PRUEBAS INMUNOLÓGICAS DE LABORATORIO

137,675 views

Published on

Published in: Health & Medicine
1 Comment
41 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
137,675
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
19
Actions
Shares
0
Downloads
1,771
Comments
1
Likes
41
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

PRUEBAS INMUNOLÓGICAS DE LABORATORIO

  1. 1. PRUEBAS INMUNOLÓGICAS DE LABORATORIO TEMA 20Reacciones de Precipitación Las reacciones de precipitación, son las mas simples de las reacciones antígeno/anticuerpo yen ellas se visualiza un precipitado visible, cuando reacciona un (ag) soluble (precipitógeno) y su(ac) correspondiente (precipitina). Los precipitógenos pueden ser cualquier sustancia antigénica ensuspensión coloidal, como proteínas séricas, toxinas, extractos de bacterias, parásitos, hongos, etc.Mecanismo de Reacción Las reacciones de precipitación y aglutinación tienen un mismo mecanismo de reacción, y sudiferencia depende de la naturaleza del Ag. En las reacciones de precipitación el Ag además de sersoluble, debe ser multivalente (es decir, debe contar con varias copias del mismo determinanteantigénico). Ello conlleva a la formación gradual de un entrecruzamiento o red entre los Acsdivalentes y los determinantes antigénicos de Ags adyacentes, que al alcanzar ciertas dimensiones,el complejo formado precipita. La unión del precipitógeno y la precipitina ocurre rápidamente ensegundos, pero la formación de los precipitados y por lo tanto, su visualización, puede demorardesde minutos, horas y hasta días.Modalidades de las Reacciones de Precipitación Las reacciones de precipitación se pueden realizar en: 1- Medio líquido y 2- Mediosemisólido.Medio Semisólido: Inmunodifusión Las reacciones de inmunodifusión, son técnicas de precipitación que utilizan el agar conmedio de soporte, en donde el Ag y/o el Ac van a difundir y en el sitio donde se encuentren en susproporciones óptimas, aparecerá una linea, un anillo o un arco de precipitación. Esta técnica fueintroducida por Oudin en 1946, con su método de difusión simple en un tubo.Agar: polisacárido derivado de ciertas algas, que viene en forma granulada y se disuelve en aguadestilada o amortiguador (buffer) caliente. La solución al alcanzar la temperatura ambiente queda enestado semisólido La inmunodifusión se usa para el análisis cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo deantígenos y anticuerpos en el suero y otros líquidos corporales. La interpretación del análisis es eldesarrollo de una reacción de precipitación (la formación de un complejo antígeno- anticuerpoinsoluble a partir de un antígeno y anticuerpo soluble).Inmunodifusión Doble de Ouchterlony: Es una de las técnicas mas utilizadas para evaluar enforma cualitativa o semicuantitativa la presencia de Ags o Acs en una muestra biológica. Sefundamenta en el principio de que el Ag y el Ac difunden a través del agar formando líneas deprecipitación que representan complejos inmunes, los cuales pueden analizarse visualmente. Estaprueba permite relacionar varios Ags o Acs a través de 3 tipos de patrones: patrón de identidad, deno identidad y de identidad parcial.Patrón de Identidad: Patrón caracterizado por la formación de dos líneas de precipitación queconfluyen en un punto y significa que en 2 muestras biológicas existe la presencia del mismoanticuerpo específico para un determinado antígeno.Patrón de No Identidad: Patrón caracterizado por la formación de 2 líneas de precipitación que secruzan por completo y significa que en una muestra biológica existe la presencia de 2 anticuerposdiferentes, específicos para 2 antígenos.
  2. 2. Patrón de Identidad Parcial: Patrón caracterizado por la formación de 2 líneas de precipitación queno se suponen por completo, debido a que los antígenos comparten un determinante antigénico(Ags que reaccionan cruzadamente), con la consecuente formación de un espolón, debido a que unade las líneas de precipitación se proyecta en el agar.Utilidad Clínica de la Inmunodifusión de Ouchterlony  Posibilidad de hacer diagnóstico y evaluar la evolución de enfermedades infecciosas producidas por bacterias, hongos, virus y parásitos.Inmunodifusión Radial de Mancini: Se Fundamenta en el principio de que exista una relacióncuantitativa entre la cantidad de Ag colocado en un pozo de una lámina de Agar-Ac y el diámetro delanillo de precipitación resultante. Para ello, se añade Ac a un gel de agar, que a continuación se vierte sobre un alamina devidrio y se deja solidificar. Cuando el agar ya esta sólido, se excavan en el mismo unos, unospocillos y se añade a cada uno un volumen estandár del Ag problema a diferentes concentraciones.Las placas se incuban durante un periodo mínimo de 24 horas, durante el cual el Ag se difundehacia el exterior de los pocillos y forma complejos con el A. Estos se siguen difundiendo hacia elexterior, uniéndose cada vez mas a cantidad de Ac, hasta que se alcanza el punto de equivalencia ylos inmunocomplejos precipitan formando un anillo. La superficie que abarca el anillo, que es funcióndel cuadrado de su diámetro, es proporcional a la concentración del Ag. La concentración de lamuestra problema se determina mediante interpolación a partir de una curva de calibración. Elproceso también se puede llevar a la inversa, utilizando un gel con Ag para determinarconcentraciones desconocidas de Ac.Utilidad Clinica de la Inmunodifusión Radial de Mancini • Determinación cuantitativa de Igs: IgA, IgG e IgM • Determinación cuantitativa de C3 Y C4(componentes del complemento)Inmunoelectroforesis: este es un método que combina el principio de la electroforesis zonal, esdecir, la separación de las proteínas presentes en una muestra biológica, mediante la aplicación deun campo eléctrico y la inmunodifusión doble. Una vez separadas las proteínas de la muestra sehacen reaccionar con Acs específicos y al difundir ambos elementos (Ag y Ac), se forman arcos deprecipitación característicos. Por lo tanto, se puede obtener la identificación y cuantificaciónaproximada de proteínas individuales presentes en el suero, orina u otros líquidos biológicos. En esta técnica, se cubre una portaobjetos con agar o agarosa fundidos en una soluciónamortiguadora alcalina. Una vez gelificado, se abre un pocillo para colocar la muestra biólogica y uncanal para los anticuerpos específicos. Colocada la muestra se procede a aplicar una diferencia depotencial para que ocurra la separación de las diferentes proteínas de la muestra, durante 30 a 60minutos. Entonces se colocan los anticuerpos en el canal y se permite que las proteínas (Ags) y losAcs difundan duante 18 24 horas. En el caso particular en el que por ejemplo se sospeche de una mieloma productor de IgG,se utiliza un suero control, en el cual la concentración de IgG es normal y se realiza la corridaelectroforética simultáneamente con el suero problema. Luego se añade anti-IgG humana en elcanal y se espera a que ambos reactantes difundan libremente. El arco de precipitación formado conel suero del paciente se compara con el arco formado por el suero control.Utilidad Clínica de la Inmunoelectroforesis • Diagnostico de Paraproteinemias (por ejemplo: Mieloma Multiple) • Identificación de cantidades elevadas de proteínas presentes en el liquido cefalorraquídeo, en pacientes con diversas enfermedades neurológicas.
  3. 3. • Disminución o ausencia de inmunoglobulinas en diversos trastornos de deficiencia inmunitaria. Hay reacciones de precipitación anormales, llamadas de floculación, en las que laprecipitación se observa solamente en un intervalo muy estrecho de concentraciones relativas deAg y Ac; los agregados insolubles no se forman hasta que se ha añadido una cantidad relativamentegrande de Ag. Estas reacciones son producidas solamente por ciertos antisueros como por ejemplo:antisueros de caballo contra la toxina diftérica y contra algunas toxinas estreptocócicas, algunosantisueros humanos contra la tiroglobulina y anticuerpos no treponémicos humano contra lacardiolipina del corazñon de buey, utilizado en el diagnostico serológico de sífilis, mediante la pruebaV.D.R.L.Diagnóstico serológico de la sífilis (prueba de V.D.R.L) La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual de evolución crónica, con periodosasintomáticos, cuyo agente etiológico es Treponema pallidum. Esta enfermadad se caracteriza por lapresencia de una lesión primaria (denominada chancro), una erupción secundaria que afecta la piely las membranas mucosas, largos períodos de latencia y lesiones tardías en la piel, los huesos, lasvísceras, los ojos, el sistema nervioso y el cardiovascular. Treponema pallidum es un patógenoexclusivo del hombre, quien es su único reservorio. Se adquiere por contacto directo(fundamentalmente por contacto sexual) con una lesión de sífilis reciente, por vía transplacentaria yraras veces por transfusiones de sangre; penetra a través de la mucosa sana o la piel erosionada yrápidamente se disemina en el organismo, por lo que la infección es sistémica desde etapasprecoces. Existen básicamente dos estrategias que son utilizadas en la práctica para el diagnóstico dela enfermedad: a) Examen directo b) Las reacciones serológicas. El objetivo del examen directo consiste en demostrar la presencia de T. pallidum en losexudados de las lesiones primarias (chancro) o en las serosidades de las lesiones secundariascutáneos-mucosas. La finalidad de las reacciones serológicas es demostrar la presencia deanticuerpos contra Treponema pallidum o antígenos relacionados (ej. Cardiolipina) en muestrasobtenidas del paciente (ej. Suero, plasma y líquido cefalorraquídeo). En la mayoría de las ocasiones, existen dificultades o no es posible realizar el diagnósticodirecto, por lo que el diagnóstico indirecto o serológico de la enfermedad se ha convertido en elprocedimiento mas frecuente. Los anticuerpos producidos como consecuencia de la infección porTreponema pallidum, se clasifican operacionalmente en dos tipos: a) anticuerpos no treponémicos(reciben también la denominación de anticuerpos reaginicos o reginas sifilíticas), los cualesreaccionan con antígenos lipídicos (ej. Cardiolipina) y b) anticuerpos treponémicos que reaccionancon Treponema pallidum o sus antígenos específicos.Fundamento metodológico de la prueba de V.D.R.L Uno de los métodos de laboratorio mas utilizados para establecer el diagnostico serológicode la sífilis es la pruba conocida como V.D.R.L. En la prueba en referencia, una suspensión decardiolipina(con lecitina y colesterol) en buffer salino es mezclado con el suero del paciente, se agitaen un rotador mecánico y luego de un período de incubación adecuado (4 minutos) se observamicroscópicamente. Si el suero contiene anticuerpos reagínicos o anticuerpos no treponémicos seobservan flóculis (ó conglomerados) producto de la reacción Ag-Ac. Esta prueba puede realizarse demanera cualitativa y semicuantitativa Lectura Reporte
  4. 4. Se observa una suspensión homogénea de partículas delgadas y No Reactivocortas, semejantes a agujas, sin la presencia de conglomerados (NR)(grumos).Se observa la presencia de numerosos conglomerados pequeños Débilmenterepartidos entre partículas sueltas. Reactivo (DR)Se observa la presencia de conglomerados relativamente Reactivo (R)voluminosos medianos y grandes sobre un fondo claro. Los procedimientos cualitativos únicamente permiten demostrar la presencia (muestrareactiva) o ausencia (muestra no reactiva) de los anticuerpos no treponémicos en la muestraanalizada. Los procedimientos semicuantitativos (en el caso del V.D.R.L. se denomina V.D.R.L.cuantitativo) permiten la obtención de títulos de anticuerpos que se correlacionan bastante bien conel estado clínico del paciente, de manera que son usadas para evaluar la eficacia de los tratamientos(el titulo de Acs no treponémicos tiende a disminuir con el tiempo en la medida que el pacientemejora).Si en la muestra de suero se detecta la presencia de anticuerpos reaginicos (V.D.R.L. cualitativo), serealizara entonces la prueba semicuantitativa (V.D.R.L. cuantitativo), realizando diluciones seriadasdel suero. El titulo corresponderá a la mayor dilución del suero donde se produzca un resultadoreactivo. A continuación se presentan dos ejemplos que muestran los resultados obtenidos despuésde realizado el V.D.R.L. cuantitativo y el reporte correspondiente, según el caso o suero examinado.El reporte mencionado le es enviado posteriormente al médico que prescribió la prueba enreferencia. Reacciones de Aglutinación y Hemaglutinación Las pruebas de aglutinación, son aquellas reacciones que se caracterizan por la formación deagregados visibles, cuando se mezclan antígenos (Ags) particulados o insolubles (aglutinógenos)con sus anticuerpos (Acs) específicos (aglutininas). Los aglutinógenos mas frecuentes utilizados enla reacción son: bacterias, partículas inertes (de latex, poliestireno, bentonita, etc) sobre la cual sehan acoplado Ags solubles. Los agentes que actúan como antígenos no necesariamente debenestar vivos, porque reaccionan igual estando muertos. En estas reacciones también se utilizan glóbulos rojos, bien sea para detectar Ags propios desu membrana (tipificación ABO y factor Rh) o también para ser utilizados como reactivos en variaspruebas de laboratorio. Cuando se utilizan como reactivos, previamente se absorben sobre susuperficie Ags solubles o Acs, se dice que los globulos rojos se han sensibilizado in vitro. Cuando seutilizan globulos rojos, la reacción se denomina hemaglutinación y los Acs involucrados,hemaglutininas. 1. Generalidades de las reacciones de Aglutinación Estas pruebas pueden detectar el Ag o el Ac en una muestra biológica y se puede realizar en forma cualitativa o semicuantitativa, no pudiéndose obtener resultados cuantitativos exactos. Sin embargo, la facilidad con que se ejecutan y la capacidad que tienen para detectar pequeñas cantidades de Ag o Ac (alta sensibilidad) las hacen muy útiles en el inmunodiagnóstico. 2. Mecanismo de la reacciónLa unión del aglutinógeno y la aglutinina ocurre en segundos, pero la formación de los agregados,puede tardar desde minutos hasta horas o días. En estas reacciones el Ag o aglutinógeno debe ser
  5. 5. multivalente. Esto conlleva la formación gradual de un entrecruzamiento (una red) entre el Ac y losdeterminantes antigénicos, que al final de la reacción da como resultado la formación de grumosvisibles. 3. Utilidad Clínica de las reacciones de Aglutinacón: • Detección de aglutininas en el suero de pacientes con: salmonelosis, brucelosis, leptospirosis, fiebres tíficas, etc. • Determinación del Factor Reumatoideo en la Artritis Reumatoidea. • Determinación en suero de Proteína C Reactiva (PCR) en procesos inflamatorios. • Determinación en orina de Gonadotrofina Coriónica Humana (GCH) (prueba de embarazo). 4. Utilidad Clinica de las reacciones de Hemaglutinación: • Tipificación ABO y Factor Rh • Determinación de Acs anti-Toxoplasma gondi y anti-tripanosoma cruzi.Prueba de la Anti-Inmunoglobulina Humana (Prueba de Coombs) Este es un método ingenioso para detectar Acs incompletos o bloqueantes. Estos Acsprobablemente son moléculas bivalentes que forman un enlace monógamo (a grupos antigénicos derepetición de la superficie celular), por lo que no se produce la reacción de aglutinación. (Figura 6)Otros autores explican esta observación, basándose en el hecho de que en la superficie celular nohay suficientes determinantes antigénicos para que los Acs superen la repulsión electrostáticanormal que existen entre los Ags.(figura7) Para la obtención de la anti-inmunoglobulina humana o reactivo de Coombs puede utilizarsediversos métodos inmunoquímicos, uno de ellos es el denominado fraccionamiento Igs humanas.Luego de esta fracción se inyecta a una especie animal heteróloga (conejo, carnero). El animalempezara a producir Acs contra las Igs humanas (reactivo de coombs polivalente)
  6. 6. La prueba de Coombs tiene 2 modalidades:• Prueba de Coombs Directa: Detecta la presencia de Acs imcompletos sobre glóbulos rojos provenientes de individuos sensibilizados. El ejemplo clásico, es la detección de Acs anti-Rh sobre los glóbulos rojos de un recién nacido Rh positivo, cuya madre es Rh negativo. Cuando una mujer es factor Rh negativo, que da embarazada y el hijo es factor Rh positivo, entonces de acuerdo al estado funcional de la placenta o en el momento del parto los eritrocitos fetales pueden pasar a la circulación materna. Los glóbulos rojos fetales son antigénicamente extraños a la madre y ella empieza a producir anticuerpos anti-Rh positivo. Estos Acs son de la clase IgG y tienen capacidad de atravesar la placenta, por lo que reacciones con factor Rh positivo de los glóbulos rojos del feto, quedando recubiertos de estos Acs. Estos glóbulos rojos empiezan a ser lisados por el complemento o son destruidos en el bazo y el feto empieza a sufrir de anemia. Cuando el niño nace y se sospecha de anemia hemolítica del recién nacido, el médico ordena Coombs directo para detectar los Acs anti-Rh positivos sobre los glóbulos rojos del recién nacido. Para ello se le extrae sangre al recién nacido y sus glóbulos rojos se hacen reaccionar con el Reactivo de Coombs.
  7. 7. • Prueba de Coombs Indirecta: Detecta la presencia de Acs incompletos en el suero, mediante una reacción en 2 etapas, que comprende la incubación de la muestra sérica con glóbulos rojos con el objeto de sensibilizarlos y en una segunda etapa ocurre la aglutinación de los glóbulos rojos sensibilizados por el reactivo de Coombs. En la misma circunstancia del ejemplo anterior, es importante determinar el título de Acs anti- Rh en la mujer embarazada. Para ello en una primera etapa se hacen reaccionar glóbulos rojos conocidos (Rh positivos) con el suero de la paciente. Luego de un periodo de incubación, en una segunda etapa se añade el reactivo de Coombs (anti-Ig) y si la mujer tiene Acs anti-Rh positivos se observará la aglutinación de los glóbulos rojos. Las pruebas de Coombs pueden usarse para detectar: • Detectar Acs incompletos sobre la membrana plasmática del glóbulo rojo en individuos sensiblizados (coombs directo) • Anemias hemolíticas inducidas por fármacos • Anemia hemolítica del recién nacido • Anemias hemolíticas autoinmunitarias • Detectar Acs incompletos que se encuentran libres en el suero (coombs indirecto)Pruebas de Inmunofluorescencia
  8. 8. Existen sustancias denominadas fluorocromos, que emiten una luz o radiación lumínica(fluorescencia) cuya longitud de onda se ubica dentro del espectro visible cuando se les hace incidirotra luz de menor longitud de onda (mayor energía), como la luz ultravioleta. Entre estas se puedenmencionar: Fluoresceína, Rodamina y naranja de acridina. Estas sustancias tienen la propiedad deque puedan acoplarse a moléculas proteicas tales como los Acs formándose conjugados (Ac al quese le ha acoplado un fluorocromo) que pueden ser utilizados para detectar Ags presentes en lamembrana celular, inmunocomplejos depositados en tejidos y Acs de una determinada especificidadcirculantes en líquidos orgánicos. Con base a lo expuesto, el principio básico en el que se fundamentan las pruebas deinmunofluorescencia, es hacer reaccionar un Ac específico conjugado a un fluorocromo con el Agcorrespondiente y la reacción Ag-Ac. Cabe destacar, que en la apreciación de estas reacciones seusan equipos para permitir visualizar la fluorescencia emitida por el fluorocromo en forma cualitativa(ej., microscopios de fluorescencia) o cuantitativa (ej., microfluorómetros). Los tipos de muestras que se pueden examinar mediante las pruebas deinmunofluorescencia incluyen cortes o biopsias de tejido, alimentos envasados contaminados,suspensiones celulares y líquidos orgánicos. Existen varias modalidades de las pruebas de inmunofluorescencia, de estas las que serealizan con mayor frecuencia figuran la inmunofluorescencia directa e indirecta. En la inmunofluorescencia directa se utilizan Acs conjugados a fluorocromos específicoscontra bacterias, virus, hongos, y parásitos también anti inmunoglobulina humana conjugada a unfluorocromo (ej., en casos de la detección de complejos inmunológicos en diversos tejidos). Elobjetivo de esta modalidad es demostrar la presencia del Ag correspondiente en la muestra que seestá examinando. Entre sus utilidades: • Detecciónn del virus de la rabia en cortes de tejido cerebral de animales • Detección de inmunocomplejos depositados en biopsias de órganos como piel o riñón • Detección de gonococos en secreciones uretrales • Detección de Chlamydia trachomatis en frotis endocervical • Detección de Treponema pallidum en frotis de los exudados de las lesiones pimarias o en las serosidades de las lesiones secundarias cutáneomucosas de pacientes con sífilis. • Identificación y contaje de células B y T en sangre periférica humana El objetivo de la inmunofluorescencia indirecta es la detección de Acs específicos contra un determinado Ag presente en un líquido orgánico, para ello en una primera etapa del procedimiento se hace reaccionar la muestra antigénica con Acs específicos presentes en el suero del paciente. En la segunda etapa se agrega anti-inmunoglobulina humana conjugada a un fluorocromo. Si en la primera etapa se produce la reacción Ag-Ac, se fijará el conjugado de anti- inmunoglobulina humana y por tanto habrá fluorescencia entre sus utilidades: • Detección de Acs antinucleares en pacientes con lupus eritematoso sistémico y de otros autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes. • Detección de Acs específicos que contribuyen al diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas como sífilis, rubeola, sarampión, toxoplasmosis, tripanosomiasis (mal de chagas)Radioinmunoanálisis Estas pruebas se fundamentan en que son procedimientos en los cuales se utilizan Ags oAcs marcados con un isotopo radiactivo con el objeto de estudiar Ags o Acs de una determinadaespecificidad en muestras biológicas. La reacción Ag-Ac se evidencia en estas pruebas mediante la
  9. 9. emisión radiactiva por parte del isotopo que fue utilizado para el marcaje respectivo. Laradioactividad emitida puede ser medida por instrumentos adaptados para tal fin. Es importante destacar, que estas pruebas tienen importantes limitaciones ya que el costode los equipos ya que el costo de los equipos y reactivos radioactivos es muy elevado, además,existen potenciales problemas de contaminación ambiental por el tratamiento inadecuado de losdesechos y por otra parte riesgo de contaminación para el personal de laboratotio. Estas limitacionesy ante el advenimiento de pruebas muy sensibles y específicas que no presentan las desventajasmencionadas (ej., ELISA), han limitado en la actualidad el uso de estos procedimientos. El Radioinmunoanálisis ha sido utilizado en la determinación de: hormonas, drogas,fármacos, IgE total, IgE específica contra un determinado alérgeno, Acs contra parásitos, bacterias yvirus, Ags bacterianos, virales y parasitarios.Pruebas Imunoenzimáticas (ELISA) Estas pruebas se basan en la detección de complejos Ag-Ac mediante el empleo de enzimasunidas al Ag o al Ac, los cuales actúan sobre determinados sustratos para dar origen a productoscoloreados que pueden ser medidos espectrofotométricamente. La intensidad del color serádirectamente proporcional a la cantidad de complejos Ag-Ac que se ha formado y por tantodirectamente proporcional a la concentración del Ac o Ag investigado en la muestra analizada (ej.,suero). Estas pruebas constituyen una de las herramientas actuales mas útiles en el laboratorio deinmunodiagnóstico debido a que las mismas presentan las siguientes ventajas: • Alta sensibilidad y especificidad • Son pruebas de gran aplicabilidad clínica • Son de fácil realización • Son pruebas cuyos resultados se obtienen en un tiempo relativamente corto • Son pruebas seguras ya que los reactivos empleados no presentan riesgos a la salud • Los reactivos empleados por lo general son bastantes estables. Las pruebas de ELISA se pueden realizar de diversas formas o modalidades según el objetivo propuesto, entre estas modalidades figuran el método indirecto y el método de captura, también denominado “de doble Ac” ó “sándwich”. Mediante la aplicación del método indirecto, es posible detectar en muestras obtenidas de pacientes Acs de una determinada especificidad de combinación antigénica, mientras que el desarrollo de la modalidad de captura o de doble Ac, permite la detección de Ags diversos en la muestra analizada (ej., AgsHB son herramientas muy útiles para establecer el diagnóstico de diferentes enfermedades humanas. Las aplicaciones de ELISA abarcan un espectro amplio de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, detección de marcadores tumorales, enfermedades endocrinas, cuantificación de drogas, medicamentos, hormonas, marcadores virales, etc. Aplicaciones clínicas: • Detección de Acs diversos, entre los que figuran: anti-VIH, anti-citomegalovirus humano (IgM/IgG) anti-virus del sarampión, antivirus de la hepatitis B los 2 también con (IgM/IgG), anti-esperma, anti-ovario, autoanticuerpos de diferentes especificidades. • Detección de Acs, tales como: Ags HB, hormonas tiroideas, hormonas de la fertilidad, hormonas esteroideas, ferritina, interleuquinas, interferon gamma, factor de necrosis tumoral, antígeno prostático específico • Dentro de las aplicaciones de estas pruebas inmunoenzimáticas, figura la detección serológica de Acs de clase IgM específica contra una gran variedad de antígenos de diferentes microorganismos infecciosos (ej., IgM anti-toxoplasma gondii, IgM anti-
  10. 10. Tripanosoma cruzi, IgM anti-virus dengue). La presencia de Acs de clase IgM antígeno específica es indicativo que la infección ocurrió recientemente. En casos de los niños recién nacidos se correlaciona con infección congénita o que la infección ocurrió durante el nacimiento.Western-Blot (Inmunotransferencia- Inmunoelectrotransferencia) La prueba WB es una técnica que incluye la transferencia de proteínas desde un gel a unamembrana. Este procedimiento proporciona un medio muy específico para identificar reactividad deAcs en muestras biológicas. Esta técnica se puede realizar con la finalidad de detectar la presenciade Acs contra una determinada proteína antigénica o identificar un determinado Ag. La prueba serealiza en 3 etapas: 1- Separación de los Ags mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) 2- Transferencia de los Ags proteicos separados en la electroforesis inicial, desde el gel a una matriz de soporte 3- Detección de los Acs específicos contra los Ags transferidos al papel de nitrocelulosa ó identificación de de los Ags transferidos a la matriz de soporte mencionada Uno de los usos mas frecuentes de la WB es la confirmación de las pruebas de detección serológica reactivas para Acs anti-VIH. En este caso, los Ags virales se separan mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE. El tratamiento del lisado viral con SDS imparte una carga negativa a las proteínas. Las proteínas virales en seguida son objeto de electroforesis en un gel de poliacrilamida. Como las proteínas están cargadas negativamente migrarán al polo positivo y se separan en función de su peso molecular. Las proteínas mas grandes tendrán una distancia de migración inferior a la exhibida por las proteínas de menor peso molecular. Para la detección de Acs contra los Ags del VIH, las proteínas se transfieren del gel a la matriz de soporte (papel de nitrocelulosa). Esta transferencia tiene como resultado una copia exacta del patrón del gel en matriz. La tira de papel de nitrocelulosa donde se han transferido los Ags virales se incuba con el suero del paciente. Cabe destacar, que tiras de papel de nitrocelulosa similares se incuban simultáneamente con sueros controles positivos y negativos. Si el suero del paciente tiene Acs específicos contra los Ags del VIH, estos interaccionarán con los Ags virales respectivos. Después del lavado para eliminar todo aquello que no se haya combinado, se procede a revelar la reacción Ag-Ac. Existen varios procedimientos de revelado, uno de los mas utilizados es agregar antiinmunoglobulina humana conjugada a una enzima. El conjugado en referencia se combinará con el Ac anti-VIH que esta interaccionando con el Ag fijado a la matriz de nitrocelulosa de un determinado peso molecular. Seguidamente se agrega el sustrato de la enzima, el cual se transformará en productos insolubles coloreados que precipitan en la zona de reacción, dejando una “mancha coloreada” visible al ojo humano. La presencia del precipitado coloreado es indicativo que el suero del paciente tenía Acs contra la proteína antigénica de VIH. Cabe destacar, que el suero del paciente puede tener Acs específicos contra diferentes proteínas virales de diferentes pesos moleculares, por lo que mediante esta prueba pueden detectarse la presencia de estos. Las reaccionas se reportan como positivas cuando una línea de precipitación coloreada se forma en la zona del papel de nitrocelulosa donde estaba presente el correspondiente Ag viral de un determinado peso molecular. La prueba WB ha demostrado ser muy útil en la identificación de ags importantes enmicroorganismos bacterianos, micóticos, virales y parasitarios, además tiene otras aplicacionesclínicas aparte de ser utilizada como prueba confirmatoria de la infección por VIH: • Diagnóstico de enfermedad gastrointestinal autoinmune • Diagnóstico de enfermedad reumatoide autoinmune • Diagnóstico de Vasculitis autoinmune
  11. 11. Unidad Hemolítica CH50 se define como la cantidad de suero necesario para realizar el 50 % dehemólisis de una suspensión de eritrocitos de carnero, sensibilizados con anticuerpos anticarnero deconejo (hemolisina). Pruebas de Inmunohemólisis (Complemento Hemolítico Total CH50)Principio de la Inmunohemólisis: Se refiere a la liberación de hemoglobina por parte de eritrocitos,luego que éste interactúa con un Ac específico para determinantes antigénicos situados en susuperficie, debido a la participación del sistema del complemento en el suero de un paciente. Lascélulas utilizadas son glóbulos rojos de carnero o de conejo.Análisis Cuantitativo de la actividad hemolítica del complemento (Prueba del ComplementoHemolítico Total CH50: Es una prueba funcional que refleja la actividad de los componentes de lavía clásica del complemento. Esta prueba resulta útil para evaluar la integridad del sistema,particularmente en casos de deficiencias genéticas donde la ausencia de uno de los componentesse refleja en títulos bajos de Unidades Hemolíticas CH50.Principio: El análisis cuantitativo de la actividad hemolítica del complemento, basado en la unidadhemolítica CH50 depende de la capacidad de la vía clásica del complemento para inducir lahemólisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerposantieritrocito (hemolisina). Luego se añade el suero del paciente y finalmente se determina el gradoo porcentaje de hemólisis. La hemólisis ocasionada por los componentes de la vía clásica delcomplemento se mide de manera espectrofométrica y puede relacionarse la cantidad de suero conla cantidad de hemoglobina liberada.Determinación del título en la Prueba de Complemento Hemolítico Total CH50: Para la realizaciónde la prueba, inicialmente se añade a una serie de tubos de ensayos cantidades variables ycrecientes del suero diluido 1/50 en estudio al sistema indicador (eritrocitos de carnero masanticuerpos antieritrocitos) Después de un periodo de incubación adecuado se determina la cantidadde hemoglobina liberada con ayuda de un espectrofotómetro. Seguidamente se determina elporcentaje de hemólisis obtenida en cada tubo. A continuación se grafica en un papel milimetradoporcentaje de hemólisis (ordenada) y el volumen de suero diluido 1/50 que se agregó a cada tubo(abscisa) lo que permite calcular el volumen de suero diluido 1/50 necesario para causar lahemólisis del 50% de los eritrocitos indicadores, el valor obtenido constituye la unidad hemolíticaCH50. Finalmente se determina el título el cual es reportado al médico que prescribió la prueba.
  12. 12. Pruebas de Neutralización La neutralización o actividad neutralizante se refiere a la capacidad de un suero inmuneespecífico (antisuero o acs específicos) de reducir o inhibir la actividad biológica de unmicroorganismo o de algún producto derivado del mismo. Esta propiedad de los Acs ha permitidodesarrollar un conjunto de técnicas de laboratorio, las cuales se identifican de manera genérica conel término de “pruebas o reacciones de neutralización”. Estas pruebas presentan variasmodalidades, las cuales están directamente relacionadas con el tipo de microorganismo o productoderivado del mismo, cuya actividad biológica ha sido objeto de neutralización total o parcial por undeterminado Ac o antisuero específico.Modalidades de las pruebas de neutralización La mayoría de las pruebas de neutralización que tienen utilidad clínica se pueden agrupar en3 modalidades: • Neutralización de toxinas (exotoxinas) y productos extracelulares secretados por bacterias. • Neutralización de enzimas • Neutralización ViralNeutralización de Toxinas bacterianas y productos extracelulares secretados por bacterias Algunos microorganismos bacterianos elaboran y secretan toxinas, enzimas y otrosproductos (hemolisinas, leucocidinas, hialuronidasa, entre otros). Dichos productos contribuyen a lapatogenicidad, virulencia y poder invasivo de las bacterias. Muchos de estos productos soninmunogénicos, por lo que estimulan en el hospedador una respuesta inmune humoral específicacontra los mismos. Un ejemplo de este tipo de prueba lo constituye la prueba de Antiestreptolisina“O” la cual es útil en el diagnóstico de infecciones causadas por estreptococos beta hemolíticos delgrupo A (bacterias patógenas al hombre) estos pueden ocasionar enfermedades, tales comoinfecciones agudas (ej., faringitis estreptocócicas), erisipela (inflamación de la piel), escarlatina(erupción eritemato-papulosa difusa) y procesos tardíos, producto de complicaciones de infeccionesestreptocócicas no tratadas (ej., fiebre reumática y glomerulonefritis aguda). Este grupo bacterianoproduce Estreptolisina “O” y la secretan a los tejidos infectados; esta es una hemolisina y ocasiona
  13. 13. la hemólisis de eritrocitos (ej., eritrocitos humanos, de carnero y de conejo). Los pacientes infectadosproducen Acs Antiestreptolisina “O” que neutralizan la actividad hemolítica de la estreptolisina “O”.Los Acs mencionados se encuentran presentes en casi todas las personas a títulos bajos. Debido aque estas infecciones son comunes, un título alto o creciente es indicativo de infección reciente porestos microorganismos. El Fundamento metodológico de la misma se resume de la siguiente manera: • Se colocan diluciones (crecientes) de un suero (paciente) en presencia de un volumen constante de estreptolisina “O” • Se produce la reacción Ag/Ac que neutraliza la actividad hemolítica de la estreptolisina “O” • La neutralización se evidencia por la inhibición de la hemólisis al agregar un volumen constante de una suspensión de eritrocitos (3,5%) • El título de Antiestreptolisina “O” se calcula determinando la recíproca (el inverso) de la máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente a la Estreptolisina “O” ( es decir, lamayor dilución del suero donde no se observa hemólisis alguna) • El título se expresa en “unidades Todd/ml” • Valores referenciales normales oscilan alrededor de 166 unidades Todd/ml.Pruebas Dérmicas de Hipersensibilidad Retardada La prueba de piel de hipersensibilidad retardada es la técnica mas antigua para evaluar lainmunidad mediada por células. A pesar del desarrollo de multitud de procedimientos complejos parala evaluación de la inmunidad celular, las pruebas intradérmicas, relativamente simple, permanececomo un arma muy útil y a menudo contribuye para establecer el diagnóstico de diversas patologías. La reacción de hipersensibilidad retardada es una respuesta inmune adaptativa mediada porcélulas que se genera como consecuencia de la inyección intradérmica de un Ag a la cual la personase han sensibilizado previamente, es decir, la respuesta es inducida por los linfocitos T de memoriainmunológica que se generaron como producto de una respuesta previa contra el Ag que seadministra a nivel de piel. Al nivel celular la inyección de un Ag causa una inflamación detectable e infiltración decélulas mononucleares dentro de las primeras 16 horas. La reacción se intensifica alcanzado sumáximo 48-72 horas después de la inyección observándose en la superficie de la piel un áreaeritematosa y una induración palpable, siendo esta última verdaderamente significativa y la quedetermina si la prueba es positiva o negativa. Estas pruebas detectan hipersensibilidad cutánea a un antígeno o grupos de antígenos. Sinembargo, cuando se efectúan pruebas para una enfermedad infecciosa, una respuesta positiva noindica una infección activa con el microorganismo, sino más bien exposición previa almicroorganismo. La incapacidad para reaccionar contra un conjunto de antígenos cutáneos habitualmenteutilizados en este tipo de pruebas se denomina anergia o anergia cutánea, lo que sugiere que larespuesta inmune celular del paciente está deteriorada. Los trastornos clínicos vinculados con esteestado anérgico se observan en una gran varieadad de afecciones tales como: inmunodeficienciascongénitas, inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades coexistentes, enfermedades infecciosas ytratamientos farmacológicos Para el desarrollo de estas pruebas se utilizan antígenos de diversos microorganismos. Entrelos antígenos que con mayor frecuencia se utilizan en nuestro país para realizar este tipo de pruebadérmica:PPD TuberculinaCandidina Extracto antigénico del hongo candida albicansSk/SD(estreptoquinasa/estreptodornasa) Enzimasproducidas porbacterias(estreptococos)
  14. 14. Trycophyton Extracto antigénico del hongo La prueba se considera positiva si el promedio de los 2 diámetros perpendiculares de lainduración resultan mayores o iguales a 5 mm por el contrario la prueba resultaría negativa si eldiámetro de la induración es inferior a 5 mm o si se observa sólo eritema.Utilidad: Las pruebas de hipersensibilidad retardada también son de gran valor en estudiosepidemiológicos, ya que permite evidenciar infecciones previas ocasionadas por microorganismosbacterianos, micóticos y parasitarios, estos estudios epidemiológicos son de utilidad para determinarla prevalencia de la infección y/o la endenmicidad de un microorganismo en una determinadapoblación. Entre los Ags utilizados en nuestro país para realizar estos estudios epidemiológicosfiguran: tuberculina, leishmanina, toxoplasmina, histoplasmina y paracoccidiodina.Indice CD4/CD8 Se estima que del total de los linfocitos de sangre periférica humana entre 70 y 75% sonlinfocitos T, mientras que el 20% son células B y el resto de los linfocitos pueden considerarsecélulas nula o células NK. Asimismo, se ha señalado que en sangre periférica y en la mayoría de lostejidos linfoides secundarios la proporción de células CD4+ es de 65% mientras que la proporción decélulas CD8+ es de 35%. Muchos laboratorios expresan los resultados de contaje de célulascooperadoras/citotóxicas, como un índice o cociente (índice CD4/CD8) cuyo valor de referencianorma se ha establecido entre 1,5 y 2.
  15. 15. Pruebas de Transformación Linfoblástica Las pruebas de transformación linfoblástica miden la capacidad funcional de los linfocitos deproliferar luego de un estimulo inducido por un Ag o mitógeno y es por lo tanto una prueba deinmunocompetencia. La activación de linfocitos es una técnica in vitro comúnmente utilizada paraevaluar la inmunidad celular y es aplicable en los casos de pacientes con inmunodeficienciascongénitas o adquiridas, autoinmunidad, enfermedades infecciosas, cáncer, entre otras. Estaspruebas permiten la exploración invitro de la depresión invivo de la inmunidad mediada por célulasen combinación con otras pruebas de inmunidad celular y el seguimiento longitudinal del hospedadorinmunocomprometido. Este procedimiento se refiere a una correlación in vitro de un proceso que ocurrenormalmente in vivo cuando el Ag interactúa con linfocitos específicamente sensibilizados en elindividuo. Asi, cuando los linfocitos aislados de sangre periférica son cultivados in vitro en presenciade mitogenos o antígenos éstos proliferan en respuesta al estímulo; lo que se conoce comoblastogénesis o transformación blástica. Cuando los linfocitos son estimulados ocurre una gran variedad de cambios morfológicos ybioquímicos que incluyen fenómenos tales como incremento en: la formación de linfoblastos, síntesisde proteínas y síntesis de ADN. Este último evento tardío es el que a la larga origina la divisióncelular y constituye la base de la mayor parte de los análisis de relevancia clínica para latransformación de linfocitos. Es precisamente la síntesis de ADN lo que los inmunólogos utilizancomo indicador de activación linfocitaria. Los activadores policlonales ó mitógenos, son sustancias capaces de inducir laproliferación de linfocitos pertenecientes a múltiples clones, en otras palabras los mitógenosestimulan en forma no específica la linfoblastogénesis de múltiples clones celulares sin lasensibilización previa del individuo e independientemente de la especificidad de combinaciónantigénica de su receptor de membrana.
  16. 16. En el caso de los activadores oligoclonales o antígenos utilizados en las pruebas detransformación linfoblástica, la blastogénesis o activación de los linfocitos dependerá de lasensibilización previa que in vivo haya tenido el individuo con el antígeno en particular. Además, larespuesta será producto de la activación de un número restringido de clones de linfocitossensibilizados, es decir, solo se estimularán aquellos clones de linfocitos que posean en sumembrana receptores antigénicos capaces de interactuar con los determinantes antigénicos quetenga el antígeno utilizado en la prueba, la misma es por lo tanto específica. Entre los antígenos másutilizados en la prueba de transformación linfoblástica en nuestro país, figuran:PPD, extracto deCandida albicans (candidina), toxoide tetánico y la estreptolisina “O”.Utilidad Clínica Los ensayos de transformación linfoblástica proveen un medio práctico y adecuado paradeterminar y controlar estados de inmunodeficiencia genética y adquirida. Además provee unindicador sensible de función linfocitaria deprimida, asi como también los efectos de diversasterapias inmunoestimulantes o inmunosupresoras. Se ha sugerido que el grado de deterioro de lareactividad linfocítica en paciente con cáncer y el mejoramiento de éstas siguiente a la resección oquimioterapia, se puede utilizar como indicadores del pronóstico de estado inmunitario de estospacientes. Asimismo, provee una poderosa herramienta para detectar reacciones inmunitarias haciaagentes patógenos, alérgenos y autoantígenos.

×