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Dipartimento di Tecnologie dell’informazione
                                        Università degli Studi di Milano




                 Caratteristiche biofisiche dei Microtubuli
                 Neurali: Sperimentazione e Confronto con
                 le Ipotesi Teoriche

                                                 Fabio Costanzo


         Relatrice: Prof.ssa Rita Pizzi
         Correlatore: Prof. Giuliano Strini


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Obiettivi




     Fornire un’organizzazione ragionata dell’enorme mole di
         letteratura presente sui microtubuli

     Validare ipotesi riguardo proprietà anomale dei microtubuli
         valutando le possibili modificazioni delle caratteristiche
         biofisiche tramite tre misure fisiche:
                        risonanza,
                        birifrangenza,
                        superradianza.

     Analisi di significatività statistica delle elaborazioni

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Microtubuli 1

          La tubulina è una proteina globulare che costituisce l'unità
          fondamentale delle strutture del citoscheletro dette
          microtubuli.

          I microtubuli sono formati da due subunità proteiche di α e
          β tubulina e possiedono un'intrinseca polarità, dovuta alla
          disposizione delle subunità proteiche di tubulina




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Microtubuli 2


          Anni ’80: Stuart Hameroff – medico ricercatore – ipotizza
          che i microtubuli siano capaci di calcolo. Fino ad allora
          considerati solo componenti del citoscheletro.

          Studi successivi e recenti portano all’attribuzione di
          funzioni quali:
          trasporto intracellulare degli organelli;
          movimento ciliare, ondulatorio e sincronizzato;
          divisione cromosomica
          scambio di segnali tra un elemento e l’altro;
          comunicazione tra nucleo e interno della cellula
          crescita di collegamenti fra neuroni



Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Microtubuli 3

         Modello quantistico di J. Tuszynski – Università di Alberta.

         La tubulina, che possiede due possibili stati, passerebbe
         dall’uno all’altro a causa del passaggio per effetto tunnel
         dal dimero α a quello β.

         Il processo quantistico avverrebbe a temperatura ambiente con
         tempi di decoerenza sufficientemente lunghi.


         Funzionamento del microtubulo come trasmettitore
         elettromeccanico di segnale, agente come cavo intelligente
         autoadattativo.

         La rete neurale del cervello sarebbe accoppiata alla rete
         dei microtubuli e viceversa.

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Nanotubi di carbonio

          Sono una particolare conformazione
          molecolare che il carbonio può assumere.

          -Diamante
          -Grafite
          - ecc..

          • Molta ricerca si sta attualmente sviluppando intorno ai
          nanotubi, che hanno capacità di trasporto di corrente
          estremamente elevato e possono agire sia come semiconduttori
          sia come superconduttori.
          • Grazie alla struttura su nanoscala di questi materiali, le loro
          proprietà non sono limitate dalla fisica classica, ma sono
          aumentate da un ampia gamma di effetti quantistici.
          • Questi possono portare a un ancor più efficiente mezzo di
          trasferimento di informazioni.



Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Motivazioni degli Esperimenti - Risonanza

        Qualsiasi conduttore tubolare cavo, risuonando
        meccanicamente, agisce da antenna (antenna in cavità).

        E’ noto che i nanotubi di carbonio si comportano come
        antenne in grado di captare le altissime frequenze della
        radiazione luminosa visibile.

        I microtubuli, simili in struttura e dimensione ai nanotubi,
        si possono comportare come oscillatori, e questo potrebbe
        renderli dei ricevitori superreattivi in grado di amplificare il
        segnale.

        Verifica dell’esistenza di risonanza dei microtubuli,
        in analogia con i nanotubi, su una certa frequenza,
        con effetto di amplificazione del segnale.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Motivazioni degli Esperimenti - Birifrangenza

        Attraverso la luce polarizzata e un adeguato apparato per
        la rilevazione, è possibile osservare la birifrangenza
        associata, e quindi l’indice di orientamento, di materia
        cellulare sottoposta a campi elettrici (effetto Pockels) e
        magnetici (effetto Faraday).

        Ipotesi di lavoro: Un particolare comportamento biofisico è
        funzionale ad qualche proprietà caratteristica della materia
        biologica.




        Differenze di comportamento osservate tra
        campioni di tubulina e del suo diretto aggregato
        (microtubuli) porterebbero a credere che la struttura
        in cavità predisponga a particolari configurazioni in
        risposta a stimoli cellulari precisi.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Motivazioni degli Esperimenti - Superradianza

        La superradianza è un effetto in grado di convertire energia
        di vario genere da uno stato disordinato in un’energia
        elettromagnetica coerente, per così dire “ordinata”,
        comportando un’emissione di radiazioni con un pompaggio
        spontaneo e coerente di fotoni.

        Attraverso questo effetto i microtubuli potrebbero
        trasformare qualsiasi energia in fotoni coerenti all’interno
        del microtubulo stesso.




        L’esperimento previsto dal progetto sarà eseguito
        successivamente presso il Dipartimento di Scienze
        dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Risonanza - strumenti

    Esperimento preparato ed effettuato a Crema.
    Banco dell’esperimento costituito da:
     • due antenne dipolo ¼ d’onda,
     accordate sulla frequenza di 1,5
     GHz, al centro delle quali è posta la
     soluzione da sottoporre a misura.
     Struttura collocata in contenitore
     metallico in mumetal per
     schermare da segnali esterni.

    Microwave Signal Generator Polarad mod. 1105, per generare
    frequenze tra 0,8 GHz e 2,5 GHz, collegato alla prima antenna.
    •Spectrum Analyzer Avantest mod. TR4131, utilizzato come
    Dip Meter collegato alla seconda antenna per visualizzazione
    eventuali risonanze.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Risonanza - esperimento


          Sottoposti a stimoli elettromagnetici ad alta frequenza
          si sono messe a confronto le risposte di campioni di:
          1. dimero di tubulina in soluzione stabilizzante,
          2. Microtubuli ,
          3. soluzione stabilizzante senza materia cellulare.


     Analisi tubulina: nessun cambiamento di picco significativo.

     Analisi microtubuli: a 1510 MHz rilevazione di una differenza
     di ampiezza del picco di 0,30 Hz

     Analisi del buffer: nessun cambiamento di picco significativo.



Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Risonanza - osservazioni



           Come misura di controllo è importante il valore della terza
           analisi: che il buffer stabilizzatore non abbia fatto rilevare
           cambiamento del picco di riferimento sta a significare che
           eventuali oscillazioni per altre due soluzioni dipendono
           esclusivamente dalla materia cellulare campionata.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - strumenti 1

   Esperimento preparato a Crema ed
   effettuato a Milano.
   E’ stato predisposto un polarimetro
   con la collaborazione del Prof.
   Giuliano Strini del Dipartimento di
   Fisica dell’Università di Milano.


   Misurazione di due celle contemporaneamente:
   •La prima sempre con campo magnetico longitudinale a bassa
   intensità alla frequenza di 610,1 Hz riempita con acqua
   distillata, che permette di avere un segnale di riferimento per
   tutte le misure sulla seconda cella.
   •La seconda cella a frequenza 632 Hz contenente la soluzione
   da esaminare.

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - strumenti 2




        A : Laser Elio-Neon (Hughes 3222H-P, 633 nm; np 5 nW max); Nicol polarizzatore;
        beam splitter per lo stabilizzatore
        B : Cuvetta e bobina a 610.1 Hz per la cella di riferimento
        C : Cuvetta e bobina a 632 Hz per il campione
        D : cella per il campo elettrico
        E : filtro polarizzante
        F : lente per focalizzare il fascio sul fotodiodo
        G : fotodiodo più amplificate
        HP : analizzatore di spettro (HP 3582A) per on-line check
        COMP : sistema di acquisizione dati controllato per elaborazione off-line


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - esperimento

       Test eseguiti per soluzioni:
       a) tubulina in buffer per tubulina;
       b) microtubuli in buffer per microtubuli;
       c) tubulina in buffer per microtubuli;
       d) buffer per microtubuli senza materia cellulare.


       Ciascuna soluzione sottoposta a differenti sollecitazioni:
       1) campo elettrico;
       2) campo magnetico longitudinale;
       3) campo magnetico trasversale;
       4) assenza di campo (controllo).

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - osservazioni




        Già in fase preliminare si è notata una forte risposta al
        campo magnetico longitudinale di tutti i campioni sottoposti
        a una frequenza di 632 Hz.
        In assenza di campo non si rilevano picchi di reazione.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 1


        Analisi approfondita dei risultati raccolti effettuata tramite
        software.


        Parametrizzazioni:
        o Hamming windowing (home made software);
        o Hann windowing con Hann smooth 15pts (Sigview)
        o Hann windowing senza smooth (Sigview)
        o Hamming windowing con Hamming smooth 5pts (Sigview)




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 2

                                 A- Hamming windowing (home made sw)
                                  CE                    CMT                    CML                      SC
                           610Hz       632Hz      610Hz      632Hz       610Hz       632Hz        610Hz      632Hz

     Mt in buff mt         927.41       24.75    1257.95      101.44 1232.30 2253.10              1148.0        9.87

     Tb in buff mt        2229.97       39.46    2013.46      200.63 2047.91 4827.94             2146.92        6.13
     Solo buff mt         2996.69       29.72    2842.10      262.97 2893.39 6758.69             2878.20       16.83
     Tb in buff tb        3445.27        8.65      884.68      79.21     834.54 1928.90           940.53        3.32

                                     B - Hann windowing – Hann smoothing
                                  CE                    CMT                      CML                      SC
                           610Hz 632Hz             610Hz      632Hz        610Hz       632Hz       610Hz 632Hz
    Mt in buff mt            286.7        8.1        391.7       32.8       385.5       712.4        356.5       n/d
    Tb in buff mt            694.9       13.7        627.8       63.9       646.7      1525.1        669.8     n/d
    Solo buff mt             934.3       11.5        885.6       84.4       902.1      2133.8        897.6       n/d



Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 3

                                      C - Hann windowing senza smooth
                                      CE                  CMT                    CML                      SC
                             610Hz         632Hz    610Hz       632Hz      610Hz       632Hz      610Hz        632Hz
      Mt in buff mt          1141.8         27.2     1547.0      185.0      1517.5     2628.3     1412.1          5.5
      Tb in buff mt          2750.1          4.7     2477.4      234.3      2555.9     5629.3     2610.9          2.3
      Solo buff mt           3690.6         30.8     3498.0      305.1      3564.8     7883.4     3547.3          8.7
      Tb in buff tb          4247.7          7.7     1089.7        92.5     1028.5     2250.7     1158.5          1.3


                            D - Hamming windowing - Hamming smoothing
                                    CE                    CMT                    CML                      SC
                             610Hz       632Hz      610Hz       632Hz      610Hz       632Hz      610Hz        632Hz
      Mt in buff mt           748.7        18.68    1015.4         79.3      994.8     1762.5       926.4        9.91
      Tb in buff mt          1800.1        31.58    1625.5       157.1     1674.8      3775.6      1733.0        2.34
      Solo buff mt           2418.6        21.64    2294.1       204.8     2335.2      5284.8      2323.1        8.19


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 4


       I valori delle tabelle precedenti sono stati normalizzati per
       mediante il valore di controllo (val-632/val-610).
                                        Confronto campo elettrico
                                  Tab. A CE          Tab. B CE           Tab. D CE           Tab. E CE

           Mt in buff mt                 0.0267              0.0283             0.0238              0.0249
           Tb in buff mt                 0.0177              0.0197             0.0169              0.0175
           Solo buff mt                  0.0099              0.0123             0.0083              0.0089


           •La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore
           sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola
           quando viene attraversata da campo elettrico.

           •La soluzione con tubulina assume sempre valore maggiore
           della soluzione da sola quando viene attraversata da
           campo elettrico.

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 5



                                  Confronto campo magnetico trasversale

                                  Tab. A CMT          Tab. B CMT           Tab. C CMT          Tab. D CMT

            Mt in buff mt                  0.0810              0.0837               0.0766              0.0781

            Tb in buff mt                  0.0996              0.1018               0.0946              0.0966

            Solo buff mt                   0.0925              0.0953               0.0872              0.0893




          Il campo magnetico trasversale non influenza in modo differente
          le varie soluzioni.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 6



                                  Confronto campo magnetico longitudinale
                                  Tab. X CML           Tab. Y CML          Tab. Z CML           Tab. K CML

            Mt in buff mt                    1.828              1.8480              1.7320               1.7717

            Tb in buff mt                    2.327              2.3567              2.2025               2.2544

            Solo buff mt                     2.336              2.3654              2.2115               2.2628




          la soluzione con microtubuli ha sempre valore minore sia della
          soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando viene
          attraversata da campo magnetico longitudinale.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Birifrangenza - Analisi dei Risultati 7


                                    Confronto senza campo applicato

                                  Tab. X CE             Tab. Y CE            Tab. Z CE          Tab. K CE

           Mt in buff mt                0.00860      No picco in 632              0.00389             0.01069
           Tb in buff mt                0.00285      No picco in 632              0.00088             0.00135
           Solo buff mt                 0.00585      No picco in 632              0.00245             0.00353



          •La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore sia
          della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando
          non viene attraversata da nessun campo elettromagnetico.

          •La soluzione con tubulina assume sempre valore minore della
          soluzione da sola quando non viene attraversata da alcun
          campo elettromagnetico.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Analisi Statistica

        Osservazioni

        • Sostanziale equivalenza dei risultati con diverse
        parametrizzazioni.

        •Non abbiamo quindi bisogno di valutare una miglior scelta
        fra le possibili parametrizzazioni.




        •L’uniformità delle diverse analisi suggerisce che queste
        differenze non siano casuali o dovute al rumore.

        •L’analisi di significatività è stata effettuata sui dati elaborati
        con Hamming window con Hamming smooth 5pts

Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Analisi Statistica 2

        Abbiamo messo a confronto le rilevazioni per le quali
        abbiamo osservato differenze di comportamento.
        Abbiamo eseguito il paired t-test usando il software Minitab.

                   Per il campo elettrico:
                   1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT
                   2. MT in buffer MT – solo buffer MT
                   3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT

                   Per il campo magnetico longitudinale
                   1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT
                   2. MT in buffer MT – solo buffer MT

                   In assenza di campo
                   1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT
                   2. MT in buffer MT – solo buffer MT
                   3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Analisi Statistica 3

   Osservazioni.

   Tra tutti i test solo quello di confronto per:

   tubulina in buffer per MT e buffer da solo senza materia cellulare

   entrambi sottoposti a campo elettrico, mostra un valore superiore alla
   soglia di casualità del 5%.


   Tutti gli altri confronti mostrano un'ottima significatività statistica, con
   p-Value sempre uguale a 0.000 (< 0.0005).


   Le differenze riscontrate nei comportamenti delle diverse sostanze in
   base ai vari campi cui sono stati sottoposti hanno mostrato di essere
   molto lontane dalla casualità, consentendo di trarre delle conclusioni sui
   risultati raggiunti.


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Conclusioni - 1


                Esperimento di risonanza
                  L’assenza di risposta per la tubulina e per la soluzione di
                  controllo, contrapposta all’oscillazione evidente del
         picco di riferimento ottenuto dai microtubuli, suggerisce che la
         struttura tubolare tipica dei microtubuli sia, se non in tutto,
         almeno in parte la causa dell’amplificazione       del segnale
         osservato.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Conclusioni - 2


                Esperimento di birifrangenza
                     Dall’analisi dei risultati si deduce che la differenza in
                     birifrangenza non può che essere dovuta alla differenza
                     di struttura microscopica.
         In particolare si osserva che l’effetto anomalo più evidente si
         registra nel caso di campo elettrico.
                                              Campi elettrici

                                  Tab. X CE           Tab. Y CE           Tab. Z CE           Tab. K CE

           Mt in buff                    0.0267              0.0283              0.0238              0.0249
           mt
           Tb in buff mt                 0.0177              0.0197              0.0169              0.0175

           Solo buff mt                  0.0099              0.0123              0.0083              0.0089


Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Conclusioni - 3


                Significatività statistica
                      I risultati raggiunti negli esperimenti, confortati dalla
                       significatività statistica, suggeriscono l’ipotesi che
                      la struttura tubolare dei microtubuli possa essere
                      responsabile dei comportamenti anomali riscontrati.

          I risultati sperimentali sono in linea con i risultati sperimentali
          precedenti ottenuti dal gruppo, in cui si evidenziava una anomala
          sensibilità dei neuroni a campi elettromagnetici ultradeboli.




                 I risultati sperimentali sono l’unica via legittima per validare le
                 diverse teorie quantistiche esistenti sui microtubuli.

Fabio Costanzo    Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Sviluppi Futuri - 1

           Sulla base dei risultati raggiunti, l’attività di ricerca
           continuerà secondo queste linee:


          • Ripetizione degli esperimenti già effettuati preparando microtubuli e
                 tubulina con ligandi differenti.
          •      Partecipazione agli esperimenti di ricerca di fenomeno di superradianza
                 per luminescenza nelle sostanze descritte presso il Dipartimento di
                 Scienze dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca (Prof. Franco
                 Meinardi).
          •      Analisi statistica dei risultati.
          •      I risultati sperimentali verranno affiancati dalla simulazione grafica
                 tridimensionale del folding delle proteine in esame in base ai diversi
                 ligandi per studiarne le differenze conformazionali emergenti e per
                 verificare se il diverso comportamento in caso di differenti ligandi sia da
                 imputarsi effettivamente a differenze conformazionali.




Fabio Costanzo    Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Sviluppi Futuri - 2


        Il progetto dovrebbe infine pervenire ai seguenti risultati:

        •   A partire dai risultati sperimentali raggiunti, deduzione di una
            serie di ragionevoli ipotesi sulle proprietà funzionali dei
            microtubuli.
        •   Approfondimento delle conoscenze sulla struttura
            tridimensionale di queste importanti proteine attraverso la
            simulazione del loro folding in base alla presenza di differenti
            ligandi.
        •   Progressi nella metodologia della predizione del folding
            attraverso l’analisi critica della letteratura e l’implementazione e
            la validazione di un software originale.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
Grazie per l’attenzione.




Fabio Costanzo   Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche

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Biofisica dei microtubuli

  • 1. Dipartimento di Tecnologie dell’informazione Università degli Studi di Milano Caratteristiche biofisiche dei Microtubuli Neurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche Fabio Costanzo Relatrice: Prof.ssa Rita Pizzi Correlatore: Prof. Giuliano Strini Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 2. Obiettivi Fornire un’organizzazione ragionata dell’enorme mole di letteratura presente sui microtubuli Validare ipotesi riguardo proprietà anomale dei microtubuli valutando le possibili modificazioni delle caratteristiche biofisiche tramite tre misure fisiche: risonanza, birifrangenza, superradianza. Analisi di significatività statistica delle elaborazioni Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 3. Microtubuli 1 La tubulina è una proteina globulare che costituisce l'unità fondamentale delle strutture del citoscheletro dette microtubuli. I microtubuli sono formati da due subunità proteiche di α e β tubulina e possiedono un'intrinseca polarità, dovuta alla disposizione delle subunità proteiche di tubulina Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 4. Microtubuli 2 Anni ’80: Stuart Hameroff – medico ricercatore – ipotizza che i microtubuli siano capaci di calcolo. Fino ad allora considerati solo componenti del citoscheletro. Studi successivi e recenti portano all’attribuzione di funzioni quali: trasporto intracellulare degli organelli; movimento ciliare, ondulatorio e sincronizzato; divisione cromosomica scambio di segnali tra un elemento e l’altro; comunicazione tra nucleo e interno della cellula crescita di collegamenti fra neuroni Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 5. Microtubuli 3 Modello quantistico di J. Tuszynski – Università di Alberta. La tubulina, che possiede due possibili stati, passerebbe dall’uno all’altro a causa del passaggio per effetto tunnel dal dimero α a quello β. Il processo quantistico avverrebbe a temperatura ambiente con tempi di decoerenza sufficientemente lunghi. Funzionamento del microtubulo come trasmettitore elettromeccanico di segnale, agente come cavo intelligente autoadattativo. La rete neurale del cervello sarebbe accoppiata alla rete dei microtubuli e viceversa. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 6. Nanotubi di carbonio Sono una particolare conformazione molecolare che il carbonio può assumere. -Diamante -Grafite - ecc.. • Molta ricerca si sta attualmente sviluppando intorno ai nanotubi, che hanno capacità di trasporto di corrente estremamente elevato e possono agire sia come semiconduttori sia come superconduttori. • Grazie alla struttura su nanoscala di questi materiali, le loro proprietà non sono limitate dalla fisica classica, ma sono aumentate da un ampia gamma di effetti quantistici. • Questi possono portare a un ancor più efficiente mezzo di trasferimento di informazioni. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 7. Motivazioni degli Esperimenti - Risonanza Qualsiasi conduttore tubolare cavo, risuonando meccanicamente, agisce da antenna (antenna in cavità). E’ noto che i nanotubi di carbonio si comportano come antenne in grado di captare le altissime frequenze della radiazione luminosa visibile. I microtubuli, simili in struttura e dimensione ai nanotubi, si possono comportare come oscillatori, e questo potrebbe renderli dei ricevitori superreattivi in grado di amplificare il segnale. Verifica dell’esistenza di risonanza dei microtubuli, in analogia con i nanotubi, su una certa frequenza, con effetto di amplificazione del segnale. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 8. Motivazioni degli Esperimenti - Birifrangenza Attraverso la luce polarizzata e un adeguato apparato per la rilevazione, è possibile osservare la birifrangenza associata, e quindi l’indice di orientamento, di materia cellulare sottoposta a campi elettrici (effetto Pockels) e magnetici (effetto Faraday). Ipotesi di lavoro: Un particolare comportamento biofisico è funzionale ad qualche proprietà caratteristica della materia biologica. Differenze di comportamento osservate tra campioni di tubulina e del suo diretto aggregato (microtubuli) porterebbero a credere che la struttura in cavità predisponga a particolari configurazioni in risposta a stimoli cellulari precisi. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 9. Motivazioni degli Esperimenti - Superradianza La superradianza è un effetto in grado di convertire energia di vario genere da uno stato disordinato in un’energia elettromagnetica coerente, per così dire “ordinata”, comportando un’emissione di radiazioni con un pompaggio spontaneo e coerente di fotoni. Attraverso questo effetto i microtubuli potrebbero trasformare qualsiasi energia in fotoni coerenti all’interno del microtubulo stesso. L’esperimento previsto dal progetto sarà eseguito successivamente presso il Dipartimento di Scienze dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 10. Risonanza - strumenti Esperimento preparato ed effettuato a Crema. Banco dell’esperimento costituito da: • due antenne dipolo ¼ d’onda, accordate sulla frequenza di 1,5 GHz, al centro delle quali è posta la soluzione da sottoporre a misura. Struttura collocata in contenitore metallico in mumetal per schermare da segnali esterni. Microwave Signal Generator Polarad mod. 1105, per generare frequenze tra 0,8 GHz e 2,5 GHz, collegato alla prima antenna. •Spectrum Analyzer Avantest mod. TR4131, utilizzato come Dip Meter collegato alla seconda antenna per visualizzazione eventuali risonanze. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 11. Risonanza - esperimento Sottoposti a stimoli elettromagnetici ad alta frequenza si sono messe a confronto le risposte di campioni di: 1. dimero di tubulina in soluzione stabilizzante, 2. Microtubuli , 3. soluzione stabilizzante senza materia cellulare. Analisi tubulina: nessun cambiamento di picco significativo. Analisi microtubuli: a 1510 MHz rilevazione di una differenza di ampiezza del picco di 0,30 Hz Analisi del buffer: nessun cambiamento di picco significativo. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 12. Risonanza - osservazioni Come misura di controllo è importante il valore della terza analisi: che il buffer stabilizzatore non abbia fatto rilevare cambiamento del picco di riferimento sta a significare che eventuali oscillazioni per altre due soluzioni dipendono esclusivamente dalla materia cellulare campionata. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 13. Birifrangenza - strumenti 1 Esperimento preparato a Crema ed effettuato a Milano. E’ stato predisposto un polarimetro con la collaborazione del Prof. Giuliano Strini del Dipartimento di Fisica dell’Università di Milano. Misurazione di due celle contemporaneamente: •La prima sempre con campo magnetico longitudinale a bassa intensità alla frequenza di 610,1 Hz riempita con acqua distillata, che permette di avere un segnale di riferimento per tutte le misure sulla seconda cella. •La seconda cella a frequenza 632 Hz contenente la soluzione da esaminare. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 14. Birifrangenza - strumenti 2 A : Laser Elio-Neon (Hughes 3222H-P, 633 nm; np 5 nW max); Nicol polarizzatore; beam splitter per lo stabilizzatore B : Cuvetta e bobina a 610.1 Hz per la cella di riferimento C : Cuvetta e bobina a 632 Hz per il campione D : cella per il campo elettrico E : filtro polarizzante F : lente per focalizzare il fascio sul fotodiodo G : fotodiodo più amplificate HP : analizzatore di spettro (HP 3582A) per on-line check COMP : sistema di acquisizione dati controllato per elaborazione off-line Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 15. Birifrangenza - esperimento Test eseguiti per soluzioni: a) tubulina in buffer per tubulina; b) microtubuli in buffer per microtubuli; c) tubulina in buffer per microtubuli; d) buffer per microtubuli senza materia cellulare. Ciascuna soluzione sottoposta a differenti sollecitazioni: 1) campo elettrico; 2) campo magnetico longitudinale; 3) campo magnetico trasversale; 4) assenza di campo (controllo). Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 16. Birifrangenza - osservazioni Già in fase preliminare si è notata una forte risposta al campo magnetico longitudinale di tutti i campioni sottoposti a una frequenza di 632 Hz. In assenza di campo non si rilevano picchi di reazione. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 17. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 1 Analisi approfondita dei risultati raccolti effettuata tramite software. Parametrizzazioni: o Hamming windowing (home made software); o Hann windowing con Hann smooth 15pts (Sigview) o Hann windowing senza smooth (Sigview) o Hamming windowing con Hamming smooth 5pts (Sigview) Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 18. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 2 A- Hamming windowing (home made sw) CE CMT CML SC 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz Mt in buff mt 927.41 24.75 1257.95 101.44 1232.30 2253.10 1148.0 9.87 Tb in buff mt 2229.97 39.46 2013.46 200.63 2047.91 4827.94 2146.92 6.13 Solo buff mt 2996.69 29.72 2842.10 262.97 2893.39 6758.69 2878.20 16.83 Tb in buff tb 3445.27 8.65 884.68 79.21 834.54 1928.90 940.53 3.32 B - Hann windowing – Hann smoothing CE CMT CML SC 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz Mt in buff mt 286.7 8.1 391.7 32.8 385.5 712.4 356.5 n/d Tb in buff mt 694.9 13.7 627.8 63.9 646.7 1525.1 669.8 n/d Solo buff mt 934.3 11.5 885.6 84.4 902.1 2133.8 897.6 n/d Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 19. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 3 C - Hann windowing senza smooth CE CMT CML SC 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz Mt in buff mt 1141.8 27.2 1547.0 185.0 1517.5 2628.3 1412.1 5.5 Tb in buff mt 2750.1 4.7 2477.4 234.3 2555.9 5629.3 2610.9 2.3 Solo buff mt 3690.6 30.8 3498.0 305.1 3564.8 7883.4 3547.3 8.7 Tb in buff tb 4247.7 7.7 1089.7 92.5 1028.5 2250.7 1158.5 1.3 D - Hamming windowing - Hamming smoothing CE CMT CML SC 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz Mt in buff mt 748.7 18.68 1015.4 79.3 994.8 1762.5 926.4 9.91 Tb in buff mt 1800.1 31.58 1625.5 157.1 1674.8 3775.6 1733.0 2.34 Solo buff mt 2418.6 21.64 2294.1 204.8 2335.2 5284.8 2323.1 8.19 Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 20. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 4 I valori delle tabelle precedenti sono stati normalizzati per mediante il valore di controllo (val-632/val-610). Confronto campo elettrico Tab. A CE Tab. B CE Tab. D CE Tab. E CE Mt in buff mt 0.0267 0.0283 0.0238 0.0249 Tb in buff mt 0.0177 0.0197 0.0169 0.0175 Solo buff mt 0.0099 0.0123 0.0083 0.0089 •La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando viene attraversata da campo elettrico. •La soluzione con tubulina assume sempre valore maggiore della soluzione da sola quando viene attraversata da campo elettrico. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 21. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 5 Confronto campo magnetico trasversale Tab. A CMT Tab. B CMT Tab. C CMT Tab. D CMT Mt in buff mt 0.0810 0.0837 0.0766 0.0781 Tb in buff mt 0.0996 0.1018 0.0946 0.0966 Solo buff mt 0.0925 0.0953 0.0872 0.0893 Il campo magnetico trasversale non influenza in modo differente le varie soluzioni. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 22. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 6 Confronto campo magnetico longitudinale Tab. X CML Tab. Y CML Tab. Z CML Tab. K CML Mt in buff mt 1.828 1.8480 1.7320 1.7717 Tb in buff mt 2.327 2.3567 2.2025 2.2544 Solo buff mt 2.336 2.3654 2.2115 2.2628 la soluzione con microtubuli ha sempre valore minore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando viene attraversata da campo magnetico longitudinale. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 23. Birifrangenza - Analisi dei Risultati 7 Confronto senza campo applicato Tab. X CE Tab. Y CE Tab. Z CE Tab. K CE Mt in buff mt 0.00860 No picco in 632 0.00389 0.01069 Tb in buff mt 0.00285 No picco in 632 0.00088 0.00135 Solo buff mt 0.00585 No picco in 632 0.00245 0.00353 •La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando non viene attraversata da nessun campo elettromagnetico. •La soluzione con tubulina assume sempre valore minore della soluzione da sola quando non viene attraversata da alcun campo elettromagnetico. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 24. Analisi Statistica Osservazioni • Sostanziale equivalenza dei risultati con diverse parametrizzazioni. •Non abbiamo quindi bisogno di valutare una miglior scelta fra le possibili parametrizzazioni. •L’uniformità delle diverse analisi suggerisce che queste differenze non siano casuali o dovute al rumore. •L’analisi di significatività è stata effettuata sui dati elaborati con Hamming window con Hamming smooth 5pts Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 25. Analisi Statistica 2 Abbiamo messo a confronto le rilevazioni per le quali abbiamo osservato differenze di comportamento. Abbiamo eseguito il paired t-test usando il software Minitab. Per il campo elettrico: 1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT 2. MT in buffer MT – solo buffer MT 3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT Per il campo magnetico longitudinale 1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT 2. MT in buffer MT – solo buffer MT In assenza di campo 1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT 2. MT in buffer MT – solo buffer MT 3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 26. Analisi Statistica 3 Osservazioni. Tra tutti i test solo quello di confronto per: tubulina in buffer per MT e buffer da solo senza materia cellulare entrambi sottoposti a campo elettrico, mostra un valore superiore alla soglia di casualità del 5%. Tutti gli altri confronti mostrano un'ottima significatività statistica, con p-Value sempre uguale a 0.000 (< 0.0005). Le differenze riscontrate nei comportamenti delle diverse sostanze in base ai vari campi cui sono stati sottoposti hanno mostrato di essere molto lontane dalla casualità, consentendo di trarre delle conclusioni sui risultati raggiunti. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 27. Conclusioni - 1  Esperimento di risonanza L’assenza di risposta per la tubulina e per la soluzione di controllo, contrapposta all’oscillazione evidente del picco di riferimento ottenuto dai microtubuli, suggerisce che la struttura tubolare tipica dei microtubuli sia, se non in tutto, almeno in parte la causa dell’amplificazione del segnale osservato. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 28. Conclusioni - 2  Esperimento di birifrangenza Dall’analisi dei risultati si deduce che la differenza in birifrangenza non può che essere dovuta alla differenza di struttura microscopica. In particolare si osserva che l’effetto anomalo più evidente si registra nel caso di campo elettrico. Campi elettrici Tab. X CE Tab. Y CE Tab. Z CE Tab. K CE Mt in buff 0.0267 0.0283 0.0238 0.0249 mt Tb in buff mt 0.0177 0.0197 0.0169 0.0175 Solo buff mt 0.0099 0.0123 0.0083 0.0089 Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 29. Conclusioni - 3  Significatività statistica I risultati raggiunti negli esperimenti, confortati dalla significatività statistica, suggeriscono l’ipotesi che la struttura tubolare dei microtubuli possa essere responsabile dei comportamenti anomali riscontrati. I risultati sperimentali sono in linea con i risultati sperimentali precedenti ottenuti dal gruppo, in cui si evidenziava una anomala sensibilità dei neuroni a campi elettromagnetici ultradeboli. I risultati sperimentali sono l’unica via legittima per validare le diverse teorie quantistiche esistenti sui microtubuli. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 30. Sviluppi Futuri - 1 Sulla base dei risultati raggiunti, l’attività di ricerca continuerà secondo queste linee: • Ripetizione degli esperimenti già effettuati preparando microtubuli e tubulina con ligandi differenti. • Partecipazione agli esperimenti di ricerca di fenomeno di superradianza per luminescenza nelle sostanze descritte presso il Dipartimento di Scienze dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca (Prof. Franco Meinardi). • Analisi statistica dei risultati. • I risultati sperimentali verranno affiancati dalla simulazione grafica tridimensionale del folding delle proteine in esame in base ai diversi ligandi per studiarne le differenze conformazionali emergenti e per verificare se il diverso comportamento in caso di differenti ligandi sia da imputarsi effettivamente a differenze conformazionali. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 31. Sviluppi Futuri - 2 Il progetto dovrebbe infine pervenire ai seguenti risultati: • A partire dai risultati sperimentali raggiunti, deduzione di una serie di ragionevoli ipotesi sulle proprietà funzionali dei microtubuli. • Approfondimento delle conoscenze sulla struttura tridimensionale di queste importanti proteine attraverso la simulazione del loro folding in base alla presenza di differenti ligandi. • Progressi nella metodologia della predizione del folding attraverso l’analisi critica della letteratura e l’implementazione e la validazione di un software originale. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche
  • 32. Grazie per l’attenzione. Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche