melanoma cutáneo maligno murino manipulado
genéticamente, mediante la sobreexpresión del HGF, muestra que a partir de
una única dosis de radiación UV en neonatos, y no en adultos, es necesaria y
suficiente para inducir tumores con una elevada incidencia y siendo
reminiscente al melanoma humano193
. Este modelo de melanoma cutáneo maligno
murino se caracteriza por ser transgénico para el gen HGF, sobreexpresión que
consiste con la presencia del promotor del gen de la metalotioneína que
fuerza la sobreexpresión del HGF, siendo el HGF el ligando para el receptor
c-Met responsable de la activación de RAS/MEK/ERK y de PI3K/AKT, vías de
señalización claves en el desarrollo y progresión del melanoma.
Concretamente, el modelo de melanoma murino transgénico para el HGF es
inducido por una única dosis de 9,58KJ/m2
(UV-A,320-400nm, 3,31KJ/m2
; UV-B
280-320nm, 6,24KJ/m2
; UV-C 250-280nm, 0,03KJ/m2
) que corresponde a una dosis
de luz natural solar de medio verano en una latitud media193
.
Este modelo murino transgénico para el HGF destaca por presentar una piel muy
semejante a la piel humana, con una distribución de los melanocitos en la
dermis, en la epidermis y en la zona de unión entre la epidermis y la dermis.
El modelo murino transgénico para el HGF sin ser irradiado desarrolla
espontáneamente un melanoma dérmico metastático en la vejez194,195
, mientras que
la radiación UV en estado adulto (a las 6 semanas de edad) provoca la
formación de un neoplasma cutáneo no melanocítico no tumorogénico193
. Con
importancia, el modelo transgénico para el HGF inducido por radiación UV
neonatal (a los 3,5 días de edad) genera un melanoma cutáneo maligno murino
con una relativa elevada penetrancia (Tabla 1A). El melanoma cutáneo maligno
67. 57
murino inducido por radiación UV neonatal es capaz de recapitular
histopatológica y cronológicamente todos los estadios de la progresión del
melanoma maligno cutáneo humano. Además, los análisis moleculares de los
melanomas murinos originados en este modelo transgénico para el HGF inducido
por radiación UV neonatal, indican que como en el melanoma humano, se
encuentran bucles de la señalización autocrina del receptor tirosina cinasa
c-Met, frecuentemente se encuentra la pérdida del gen supresor tumoral
p16INK4a
, mientras que raramente se encuentran mutaciones en p53193
.
