СПЕЦКУРС

ОПТИЧЕСКИЙ БИОИМИДЖИНГ
лекция 1
Турчин Илья Викторович
ИПФ РАН, отдел радиофизических методов в медицине
НижГМА,...
Электромагнитное излучение
Видимый и ближний инфракрасный диапазон (400-1300 нм)
Виды фотовоздействия на биологические ткани

Облученность [Вт/см2]

Фотоакустические повреждения

Лазерная хирургия (фоток...
Диагностика биотканей оптическими методами
Видимый и ближний инфракрасный диапазон длин волн (400-1300 нм) в
приложениях к...
Распространение света в биологических тканях
• Рассеяние – фотон отклоняется от своего первоначального
направления

Источн...
Рассеяние в тканях обусловлено микронеоднородностями
показателя преломления n

n

Размер, µm

Клетка

1.36-1.4

5-30

Ядро...
Нерассеивающая
(слабо рассеивающая среда)
Примеры: рентгеновское излучение,
оптическое излучение в оптически
прозрачных об...
Зависимость поглощения света в биотканях от длины волны

Терапевтическое окно прозрачности
биотканей, где поглощение света...
Формирование оптического изображения (оптический контраст)
Свойства биологических тканей:
- рассеяние,
- поглощение света,...
Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами
Зондирующее излучение
Спектральный
диапазон

Методы оптич...
Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами
Зондирующее излучение
Спектральный
диапазон

Методы оптич...
Флуоресцентная микроскопия
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет получать
флуоресцентные изображе...
Конфокальная лазерная сканирующая
микроскопия (КЛСМ)
(Laser scanning microscopy (LSM))
(LSM

Широкопольная микроскопия

Ск...
Флуоресцентная КЛСМ

Фотодетектор
(ФЭУ)
Пинхол
детектора
Эмиссионный
фильтр

Источник
возбуждающего
излучения
(лазер)

Дих...
Сравнение широкопольной микроскопии и
конфокальной микроскопии
Функция размытия
точки (ФРТ) – point
spread function

Поле ...
Сравнение широкопольной микроскопии и КЛСМ

Широкопольная
микроскопия

Конфокальная
микроскопия

(a) and (b) Mouse brain h...
Применение многофотонной КЛСМ в медицинской диагностике
http://www.jenlab.de/

• Диагностика различных кожных заболеваний,...
Дифракционный предел в конфокальной микроскопии
ограничивает разрешение метода –
световой луч нельзя сфокусировать в пятно...
Методы микроскопии сверхвысокого разрешения
позволяют «преодолеть» дифракционный предел:
• Stimulated emission depletion (...
Микроскопия сверхвысокого разрешения –
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)
Флуоресценция одной молекулы
и...
Принцип действия STORM
Флуоресценция нескольких молекул

http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%...
Принцип действия STORM
1. Перевод молекул в неактивное состояние

http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring...
Принцип действия STORM

2. На небольшом участке одна молекула под воздействием
активирующего излучения стохастически переш...
Принцип действия STORM

3. Высвечивание молекулой большого количества фотонов
привело к ее фотообесцвечиванию (либо молеку...
Принцип действия STORM
4. Под воздействием активирующего света стохастически в
активное состояние перешла другая молекула
...
Принцип действия STORM
5. V.потом другая

http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%200...
Принцип действия STORM
V.и так далее

http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%2002250...
Принцип действия STORM
Таким образом, метод определил
положения всех молекул в данной области с точностью,
превышающей диф...
КЛСМ

5 µm
B-SC-1 cell,
Microtubules stained with anti-β tubulin
Cy3 / Alexa 647 secondary antibody
http://online.physics....
STORM

5 µm
Bates et al, Science 317, 1749 – 1753 (2007)
КЛСМ

STORM

500 nm

5 µm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.pp...
STORM

█ Cy3 / Alexa 647: Clathrin (Клатрин)
█ Cy2 / Alexa 647: Microtubule
(микротрубка)

5 µm
Bates et al, Science 317, ...
STORM

1 µm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
STORM

Avg = 172 nm

200 nm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM....
Флуоресцентная ультрамикроскопия
просветленных образцов биоткани
5

ИПФ РАН/
ИНФ РАН

3

1

3

4
2

Ультрамикроскопия

КЛС...
Институт прикладной физики РАН, лаборатория биофтоники –
разработка методов оптического биоимиджинга

микроскопия
Оптоакус...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

лекция нижгма 2013_лекция 1

898 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
898
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

лекция нижгма 2013_лекция 1

  1. 1. СПЕЦКУРС ОПТИЧЕСКИЙ БИОИМИДЖИНГ лекция 1 Турчин Илья Викторович ИПФ РАН, отдел радиофизических методов в медицине НижГМА, научная лаборатория флуоресцентного биомиджинга НИИ БМТ E-mail: ilya@ufp.appl.sci-nnov.ru http://bioimaging.ru/ Тел.: 8(831)4368010 Нижний Новгород 2013
  2. 2. Электромагнитное излучение Видимый и ближний инфракрасный диапазон (400-1300 нм)
  3. 3. Виды фотовоздействия на биологические ткани Облученность [Вт/см2] Фотоакустические повреждения Лазерная хирургия (фотокоагуляция и фотоабляция) 0.1 J/cm2 Тепловое разрушение Фотодинамическая терапия Диагностика Время воздействия [сек] Encyclopedia of Optical Engineering, 2004
  4. 4. Диагностика биотканей оптическими методами Видимый и ближний инфракрасный диапазон длин волн (400-1300 нм) в приложениях к медико-биологическим исследованиям • Неинвазивность (при разумных дозах излучения) •Высокое пространственное разрешение (различные виды микроскопии) • Возможность визуализации на глубине (оптическая томография) • Возможность определения компонентного состава биологических тканей (использование зондирующего излучения на нескольких длинах волн) • Возможность использования оптических контрастов (специфическое окрашивание)
  5. 5. Распространение света в биологических тканях • Рассеяние – фотон отклоняется от своего первоначального направления Источники света (фотонов) •Поглощение – фотон поглощается, выделяется тепло. При поглощении короткого светового импульса (наносекундного) из места поглощения распространяется ультразвуковая волна •Флуоресценция – фотон поглощается веществом (флуорофором) и переизлучается на другой длине волны
  6. 6. Рассеяние в тканях обусловлено микронеоднородностями показателя преломления n n Размер, µm Клетка 1.36-1.4 5-30 Ядро 1.39-1.47 3-10 Митохондрия 1.40-1.42 0.5-3
  7. 7. Нерассеивающая (слабо рассеивающая среда) Примеры: рентгеновское излучение, оптическое излучение в оптически прозрачных объектах Сильно рассеивающая среда Примеры: оптическое излучение практически во всех биологических тканях Детекторы Детекторы Источники Источники
  8. 8. Зависимость поглощения света в биотканях от длины волны Терапевтическое окно прозрачности биотканей, где поглощение света минимально: 600 -1200 нм УФ ИК микроволны Зависимость ослабления света от длины волны при прохождении сквозь слой биоткани Длина волны, нм Зависимость показателя поглощения различных компонент биологических тканей от длины волны
  9. 9. Формирование оптического изображения (оптический контраст) Свойства биологических тканей: - рассеяние, - поглощение света, - зависимость оптических параметров от длины волны, - автофлуоресценция. Использование специфического окрашивания: - флуоресцентные метки, - биолюминесцентные метки, - метки с высоким показателем поглощения/рассеяния.
  10. 10. Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами Зондирующее излучение Спектральный диапазон Методы оптического биоимиджинга Микроскопия (контраст - показатель преломления, флуорофоры) Глубина исследования 100 -200 микрон Любой: 400-1200 нм (от видимого до ближнего ИК) Оптическая когерентная томография (контраст – показатель рассеяния) 1-2 мм Оптоакустическая томография 2-20 мм (контраст – показатель поглощения) Оптическая диффузионная томография (контраст - показатели рассеяния и поглощения), От нескольких миллиметров до 10 см диффузионная флуоресцентная томография (контраст - флуорофоры), глубина 600-1200 нм (дальнекрасный – ближний ИК диапазоны) 700-950 нм (минимальное поглощение)
  11. 11. Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами Зондирующее излучение Спектральный диапазон Методы оптического биоимиджинга Микроскопия (контраст - показатель преломления, флуорофоры) Глубина исследования 100 -200 микрон Любой: 400-1200 нм (от видимого до ближнего ИК) Оптическая когерентная томография (контраст – показатель рассеяния) 1-2 мм Оптоакустическая томография 2-20 мм (контраст – показатель поглощения) Оптическая диффузионная томография (контраст - показатели рассеяния и поглощения), От нескольких миллиметров до 10 см диффузионная флуоресцентная томография (контраст - флуорофоры), глубина 600-1200 нм (дальнекрасный – ближний ИК диапазоны) 700-950 нм (минимальное поглощение)
  12. 12. Флуоресцентная микроскопия Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет получать флуоресцентные изображения образцов биотканей с высоким качеством с глубины до 200 микрон Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медикобиологических исследований. Синтезированные флуорофоры Флуоресцентные белки
  13. 13. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) (Laser scanning microscopy (LSM)) (LSM Широкопольная микроскопия Сканирующее устройство Лазер Приемник Пинхол детектора (конфокальная диафрагма) Объектив Поперечное (1) и продольное (2) разрешение для КЛСМ Widefield microscopy
  14. 14. Флуоресцентная КЛСМ Фотодетектор (ФЭУ) Пинхол детектора Эмиссионный фильтр Источник возбуждающего излучения (лазер) Дихроическое зеркало Объектив Пинхол источника Фокальные плоскости Образец http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
  15. 15. Сравнение широкопольной микроскопии и конфокальной микроскопии Функция размытия точки (ФРТ) – point spread function Поле подсветки X Широкопольная микроскопия (widefield microscopy) Z Конфокальная микроскопия (confocal microscopy) http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
  16. 16. Сравнение широкопольной микроскопии и КЛСМ Широкопольная микроскопия Конфокальная микроскопия (a) and (b) Mouse brain hippocampus thick section treated with primary antibodies to glial fibrillary acidic protein (GFAP; red),neurofilaments H (green), and counterstained with Hoechst 33342 (blue) to highlight nuclei. (c) and (d) Thick section of rat smooth muscle stained with phalloidin conjugated to Alexa Fluor 568 (targeting actin; red), wheat germ agglutinin conjugated to Oregon Green 488 (glycoproteins; green), and counterstained with DRAQ5 (nuclei; blue). (e) and (f) Sunflower pollen grain tetrad autofluorescence. http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
  17. 17. Применение многофотонной КЛСМ в медицинской диагностике http://www.jenlab.de/ • Диагностика различных кожных заболеваний, в т.ч. раннее обнаружение злокачественных новообразований • Тканевая инженерия • Исследование применения косметических препаратов • Мониторинг действия лекарственных препаратов in situ • Исследования на лабораторных животных Виртуальный срез кожи человека in vivo (Papilla) (Зеленый цвет: автофлуоресценция; красный: двухфотонное возбуждение)
  18. 18. Дифракционный предел в конфокальной микроскопии ограничивает разрешение метода – световой луч нельзя сфокусировать в пятно меньшего размера 500 нм 200 нм Длина волны Линза
  19. 19. Методы микроскопии сверхвысокого разрешения позволяют «преодолеть» дифракционный предел: • Stimulated emission depletion (STED) • Photoactivated Localization Microscopy (PALM) • Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)
  20. 20. Микроскопия сверхвысокого разрешения – Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) Флуоресценция одной молекулы и положение ее центра Флуоресценция нескольких близко расположенных молекул Локализация молекул путем последовательного их включения http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  21. 21. Принцип действия STORM Флуоресценция нескольких молекул http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  22. 22. Принцип действия STORM 1. Перевод молекул в неактивное состояние http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  23. 23. Принцип действия STORM 2. На небольшом участке одна молекула под воздействием активирующего излучения стохастически перешла в активное состояние, в котором способна флуоресцировать http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  24. 24. Принцип действия STORM 3. Высвечивание молекулой большого количества фотонов привело к ее фотообесцвечиванию (либо молекула была переведена в неактивное состояние лазерным излучением) http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  25. 25. Принцип действия STORM 4. Под воздействием активирующего света стохастически в активное состояние перешла другая молекула http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  26. 26. Принцип действия STORM 5. V.потом другая http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  27. 27. Принцип действия STORM V.и так далее http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  28. 28. Принцип действия STORM Таким образом, метод определил положения всех молекул в данной области с точностью, превышающей дифракционный предел http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  29. 29. КЛСМ 5 µm B-SC-1 cell, Microtubules stained with anti-β tubulin Cy3 / Alexa 647 secondary antibody http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  30. 30. STORM 5 µm Bates et al, Science 317, 1749 – 1753 (2007)
  31. 31. КЛСМ STORM 500 nm 5 µm http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  32. 32. STORM █ Cy3 / Alexa 647: Clathrin (Клатрин) █ Cy2 / Alexa 647: Microtubule (микротрубка) 5 µm Bates et al, Science 317, 1749 – 1753 (2007)
  33. 33. STORM 1 µm http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  34. 34. STORM Avg = 172 nm 200 nm http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
  35. 35. Флуоресцентная ультрамикроскопия просветленных образцов биоткани 5 ИПФ РАН/ ИНФ РАН 3 1 3 4 2 Ультрамикроскопия КЛСМ мозжечок взрослой мыши (a) z, мм (Глубина) (b) 1 х, мм эмбрион мыши Б
  36. 36. Институт прикладной физики РАН, лаборатория биофтоники – разработка методов оптического биоимиджинга микроскопия Оптоакустика Диффузионная флуоресцентная томография Диффузионная спектроскопия Ультрамикроскопия (a) 50 40 30 20 10 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 90 (b)

×