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¿Cómo podemos encontrar los péptidos específicos?
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Javier Miralles
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05_Taller SALUD: Javier Miralles_AINIA

  1. 1. www.ainia.es 1 Cuantificación novel de fármacos biotecnológicos oncológicos mediante la aplicación de técnicas instrumentales de última generación
  2. 2. www.ainia.es 2 > Introducción a los fármacos biotecnológicos • Los fármacos biotecnológicos son producidos a partir de técnicas de biotecnología y son de naturaleza proteica (proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales, péptidos, etc.). • Fármacos con estructura grande (Kdaltons), compleja, inestable y susceptible a múltiples modificaciones. • Su caracterización es compleja debido a la mezcla de moléculas relacionadas presentes en la matriz biológica. • Existe relación entre la exposición y la respuesta (terapéutica o tóxica) (ej, cetuximab).
  3. 3. www.ainia.es 3 > Introducción a los fármacos biotecnológicos monoclonales – trastuzumab • Trastuzumab (Herceptin®)  anticuerpo monoclonal humanizado indicado para el cáncer de mama HER2+. • Fórmula  C6470H10012N1726O2013S42 • Peso mol.  145531.5 g/mol • Secuencia de AA y una estructura conocida.
  4. 4. www.ainia.es 5 > Se carece de métodos de análisis aplicables … • Las casas comerciales que distribuye los fármacos no facilitan métodos cuantitativo para el análisis específico de sus fármacos en plasma. • Se carece en el mercado de kits inmunoquímicos (ELISA) para tal uso. • En el ámbito científico hay grupos de investigación que han desarrollado métodos “inhouse” basados en anticuerpos policlonales. • Al ser fármacos proteicos no pueden ser analizados mediante técnicas instrumentales clásicas.
  5. 5. www.ainia.es 6 > ¿ Por que es de interés controlar los niveles de los fármacos ? • Permite ajustar los tratamientos (frecuencias y/o dosis) de manera personalizada. • Esta demostrada la variabilidad interpaciente en los procesos de absorción, distribución y eliminación lo cual condiciona los niveles séricos y que su respuesta sea tóxica o terapéutica. • Ajustar las dosis permite obtener en todo momento la cantidad terapéutica óptima. • Minimiza posibles efectos segundarios no deseados. • Con lo que se optimiza los tratamientos y los recursos.
  6. 6. www.ainia.es 7 > Objetivo del proyecto • Desarrollar una metodología instrumental para cuantificar anticuerpos terapéuticos monoclonales basada en sistemas avanzados de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrómetros de masas de última generación.
  7. 7. www.ainia.es 8 ¿Cuál es nuestra aproximación para cuantificar los anticuerpos monoclonales?
  8. 8. www.ainia.es 9 > Estructura de las IgG • 1. Región Fab •2. Región Fc •3. Cadena pesada con un dominio variable seguido por un dominio constante una región bisagra, y dos más constantes, los dominios. •4. Cadena ligera con un dominio variable y uno constante •5. Lugar de unión al antígeno (paratopo) •6. Regiones bisagra
  9. 9. www.ainia.es 10 > Alineamiento de las secuencias de AA de anticuerpos terapéuticos
  10. 10. www.ainia.es 11 ¿Cómo podemos encontrar los péptidos específicos?
  11. 11. www.ainia.es 12 > Digestión enzimática y posterior identificación de los péptidos resultantes Anticuerpo Monoclonal Terapéutico péptidos Caracterización Instrumental LC-Ms
  12. 12. www.ainia.es 13 Fármaco monoclonal (analito) Plasma humano (matriz) Digestión enzimática Caracterización peptídica LC-Ms (TOF) ¿Péptidos específicos? Método cuantitativo LC-Ms (QqQ) Validación Aplicación a estudios farmacocinéticos SINO > Esquema de la estrategia del plan de trabajo
  13. 13. www.ainia.es 14 > Digestión enzimática y posterior identificación de los péptidos resultantes Cromatograma Trastuzumab digerido : Péptido específico 1 Péptido específico 2 Total ion current
  14. 14. www.ainia.es 15 > Resultados del proyecto: • Se encontraron 2 péptidos específicos de la zona variable del trastuzumab, de los cuales se seleccionó el de mayor sensibilidad y selectividad para desarrollar el método cuantitativo • Se desarrolló un método cuantitativo con un LOQ de 10 mg/L que incluye • Pretratamiento del plasma, • Purificación de las IgGs, • Digestión enzimática • Cuantificación del péptido específico mediante LC-Ms/Ms (modo MRM). • El método se validó en el rango 10–200 mg/L y cumplió los requisitos establecidos (FDA). • Linealidad: El 92.6% de los patrones tuvieron una diferencia con respecto al valor nominal inferior al 15%*. • Exactitud: El error relativo en el rango fue inferior al 15%*. • Precisión: El coeficiente de variación fue inferior al 15%*. *(20% para el LOQ)
  15. 15. www.ainia.es 16 > Grupo de trabajo : • Hospital Quirón Torrevieja • Belén Valenzuela • Vanesa Escudero • Servicio de proteómica del CI Príncipe Felipe • Manuel M. Sánchez • Luz Valero • ainia Centro tecnológico • Begoña Company • Amelia Moreno • Javier Miralles > Trabajo financiado por :
  16. 16. www.ainia.es 17 Muchas gracias por su atención Javier Miralles jmiralles@ainia.es 610780574

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