Validación de métodosy determinación de laincertidumbre de la medición:“Aspectos generales sobre lavalidación de métodos”
•Comité Editor   Boris Duffau   Fabiola Rojas   Isabel Guerrero   Luis Roa   Luis Rodríguez   Marcelo Soto   Marisol Aguil...
I: INTRODUCCION   El Instituto de Salud Pública de Chile, como Laboratorio Nacional y de Referencia colabora        contin...
CONTENIDOI: INTRODUCCION                                        2II: TERMINOLOGÍA                                       4I...
II: TERMINOLOGÍA:Adecuación al propósito: Es el grado en que la aplicabilidad de un método se ajusta a los criterios orequ...
Ensayo: Operación técnica realizada de acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en ladeterminación cualitativa ...
Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompañado de documentación,emitida por un órgano autoriz...
Resolución: Parámetro cromatográfico que permite determinar la capacidad de separación entre 2picos, de manera que se pued...
II: ESTADISTICA BASICAPara los fines de una validación, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadísticas, que nosay...
Coeficiente de Variación de Horwitz (CV h): Es el coeficiente de variación definido por W. Horwitz, através de la ecuación...
Distribución Normal: Distribución continua conocida también como distribución Gaussiana, la distribución de una variable n...
Pruebas de SignificanciaEs frecuente utilizar pruebas de significancia estadísticas durante el proceso de validación de lo...
Prueba t-StudentEsta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parámetroslas di...
Si el valor t calculado es superior al t crítico, entonces, existirá una diferencia significativa que  permitirá superar a...
t calc =                    5,70         -        6,76             .                 (0,9716) 2 (6-1) + (0,8877) 2 (5-1)...
EJEMPLO 2: Prueba t-student para 2 variables correlacionadas o pareadasSe realiza el análisis de una muestra de turbiedad ...
EJEMPLO 3: Prueba t-student para comparación de muestreal versus un valor de referenciaSe analiza de un material de refere...
Prueba F (de Fisher) Prueba en la que el estadístico utilizado sigue una distribución F si la hipótesis nula no puede serr...
3) Dividir la varianza más grande por la más pequeña:                                            F= Varianza mayor = Varia...
Análisis de VarianzaEl análisis de varianza, también conocido como ANOVA, es el análisis estadístico en el cual se compara...
Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los métodos:Se realiza por simple resta, es decir:SC w ...
IV: VALIDACIONLa validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultadosentregado por di...
La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el métodode ensayo normalizado y...
Definición del método a Validar:                        Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentración-Principio       ...
En relación a los parámetros de validación o verificación estos deberán determinarse de acuerdo al tipo de método. Para es...
•   Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validación. •   Responsable de la Validación, fecha o tie...
D) INFORME DE VALIDACIÓNEl responsable de la validación, deberá realizar un informe en el cual presentará los resultadosob...
SELECTIVIDADLa selectividad es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia deinterfer...
LINEALIDADLa linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar unarespuesta ...
En general el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficientede correlación:...
Ejemplo:                                                                Desviación  Nivel      Conc      Área    Área     ...
El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un α = 0.05 y 2 colas es:                             ...
Sustituyendo obtendríamos:                                   SR = 0,1· 2 (0,0000001)−0,1505 = 0,0233                      ...
SENSIBILIDADLa sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición y el cambiocorrespon...
LIMITESSe debe tener en consideración los siguientes parámetros: Valor critico, limite detección (LOD) y limitede cuantifi...
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo oconcentración estimada cerca...
Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5de 0,1 mg/Kg.Por lo cua...
EXACTITUDEl manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultadode un ensayo...
VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una seriede resultados y un valor...
Ejemplo ejercicio de sesgo:Para un valor asignado de un material de referencia certificado de 20,1 mg/L de N-NO2, losvalor...
b) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes delanálisis, al ser ...
Si el tcalc ≤ tcrit (no hay diferencia estadísticamente significativa), no es necesario ninguna corrección.El Criterio de ...
Se desea determinar si existe diferencia significativa entre el valor de % recuperación determinado y el10% de Recuperació...
Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validación de un método, deben participar d...
Si el valor asignado es de 1 mg/Kg , para el calculo de Coeficiente de variación porcentual de horwitz ,el valor nominal d...
ROBUSTEZLa robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado porvariaciones pequeñas...
A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media delos cuatro análisis...
Guia técnica 1 validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición 1
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  1. 1. Validación de métodosy determinación de laincertidumbre de la medición:“Aspectos generales sobre lavalidación de métodos”
  2. 2. •Comité Editor Boris Duffau Fabiola Rojas Isabel Guerrero Luis Roa Luis Rodríguez Marcelo Soto Marisol Aguilera Soraya Sandoval “Se agradece la colaboración prestada por el Sr. Leonardo Merino de la National Food Administration de Suecia, para la elaboración de esta Guía” •Coordinación Edición Soraya Sandoval Sección Metrología Ambiental y de Alimentos Departamento de Salud Ambiental • Edición Año 2010 Santiago, Diciembre de 2010.GUÍA TÉCNICA N º 1 1
  3. 3. I: INTRODUCCION El Instituto de Salud Pública de Chile, como Laboratorio Nacional y de Referencia colabora continuamente con la Red de Laboratorios del Ambiente de las SEREMIs de Salud.La presente guía tiene como objetivo, entregar recomendaciones a los laboratorios para realizar la validación de los métodos analíticos e introducir a estos en el concepto de incertidumbre de la medición. GUÍA TÉCNICA N º 1 2
  4. 4. CONTENIDOI: INTRODUCCION 2II: TERMINOLOGÍA 4II: ESTADISTICA BASICA 8IV: VALIDACION 21A) establecer plan de validación 24B) Desarrollo de pruebas de parámetros de validación 25C) Evaluación de resultados de la validación 25D) Informe de validación 26 SELECTIVIDAD 27 LINEALIDAD 28 SENSIBILIDAD 33 LIMITES 34 EXACTITUD 37 ROBUSTEZ 45 APLICABILIDAD 49V: INCERTIDUMBRE 50VI: ANEXOS 54VII: BIBLIOGRAFÍA 66 GUÍA TÉCNICA N º 1 3
  5. 5. II: TERMINOLOGÍA:Adecuación al propósito: Es el grado en que la aplicabilidad de un método se ajusta a los criterios orequerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso de los informes odatos generados a través de un método de ensayo. Es decir es la adaptación de un método para un finprevisto.Analito: Sustancia (química, física o biológica) buscada o determinada en una muestra, que debe serrecuperada, detectada o cuantificada por el método.Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede utilizarsesatisfactoriamente un método de análisis con el fin de determinar su conformidad con una norma.(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16º Ed.) Nota: La declaración de aplicabilidad (ámbito o campo de aplicación), además de una declaración del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede incluir también advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.)Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de interés u objetivo para el método seleccionado.Calibración: Operación que, en condiciones especificadas, establece primero una relación entre losvalores con incertidumbres de medición proporcionados por las normas de medición y las indicacionescorrespondientes con las incertidumbres de medición asociadas, y utiliza luego esta información paraestablecer una relación a fin de obtener un resultado de medición a partir de una indicación.(Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Nota1 : La calibración se puede expresar por medio de una declaración, una función, un diagrama, una curva o una tabla. En algunos casos puede consistir en una corrección aditiva o multiplicativa de la indicación con la incertidumbre de medición asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Nota 2: La calibración no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medición que a menudo se denomina erróneamente “autocalibración”, ni tampoco con la verificación de la calibración. A menudo se percibe como calibración solamente el primer paso mencionado en la definición anterior. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Es decir, es un procedimiento de comparación entre lo que indica un instrumento y su "valor verdadero" de acuerdo a un patrón de referencia con valor conocido.Componente de la Incertidumbre: Cada una de las contribuciones a la incertidumbre.Criterios de aceptabilidad: Exigencias de una característica de funcionamiento o comportamiento enfunción de las cuales se puede determinar que un método analítico es adecuado para la finalidadperseguida y ofrece resultados confiables. GUÍA TÉCNICA N º 1 4
  6. 6. Ensayo: Operación técnica realizada de acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en ladeterminación cualitativa y/o cuantificación de una o más características (propiedades o analitos) en undeterminado producto, proceso o servicio.Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos únicos imposibles de controlardurante el proceso de medición. Se contrapone al concepto de error sistemático. Las fuentes de loserrores aleatorios son difíciles de identificar o sus efectos no pueden corregirse del todo. Sonnumerosos y pequeños. Este error ocurre o esta dado por el azar. Ejemplo: Errores de apreciación, talescomo el paralaje, que depende del observador y su capacidad en cuanto al límite separador del ojo.Error Sistemático: Es aquel que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan deuna magnitud. El error sistemático esta condicionado por algún factor distinto al azar. Ejemplo: el errorde las masas patrón del laboratorio se transfiere sistemáticamente al momento de calibrar la balanza.El VIM, lo define como componente del error de medición que al reiterar las mediciones se mantieneconstante o bien varia de manera predecible.Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un proceso de mediciónpermiten al usuario adoptar decisiones correctas, tanto desde el punto de vista técnico comoadministrativo, para alcanzar un fin establecido.Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de losvalores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando.Incertidumbre de la medición: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de la cantidad devalores que se atribuyen a una mensurando, basándose en la información utilizada. (Referencia: VIM,JCGM 200:2008) Nota: La incertidumbre de medición comprende, en general, muchos componentes. Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo de una evaluación de: la distribución estadística de la cantidad de valores de una serie de mediciones y se pueden caracterizar por las desviaciones.Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de concentración que ha sidodemostrado que puede ser determinado con la precisión y exactitud requeridas para una determinadamatriz.Limite máximo permitido (LMP): Nivel máximo o tolerancia establecida para un analito en una )reglamentación.Limite máximo Residual (LMR): Concentración máxima de residuos de una sustancia (plaguicida omedicamento) que se permite legalmente su uso en la superficie o parte interna de un productoalimenticio.Matriz: Es el tipo de sustancia compuesta (liquida, sólida, gaseosa) que puede o no contener al analitode interés, ejemplo: matriz de alimento, matriz ambiental, etc. GUÍA TÉCNICA N º 1 5
  7. 7. Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompañado de documentación,emitida por un órgano autorizado, en la que se indican uno a más valores de propiedades especificadasasí como la incertidumbre y rastreabilidad asociadas, con el uso de procedimientos válidos. (Referencia:VIM, JCGM 200:2008) Es decir, es un material de referencia, al que se le ha asignado un contenido de analito especificado en un certificado a través de un método trazable.Material de Referencia (MR): Material suficientemente homogéneas y estables con propiedadesespecificadas, que se ha establecido es idóneo para uso en la medición o en el análisis de laspropiedades nominales. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Nota: Material homogéneo que tiene definidas sus propiedades, a través de un método validado que puede usarse para fines analíticas (calibración de equipos, comprobación de un método, etc.).Mensurando: Cantidad destinada a la medida. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)Método de ensayo validado: Método de ensayo aceptado para el que se han llevado a cabo estudiosde validación (desempeño) con el fin de determinar su precisión y fiabilidad para un propósitoespecífico. (Referencia: ICCVAM Guidelines for the nomination and submission of new, revised andalternative test methods, 2003).Método oficial: Es el método especificado por los organismos reglamentarios de un país, con fines deaplicaciones de normas (ejemplo; reglamento sanitario de alimentos) o estipulados por organizacionescomerciales (Referencia: FAO).Método normalizado: Método apropiado para el ensayo dentro de su alcance, publicado pororganismos de normalización internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM, ASTM, BS, DIN, IRAM,etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes ámbitos ( AOAC, FIL-IDF, EPA, USP etc.)Método cualitativo: Método que permite determinar la presencia o ausencia de un analito en unamuestra o matriz.Método cuantitativo: Método que permite determinar la concentración de un analito presente en unamuestra o matriz.Metrología: Ciencia de la medición y su aplicación. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008), es decir, es laciencia de las mediciones o campo de los conocimientos relativos a las mediciones. Incluye cualquiertipo de medición del campo científico o tecnológico.Nivel: Es la concentración de una sustancia de interés en una solución estándar o matriz..generalmente, se habla en términos de nivel de concentración.Plan de Validación: Documento tipo protocolo en el cual se definen las pruebas o parámetros devalidación necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los requerimientos del método.Requerimiento del método: Corresponde a aquellas características del métodos que son esencialespara poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no están establecidas por el cliente o usuario, debedefinirlas el responsable del ensayo de manera confiable y científica. GUÍA TÉCNICA N º 1 6
  8. 8. Resolución: Parámetro cromatográfico que permite determinar la capacidad de separación entre 2picos, de manera que se puedan diferenciar adecuadamente de la cromatografía los analitos de interés.Resultado de un ensayo (X): El valor final notificado de una cantidad medida o calculada, tras aplicar unprocedimiento de medición, incluidos todos los procedimientos secundarios y las evaluaciones.(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16º Ed.)Sistema Internacional de Unidades (SI): Sistema de unidades, basado en el Internacional Sistema decantidades, sus nombres y símbolos, incluyendo una serie de prefijos y sus nombres y símbolos, asícomo las normas para su uso, aprobada por la Conferencia General de Pesas y Medidas (CGPM).(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)Sub-muestra: Porción de una muestra para análisis.Testigo reactivo o blanco: Es la solución que contiene todos los reactivos usados en los mismosvolúmenes y concentraciones, que son utilizados en el procesamiento de la muestra. Este blanco debeseguir todos los pasos indicados en la técnica y ayuda a detectar trazas de contaminación provenientesdel material o reactivos usados.Trazabilidad metrológica: Propiedad de un resultado de medición, mediante el cual el resultado puedeestar relacionado con una referencia a través de un cadena continua y documentada de calibraciones,cada que contribuyen a la incertidumbre de medición. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Propiedad del resultado de una medición o del valor con su incertidumbre, que puede a través de una cadena ininterrumpida de comparación relacionarse a una referencia establecida, generalmente patrones de referencia nacionales o internacionales. (Referencia: IUPAC- Nomenclature In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And Quantification Capabilities).Validación: Verificación de determinados parámetros de un método en la que los requisitosespecificados para estos, demuestran que el método es idóneo para un uso previsto. (Referencia: VIM,International Vocabulary for Basic and General Terms in Metrology: 2007)Valor verdadero: El grado de concordancia entre la media de un número infinito de valores reiteradosde cantidad y un valor de cantidad de referencia.Veracidad: El grado de concordancia entre la expectativa relativa al resultado de un ensayo o de unamedición y el valor verdadero. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.)Valor de Referencia: Valor cuantitativo que se utiliza como base para la comparación con valorescuantitativos del mismo tipo. (Referencia: VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms inMetrology: 2007)Verificación: Suministro de prueba(s) objetiva(s) de que un elemento dado satisface el (los) requisito(s)especificado(s) . (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Es decir, es la comprobación experimental de que un método establecido funciona de acuerdo con las especificaciones, en las condiciones disponibles en el laboratorio usuario. Se entiende como verificación a las pruebas realizadas por un laboratorio en la rutina de trabajo que permiten comprobar y documentar la aplicabilidad y uso adecuado del método por parte del laboratorio. GUÍA TÉCNICA N º 1 7
  9. 9. II: ESTADISTICA BASICAPara los fines de una validación, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadísticas, que nosayudan a establecer si el método se encuentra dentro de un parámetro aceptable, normalmente sedeterminan las siguientes:Media: Conocida también como media aritmética o promedio, es la cantidad total de la variable(muestra o medida) distribuida a partes iguales entre cada observación. En términos matemáticos, esigual a la suma de todos sus valores dividida entre el número de sumandos X = nΣ xi n Siendo: xi = valor de una lectura. n = número de lecturas σDesviación estándar (σ, S): Es el promedio de lejanía de los valores obtenidos (lecturas) respecto delpromedio. S=√ n Σ i=1 (xi-X)2 n-1 Siendo: xi = valor de una lectura. X= promedio de la totalidad de lecturas. n = número de lecturasCoeficiente de Variación (CV): Desviación estándar dividida por la media. También es conocida comodesviación estándar relativa (RSD). El coeficiente de variación puede ser expresado en porcentaje: %CV = S x100 X Siendo: S = desviación estándar de las lecturas. X = promedio de la totalidad de lecturas.Varianza: Es una medida de dispersión definida como el cuadrado de la desviación estándar. S2 = nΣ i=1 (xi-X)2 n-1 Siendo: xi = valor de una lectura. X= promedio de la totalidad de lecturas. n = número de lecturas GUÍA TÉCNICA N º 1 8
  10. 10. Coeficiente de Variación de Horwitz (CV h): Es el coeficiente de variación definido por W. Horwitz, através de la ecuación obtenida de un estudio estadístico. En dicho estudio, Horwitz después de reuniruna serie de datos (provenientes de 150 ensayos de interlaboratorios organizados por AOAC), observóque el coeficiente de variación de los valores medios dados por los diferentes laboratorios aumentabana medida que disminuía la concentración del analito. Comportándose como muestra la siguientegráfica, conocida como la trompeta de Horwitz.La ecuación de Horwitz, esta definida como: CVh = 2(1-0.5.log c) ó σH = 0.02 x c 0,8495Dónde:CV h= Coeficiente de variación de Horwitzσ H = Desviación estándar calculada conforme al modelo de precisión de Horwitz.C= concentración del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla Nº 1).Este coeficiente de variación (CVh) esta expresado en potencia de 2, y la concentración media delanalito expresado como potencia de 10, de esta forma independiente del analito y el método utilizadose puede estimar el CV esperado para la precisión.Tabla Nº 1: Concentración Razón Unidad (Potencia de 10) 100 1 100% (100 g/100 g) -1 > 10 10 > 10 % (10 g/100 g) -2 >1 10 > 1 % (1 g/100g) -3 > 0,1 10 > 0,1 % (1 mg/g ó 0,1 g/100 g) -4 0,01 10 100 mg/kg -5 0,001 10 10 mg/Kg -6 0,0001 10 1 mg/Kg -7 0,00001 10 100 µg/Kg -8 0,000001 10 10 µg/Kg 0,0000001 10-9 1 µg/Kg GUÍA TÉCNICA N º 1 9
  11. 11. Distribución Normal: Distribución continua conocida también como distribución Gaussiana, la distribución de una variable normal está completamente determinada por dos parámetros, su media y su desviación estándar, denotadas generalmente por y . La distribución normal se caracteriza por tener una única moda, que coincide con su media y su mediana. Su expresión grafica es una curva normal, cuya forma es similar a los histogramas con forma de campana, es conocida como campana de gauss que es simétrica respecto a su media y asintótica al eje de abscisas, esto hace que cualquier valor entre y es teóricamente posible. El área total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Para este tipo de variables existe una probabilidad de un 50% de observar un dato mayor que la media, y un 50% de observar un dato menor. σ - 3σ σ - 2σ σ -σ µ σ +σ σ +2σ σ +3σ • La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ+ σ es aproximadamente 0,687 ó 68,27%. • La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ + 2σ es aproximadamente 0,9545 ó 95,45%. • La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ + 3σ es aproximadamente 0,9973 ó 99,73%.Nivel de significancia (Alfa, α): Es el nivel de significación utilizado para calcular el nivel de confianza. Elnivel de confianza es igual a 100% (1 - α), es decir, un alfa (α) de 0,05 indica un nivel de confianza de95%.Factor de cobertura: Número mayor que uno por lo que una combinación de incertidumbre en lamedición estándar se multiplica a obtener una incertidumbre expandida de medida. Un factor decobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) GUÍA TÉCNICA N º 1 10
  12. 12. Pruebas de SignificanciaEs frecuente utilizar pruebas de significancia estadísticas durante el proceso de validación de los métodosanalíticos en este sentido, se aplican comúnmente las siguientes:1. Prueba t- student para identificar errores sistemáticos (sesgo).2. Prueba F-Fisher para identificar errores aleatorios (precisiones).Al hacer una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hipótesis experimental, llamada“hipótesis alternativa” (H1, si hay diferencia,) con respecto a la hipótesis nula (H0, no hay diferencia).Es la hipótesis alternativa la que determina el número de colas. Si la hipótesis alternativa contiene lafrase “mayor que” ó “menor que”, la prueba es de una-cola. Si la hipótesis alternativa contiene la frase”no es igual que”, la prueba es de dos-colas. (Fuente: National Food Administration of Sweden)1. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media no es igual al valor dado” (H1:μ ≠ x0) dos-colas2. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media es menor que el valor dado” (H1:μ < x0) una-cola3. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media es mayor que el valor dado” (H1:μ > x0) una-colaUna forma practica de decidir es respondiendo a dos preguntas:t-Test 1. Son las medias iguales? Dos-colas 2. Son las medias diferentes (puede una media ser mayor o menor a la otra)? Una-colaF-Test 1. Son las varianzas diferentes? Dos-colas 2. Es la varianza 1 mayor que la varianza 2? Una-cola GUÍA TÉCNICA N º 1 11
  13. 13. Prueba t-StudentEsta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parámetroslas diferencias son estadísticamente significativas.En la prueba t , se procede a determinar el valor t de student calculado, obtenido de la experienciaanalítica, y este valor posteriormente se compara con el llamado valor crítico, este valor critico se obtienede la tabla de t-student para un determinado porcentaje de confiabilidad (normalmente se utiliza el 95%de confianza, es decir, un valor α de 0,05). Si no existen diferencias significativas entre 2 grupos, el tcalculado debería ser inferior al t critico (o conocido también como t de tabla).El siguiente ejemplo, trata de explicar la afirmación realizada anteriormente: Un atleta desea realizar unsalto con garrocha, para lo cual, él realiza un calculo de con que velocidad y con que fuerza (t calculado)debe realizar la prueba de atletismo, a fin de saltar correctamente la altura establecida para lacompetencia (t critico). Si el t calculado es inferior al t crítico, entonces, no existirá una diferencias significativa que permita superar al t critico, y el atleta no podrá realizar el salto. GUÍA TÉCNICA N º 1 12
  14. 14. Si el valor t calculado es superior al t crítico, entonces, existirá una diferencia significativa que permitirá superar al t crítico, y el atleta podrá realizar el salto.Para explicar de mejor manera la prueba de t-Student, hemos incluido los siguientes ejemplos:EJEMPLO 1: Prueba t-Student para 2 variables independientesSe realiza el análisis de una muestra de flúor en agua bajo el método de cromatografía iónica enLaboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L de F- , fueron: Nivel Grupo/Experiencia Observaciones 1 2 1 4,5 5,3 2 5,2 6,8 3 5,0 6,9 4 6,4 7,1 5 6,0 7,7 6 7,1 ---Experiencia 1: n1=6 Media X1=5,70 Desviación estándar S1= 0,9716 grados de libertad gl1= 5Experiencia 2: n2=5 Media X2= 6,76 Desviación estándar S2 = 0,8877 grados de libertad gl2= 4Se determina el valor t calculado (t calc):t calc =  X1 - X2  . S1 2 (n1-1) + S2 2 (n2-1) . 1 + 1 n1+ n2-2 n1 n2 GUÍA TÉCNICA N º 1 13
  15. 15. t calc =  5,70 - 6,76  . (0,9716) 2 (6-1) + (0,8877) 2 (5-1) . 1 + 1 6 + 5 - 2 6 5t calc =  -1,06  . (0,93524) . (0,1667 + 0,2)t calc = 1,06 = 3,09. 0,34292 Se desea determinar si son iguales las medias de la experiencia 1 y 2. Para esto se procede luego adeterminar el t critico en la tabla t-student para α=0,05. En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,262. 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 5 1.476 2.015 2.571 6 1.440 1.943 2.447 7 1.415 1.895 2.365 8 1.397 1.860 2.306 9 1.383 1.833 2.262 10 1.372 1.812 2.228 Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 3,09. Se observa. t calc >t crit .Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se acepta. GUÍA TÉCNICA N º 1 14
  16. 16. EJEMPLO 2: Prueba t-student para 2 variables correlacionadas o pareadasSe realiza el análisis de una muestra de turbiedad en agua, el método utilizado es el turbidimétrico, laexperiencia se realiza en 2 días diferentes: Nivel Grupo/Experiencia x∆ Observaciones A B 1 4 3 1 2 5 2 3 3 6 1 5 4 6 2 4 5 4 3 1 Experiencia : observaciones pareadas n=5 Media X ∆= 2,8 Desviación estándar S = 1,789 grados de libertad gl= 4Se determina el valor t calculado (t calc):X ∆ = Σ ( xA –xB) t calc = X∆ . n (S/√n)Se calcula: X ∆= 1 +3 +5+ 4+1 = 2,8 y luego se determina el t calculado; 5t calc = 2,8  .= = 3,48 1,789/ √5Se desea demostrar si existen diferencias significativas entre la experiencia A y B. Entonces, se procedeluego a determinar el t critico en la tabla t-student para α=0,05 para 2 colas.En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,776. 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 5 1.476 2.015 2.571 Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 3,48. Se observa que t calc > t crit. Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable. GUÍA TÉCNICA N º 1 15
  17. 17. EJEMPLO 3: Prueba t-student para comparación de muestreal versus un valor de referenciaSe analiza de un material de referencia certificado de hierro en cereal, se realizan 4 replicas, el métodoutilizado es absorción atómica llama, los resultados obtenidos en mg/Kg son: Observaciones Valor obtenido 1 5,8 2 6,1 3 6,4 4 6,2 El valor asignado, informado en el certificado del MRC es; µ = 6,3 mg/Kg Experiencia : Observaciones pareadas n=4 Media X = 6,05 Desviación estándar S = 0,387 grados de libertad (ν o gl)= 3 Se determina el valor t calculado (t calc): t calc = X-µ . (S/√n) t calc = 6,05 – 6,3  .= = 1,292 0,387/ √4 Se procede luego a determinar el t critico en la tabla t-student para α=0,05. En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 3,182. 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 1,292. Se observa que: t calc < t crit . Concluimos que no existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se acepta. GUÍA TÉCNICA N º 1 16
  18. 18. Prueba F (de Fisher) Prueba en la que el estadístico utilizado sigue una distribución F si la hipótesis nula no puede serrechazada. En estadística aplicada se prueban muchas hipótesis mediante el test F, entre ellas: Lahipótesis nula=Ho de que las medias de múltiples poblaciones normalmente distribuidas y con la mismadesviación estándar son iguales. Esta es, quizás, la más conocida de las hipótesis verificada mediante eltest F y el problema más simple del análisis de varianza. Y la hipótesis de que las desviaciones estándar dedos poblaciones normalmente distribuidas son iguales.Para explicar de mejor manera la prueba de Fischer, hemos incluido el siguiente ejemplo:Se realiza la medición de sulfatos en una muestra de agua en dos días diferentes. Nivel Grupo/Experiencia Observaciones 1 2 1 C1,1 C2,1 2 C1,2 C2,2 3 C1,3 C2,3 4 C1,4 C2,4 5 C1,5 C2,5 6 C1,6 C2,6 7 C1,7 C2,7 8 C1,8 C2,8 9 C1,9 C2,9 10 C1,10 C2,10 11 -- C2,11 12 -- C2,12 13 -- C2,13 14 -- C2,14Experiencia 1: n1=10 Media 1=14,9 Varianza 1= 26,4Experiencia 2: n2=14 Media 2= 16,2 Varianza 2 = 12,7Si se intenta un test de t-student con estos valores hay que verificar si las 2 varianzas no sonsignificativamente diferentes; por que si son diferentes, el test de t-student no podrá ser utilizado. ¿Quese hace?1) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-1 = 10-1=92) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-2 = 14-1=13 GUÍA TÉCNICA N º 1 17
  19. 19. 3) Dividir la varianza más grande por la más pequeña: F= Varianza mayor = Varianza 1 = 26,4 = 2.079 Varianza menor Varianza 2 12,74) Para saber si 2,079 indica que la varianza obtenida en la experiencia 2 es menor que la obtenida en laexperiencia 1, uno va a la Tabla F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados de libertad (gl) del numerador (9)en la fila horizontal, y del denominador (13) en la columna, para un valor de α = 0,05, 1 cola: gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232 4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880 5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246 6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901 7 5,59 4,74 4,35 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667 8 5,32 4,46 4,07 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812 9 5,12 4,26 4,07 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890 10 4,96 4,10 3,86 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038 11 4,84 3,98 3,71 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622 12 4,75 3,89 3,59 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638 13 4,67 3,81 3,49 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436 En la intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 2,71. Se procede a comparar el F crítico y el F calculado, F calc= 2,079, Se observa. F crit > F calc. Concluimos que las dos varianzas no son significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t es una decisión legítima. GUÍA TÉCNICA N º 1 18
  20. 20. Análisis de VarianzaEl análisis de varianza, también conocido como ANOVA, es el análisis estadístico en el cual se comparamás de dos medias entre sí.Para ese fin, se debe proceder a comparar las diferencias entre cada grupo y las observacionesrealizadas.Ejemplo: Experiencia n’ n= Observaciones Método A Método B Método C 1 8,5 9,9 7,4 2 9,2 10,0 8,0 3 7,8 11,1 8,6N= número de observaciones totales = 3 x 3 = 9Se procede a calcular la sumatoria de las observaciones de experiencia (o grupo): Calculo Método A Método B Método C Σ Σ xi 25,5 31,0 24,0 Σ Σ xi = 25,5 + 31,0+24,0= 80,5 Σ xi2 217,73 321,22 192,72 Σ Σ xi2 = 217,73 + 321,22 +192,72= 731,67Suma total de los cuadrados es:SCT = Σ Σ xi2 – (Σ Σ x)2 = 731,67 – (80,5)2 = 11,642 N 9Grados de libertad totales = gl total= N-1 =9-1 =8Suma cuadrados entre grupos:SCB = (Σ xA)2 + (Σ xB)2 + (Σ xC)2 - (Σ Σ x)2 = (25,5)2 + (31,0)2 + (24,0)2 – (80,5)2 = 9,0553 nA nB nC N 3 3 3 9Grados de libertad entre grupos (ej.: métodos) = gl B = n’-1 = 3-1 = 2 GUÍA TÉCNICA N º 1 19
  21. 21. Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los métodos:Se realiza por simple resta, es decir:SC w = SCT - SDCB = 11,642 – 9,05553 = 2,58647Grados de libertad dentro del grupo = gl total - gl B = 8- 2 = 6Resumiendo obtuvimos: Origen de la Varianza Grados de libertad (gl) Sumas cuadráticas (SC) Cuadrados medios (CM) Entre grupos (B) 2 9,0553 4,5278 Dentro del grupo (W) 6 2,58647 0,4311 Total (T) 8 11,642 -----Aplicando la prueba F, se obtiene:F calc = ( SCB/glB) = ( 9,05553/2) = 4,5278 = 10,5 (SCw/ glw) ( 2,58647/6) 0,4311Se determina el valor F crítico de Tabla F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados de libertad (gl) delnumerador (2) en la fila horizontal, y del denominador (6) en la columna, para un valor de α = 0,05, 1cola: gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232 4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880 5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246 6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901 En la intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 5,14. Se procede a comparar el F critico y el F calculado. F calc = 10,50 Se observa que F calc > F crit . Se concluye que hay diferencias significativas entre los 3 métodos. GUÍA TÉCNICA N º 1 20
  22. 22. IV: VALIDACIONLa validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultadosentregado por dicho método son confiable. Cuando se realiza la validación de un método por parte dellaboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadístico que el método esadecuado para los fines previstos.En este sentido, es importante que para el proceso de validación se asigne a un responsable de realizardicha tarea. De manera que, la validación se efectúe en forma metódica, ordenada, trazable yconfiable.Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validación de cuales son losrequerimientos del método para establecer el alcance de la validación.Es esencial, entonces conocer el método a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, suconcentración (nivel, LMP, LMR, etc.) y la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar.En general, se establece que el laboratorio DEBE validar: 1. Métodos no normalizados: Corresponden a métodos desarrollados por el laboratorio o método nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a métodos que tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio pero que no están normalizados. 2. Método normalizado con una modificación significativa.Cuando se trata de un método empleado tradicionalmente por el laboratorio que no este normalizado,se puede realizar una Validación Retrospectiva, es decir, en base a los datos experimentales que ellaboratorio dispone, para la cual se realizará la recopilación de la mayor cantidad de datos históricosdisponibles, para luego realizar un proceso de ordenamiento y selección de los datos recopilados, estosdatos pueden ser: curvas de calibración, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud,etc. A través de estos, se deberán determinar los parámetros de validación, y evaluar si los resultadosobtenidos para los fines de la son aceptable.En caso de ser un método nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes) se deberealizar una Validación Prospectiva, generando a través de análisis datos experimentales.En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validación menor o verificación cuando setrate de: 1. Métodos normalizados. 2. Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz. 3. Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados. Ejemplo: uso en otros analitos. 4. Cuando se trate de métodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteración significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio de equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio analista, cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentración del analito de interés, entre otros. GUÍA TÉCNICA N º 1 21
  23. 23. La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el métodode ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un método normalizadomodificado para la verificación se requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variaciónrealizada no afecta el ensayo.En ocasiones, lo que se busca a través de una validación es demostrar que un método es equivalente aotro.El objetivo de la validación y la verificación, es demostrar que el método utilizado por un laboratorio esadecuado para la aplicación en la que se propone utilizar, así, como también demostrar que lasmodificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su desempeño, ni la confiabilidad de losresultados por este entregado. GUÍA TÉCNICA N º 1 22
  24. 24. Definición del método a Validar: Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentración-Principio Tipo de Método Sí No Se trata de un método normalizado?Normalizado Normalizado No Normalizado: No Normalizado Modificado Nuevo o Tradicional : Desarrollado por el usado por el laboratorio Laboratorio hace No Tiene una modificación recientemente años significativa? Sí Validación Verificación Validación Prospectiva Retrospectiva Establecer Parámetros a Evaluar Establecer Pruebas Experimentales Establecer Criterios de Aceptabilidad Comparar resultados Desarrollar Pruebas Experimentales versus criterios Evaluar resultados INFORME DE VALIDACIÓN REVISIÓN DE INFORME GUÍA TÉCNICA N º 1 23
  25. 25. En relación a los parámetros de validación o verificación estos deberán determinarse de acuerdo al tipo de método. Para este fin la siguiente tabla puede ser utilizada como guía: Tabla Nº 2 PARAMETRO METODO CUANTITATIVO METODO A EVALUAR CARACTERISTICA(S) CUALITATIVO NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO Identificación analito SELECTIVIDAD Interferencia de Sí No Sí Sí matriz Rango lineal LINEALIDAD No Sí Sí Sí Pendiente SENSIBILIDAD No Sí o No Sí Sí Critico (LC) Sí o No LIMITES Detección (LOD) Sí Sí Sí Cuantificación (LOQ) Repetibilidad PRECISION No Sí Sí Sí Reproducibilidad Sesgo (s) Sí o No VERACIDAD No Sí o No Sí Recuperación (R) Test de Youden y Sí o No ROBUSTEZ No No Sí Steiner Sí Sí Sí Sí APLICABILIDAD ------------- De acuerdo a los antecedentes anteriormente mencionados, el responsable de la validación o verificación deberá así elaborar el Plan de Validación que se va a realizar.a) ESTABLECER PLAN DE VALIDACIÓN Se entiende como Plan de Validación, a un documento (tipo protocolo) en el cual se definen previamente a la experiencia; las pruebas o parámetros de validación necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los requerimientos del método. El “Plan de Validación” deberá contener a lo menos: • Alcance de la validación (método, analito, matrices y requerimientos del método • Diseño experimental: Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz, material certificados, material control, material(es) de referencia certificado, matrices de las muestras, muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc. El (los) parámetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una convencional, sino diseñada por el responsable, también deberá indicarse en el documento. Número de análisis requeridos para cada prueba y/o parámetro. Criterios de aceptabilidad para cada parámetro de validación. Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analítica(s). GUÍA TÉCNICA N º 1 24
  26. 26. • Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validación. • Responsable de la Validación, fecha o tiempo programado para realizar la validación y fecha de elaboración del plan. Cualquier modificación realizada al plan de validación, durante el proceso, debe quedar debidamente documentada. En anexo Nº 1, Se muestra un formato de plan de validación. En el anexo Nº 6, se incluye un ejemplo de esquema de trabajo de cómo se desarrolla un plan de validación para un método normalizado.b) DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Para el desarrollo de las pruebas de validación, los analistas a cargo deberán conocer el procedimiento de método de ensayo y el número de ensayos o mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el plan de validación. (IMPORTANTE: El personal responsable de realizar los análisis se encuentre debidamente calificado, y los equipos asociados al método deberían encontrarse calibrados o controlados antes de su uso.) Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y almacenados. Los ensayos o mediciones realizadas serán con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de parámetros de validación: Selectividad Linealidad Sensibilidad Limites Exactitud Precisión Robustez Aplicabilidad El analista o responsable de la validación deberá con los resultados obtenidos de cada prueba realizar los cálculos matemáticos, comparativos y/o estadísticos correspondientes a cada ensayo para lo cual podrá utilizar para ese fin un software estadístico, calculadora o una planilla de cálculo (ejemplo: Excel). C) EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN Se deberá evaluar para cada parámetro de validación, si los resultados de las pruebas son satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan, se considera que el método es aceptable. GUÍA TÉCNICA N º 1 25
  27. 27. D) INFORME DE VALIDACIÓNEl responsable de la validación, deberá realizar un informe en el cual presentará los resultadosobtenidos y conclusiones. El informe debe contener la declaración de la aplicabilidad del método.En el anexo Nº 2, se entrega un modelo tipo de informe de validación.El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validación, y una declaraciónacerca de que el método se ajusta para el uso propuesto.Este informe deberá ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el área, y que nohaya formado parte del proceso de validación. En dicha revisión se deberá establecer si los criterios deaceptabilidad establecidos en el plan son aceptables, y si el método es idóneo para el fin previsto. GUÍA TÉCNICA N º 1 26
  28. 28. SELECTIVIDADLa selectividad es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia deinterferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de interés.La prueba de selectividad puede diseñarse de acuerdo al método, en el caso de cromatografía laresolución entrega información sobre la selectividad del método, en el caso de espectrofotometría elespectro de absorción o un espectro de masas entrega información al respecto, en especial cuando escomparado en presencia de una interferencia.Una prueba de Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo de tres testigoreactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de concentración conocida del analito deinterés.Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso, y observar si existenvariaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o muestras con analito. Si seencuentran diferencias significativas deberán ser identificadas y en lo posible eliminadas. GUÍA TÉCNICA N º 1 27
  29. 29. LINEALIDADLa linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar unarespuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habráde determinar en la muestra de laboratorio.Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de concentración versusrespuesta, que se conoce como Función Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). Ésta seestablece cada día con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones detrabajos limpios de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este sentido serecomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor de interés. Elnúmero de puntos a analizar deberá ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mínimo de4 valores).Luego de realizar el grafico se puede observar el comportamiento de la curva y establecercualitativamente el rango lineal (fig.1). Después de establecer el comportamiento lineal del método sedeberá realizar la Curva de trabajo o curva de calibración (fig.2). Graficar los datos de concentración delos estándares de calibración estimados (X) v/s la lectura observada (Y). Fig. 1 Fig.2Evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico: la pendiente (m), el coeficiente de correlación (ró ϒ) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L0). Y= X x m + Lo GUÍA TÉCNICA N º 1 28
  30. 30. En general el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficientede correlación:El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable concentración (X) y la variablerespuesta (Y) de la curva de calibración. Los valores máximos que puede alcanzar son –1 y 1. El valormáximo de 1 indica una correlación positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuandor=0, no existe correlación alguna, independencia total de los valores X e YEn la práctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlación con unaprobabilidad elevada. Para una curva de calibración o trabajo, es recomendable que el coeficiente decorrelación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igualo mayor que 0.99. r = _Sxy Sx· Sy Sxy= i=1 Σ n x i · yi - ( x p r o m · yprom ) n Sx= √ ((Σ xi2/n) - (xprom2)) Sy= √ ((Σ yi2/n) - (yprom2))Coeficiente de correlación (γ o r): r > 0.99Coeficiente de correlación al cuadrado r2 > 0.99.Se puede realizar una evaluación de curva de calibración global (construida con más de una curva decalibración de las mismas características) en la cual se puede realizar una evaluación estadística deprueba t-Student, como un mejor indicador del modelo lineal.Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con el valor tabulado de t para el nivelde confianza requerido (α = 0.05), dos-colas, en este caso para un “n” que depende de los niveles decalibración.Se desea probar si existe entonces una correlación significativa: La hipótesis nula H0 es que no existecorrelación entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor que tcri, se rechaza la hipótesis nula H0,siendo la correlación lineal significativa con la probabilidad calculada. tr = | r | √(n-2) √ (1- r2)Donde:tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlación| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlaciónn – 2 = Número de grados de libertadr2 = Valor del coeficiente de determinación GUÍA TÉCNICA N º 1 29
  31. 31. Ejemplo: Desviación Nivel Conc Área Área Área A Estándar CV % Varianza mg/L 1 2 3 Promedio S 1 13,4 43,8 44,2 44,1 44,0 0,2 0,4 0,0 2 26,6 86,2 86,1 87,6 86,7 0,8 1,0 0,7 3 40,8 131,2 132,7 133,6 132,5 1,2 0,9 1,4 4 54,7 181,7 180,7 178,6 180,3 1,6 0,9 2,5 5 68,6 221,6 224,2 221,8 222,5 1,4 0,6 2,0n= Nº de niveles= 5r= coeficiente de correlación= 0,99985r= coeficiente de determinación= 0,9997sustituyendo los valores: t r = | r | √(n-2) = I 0,99985 I*√(5-2)= I 0,99985 I*√3 = 99.985 √ (1- r2) √ (1-0,9997) √0,0003 GUÍA TÉCNICA N º 1 30
  32. 32. El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un α = 0.05 y 2 colas es: 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 t crit = 3,182 Se observa que el valor observado de tr (es decir el t calculado) es mayor que tcrit (99,85 > 3,182), por lo cual se rechaza la hipótesis nula Ho, siendo la correlación lineal significativa con la probabilidad calculada.En cuanto al rango de aplicabilidad, el Codex Alimentarius ha establecido que respecto al LMP elIntervalo mínimo aplicable es:Respecto de un LMP ≥ 0,1 ppm, [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].Respecto de un LMP < 0,1 ppm, [LMP - 2 SR , LMP + 2 SR ].Siendo SR la desviación estándar de la reproducibilidad.Ejemplo:El LMP para mercurio en sal es de 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicaría la ecuación de Horwitz paradeterminar la SR prevista a este nivel que es igual a 10-7 CVR (%) = 100 · SR = 2 C−0,1505 cAl despejar la ecuación obtendríamos lo siguiente: SR = c· 2 C−0,1505 100c= Es el LMP en mg/Kg es decir; 0,1C= Es cociente de concentración es decir la concentración expresada en potencia de 10. GUÍA TÉCNICA N º 1 31
  33. 33. Sustituyendo obtendríamos: SR = 0,1· 2 (0,0000001)−0,1505 = 0,0233 100Entonces:Para un LMP ≥ 0,1 ppm se aplica el criterio: [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].Es decir: LMP + 3 SR = 0,1 + (3·0,0233) = 0,1 + (0,07) 0,1 + 0,07 = 0,17 mg/Kg 0,1 – 0,07 = 0,03 mg/kgEntonces el rango que se requería del método para que fuera aceptable debería estar a lo menos entre0,03 y 0,17 mg/Kg.Para coeficientes de concentración < 10-7, se aplica la teoría de Thompson, esto es, CVR% = 22 %por lo tanto, SR = 0,22 · LMPEjemplo:El Codex Alimentarius señala que para un LMP = 0,01 mg/kg , es decir, para una concentración de 10-8,es decir < 10-7:El rango de aceptabilidad seria:LMP + 2 SR= 0,01 ± 2· SR = 0,01 ± 2 · (0,22 · LMP) = 0,01 ± 0,44 · 0,01 = 0,01 ± 0,0044 mg/kgEl rango mínimo aplicable para un LM de 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg. GUÍA TÉCNICA N º 1 32
  34. 34. SENSIBILIDADLa sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición y el cambiocorrespondiente en el valor de la cantidad objeto de la medición.En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de la recta de calibración.Se calcula como: m = ΣXi Yi - (Σ Xi ΣYi/ n) ΣX2 i - ((ΣXi)2 /n)El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminación de los valores deconcentración en base a la lectura.En figura Nº 3, se puede observar que mientras más próxima al eje de las Y esté la recta, significa que aligeros cambios en las concentraciones esperadas habrá grandes variaciones en los resultados de laslecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentración no son significativospara la lectura. Fig. 3Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de concentración determina unagran variación de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumentalfrente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo, visualiza como se comporta elinstrumento. GUÍA TÉCNICA N º 1 33
  35. 35. LIMITESSe debe tener en consideración los siguientes parámetros: Valor critico, limite detección (LOD) y limitede cuantificación (LOQ).Valor critico (LC): El valor de la concentración o cantidad neta que en caso de superarse da lugar, parauna probabilidad de error dada α, a la decisión de que la concentración o cantidad del analito presenteen el material analizado es superior a la contenida en el material testigo (Referencia: CodexAlimentarius).Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o testigo reactivo. LC = t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LC = 1,645 x SoDonde:t = t-Student1-α= probabilidad bv= Grados de libertadSo = Desviación estándar de las lecturas del blanco matriz o testigo reactivo.Un resultado inferior al LC que determine la decisión “no detectado” no deberá interpretarse comodemostración de que el analito está ausente. No se recomienda notificar tal resultado como “cero” ocomo < LOD. Deberá hacerse constar en todo los casos el valor estimado y su incertidumbre.Límite de detección (LOD): Concentración o cantidad real del analito presente en el material objeto deanálisis que llevará, con una probabilidad (1-β), a la conclusión de que la concentración o cantidad delanalito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia del Manual del CodexAlimentarius ).Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo oconcentración estimada cercana al blanco.LOD = 2 t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LOD = 3,29 x SoLOD = 3,29So, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material testigo es insignificante,α=β = 0,05 y el valor estimado tiene una distribución normal con una varianza constante conocida.Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD < LMP. En general también se sugiere, para un LMP >0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.Límite de cuantificación (LOQ): Una característica del funcionamiento del método que suele expresarsecomo señal del valor (verdadero) de la medición que producirá estimaciones con una desviaciónestándar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se calcula mediante la siguiente fórmula: LOQ = 10 So GUÍA TÉCNICA N º 1 34
  36. 36. Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo oconcentración estimada cercana al blanco.En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el límite de detección, dada la normalidad y α= β =0,05. En el LOQ es posible lograr una identificación positiva con un nivel de confianza razonable.Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general también se sugiere, para unLMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP.Ejemplo ejercicio de límites:Para el analito mercurio en marisco fresco el limite máximo permisible es 0,5 mg/Kg. Se realiza laexperiencia de medir 10 veces el blanco matriz: Resultado Medición mg/Kg 1 0,05 2 0,05 3 0,03 4 0,04 5 0,05 6 0,03 7 0,01 8 0,05 9 0,05 10 0,04La desviación estándar obtenida para los blancos: So = 0,013Por lo cual el LC seria: LC = 1,645 x 0,013 = 0,022 mg/KgPor lo cual el LOD seria: LOD = 3,29 x 0,013 = 0,044 mg/KgSe puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 < 0,044.El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual el LOD debe ser <1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una décima parte de 0,5. (0,5 mg/L/10) = 0,05 mg/Kg0,044 mg/L es inferior a 0,05 mgKgL , por lo cual se estaría aceptando el LOD calculado de acuerdo alcriterio de aceptación establecido.Si el LOQ seria: LOD = 10 x 0,013 = 0,13 mg/Kg GUÍA TÉCNICA N º 1 35
  37. 37. Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5de 0,1 mg/Kg.Por lo cual no se estaría cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no seríaaceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar al método.En este sentido se pude tomar la decisión de buscar otro método que cumpla con estos requisitos paraeste fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en la declaración de la aplicabilidad estasreservas u observaciones en cuanto a su LOQ.Es importante realizar posteriormente la experiencia analítica de la determinación del analito en elnivel de concentración determinado para el LOD o LOQ, es decir evidenciar resultados experimentales,que demuestren la validez del resultado obtenido. GUÍA TÉCNICA N º 1 36
  38. 38. EXACTITUDEl manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultadode un ensayo y el valor de referencia.El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone unacombinación de componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo.Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación deveracidad y precisión. En el siguiente esquema de “Tiro al Blanco”, ampliamente utilizado paraejemplificar esto, los punto u orificios equivaldrían a los resultados analíticos y el circulo rojo al centroel rango en el cual se espera este el valor de referencia (o verdadero).Como se puede observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es más exacto. GUÍA TÉCNICA N º 1 37
  39. 39. VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una seriede resultados y un valor de referencia aceptado.La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación.a) Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o unamedición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valorverdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error aleatorio.Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control,material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe medir un analito de concentración conocido y sedetermina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Unadiferencia sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se refleja en un mayorvalor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el método. s= X -XaDonde:s= sesgoX = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.Xa = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el tobs < t crit: t calc = [ Xa –X] S x √nDonde :t calc= t observado o calculadoXa = Valor esperado o valor certificado en concentraciónX= Promedio de valores leídos u observados en concentraciónS= Desviación estándarn= Número de lecturas o valores observados.Buscar t- Student teórico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridaddeseado ( 1-α) para un error α. Usualmente se trabaja con un valor de 0,05. GUÍA TÉCNICA N º 1 38
  40. 40. Ejemplo ejercicio de sesgo:Para un valor asignado de un material de referencia certificado de 20,1 mg/L de N-NO2, losvalores obtenidos son: Lectura Resultado Sesgo (X-Xa) mg/L s 1 20,4 20,4-20,1 0,3 2 20,8 20,8-20,1 0,7 3 20,6 20,6-20,1 0,5 4 20,0 20,0-20,1 -0,1 5 20,4 20,4-20,1 0,3 6 20,6 20,6-20,1 0,5 7 20,5 20,5-20,1 0,4 8 19,9 19,9-20,1 -0,2 9 20,3 20,3-20,1 0,2 10 20,3 20,3-20,1 0,2Desviación estándar S = 0,27 Promedio de las lecturas X= 20,38Valor asignado a la muestra Xa= 20,1 Número de lecturas n= 10 √n = √10 = 3,162 t calc = [ Xa –X] = [20,1-20,38] = 0,32 0,27 x √10Se desea establecer si existe una diferencia significativa entre el valor obtenido de la experienciaanalítica y el valor de referencia. Entonces, para determinar el t teórico o critico para grados de libertadde n-1 ( es decir de 10-1=9) , un valor α =0,05 y 2 colas, se extrae de tabla el t critico que es de 2,262,cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,32 < 2,262. Es decir; no hay diferencias significativas. 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 5 1.476 2.015 2.571 6 1.440 1.943 2.447 7 1.415 1.895 2.365 8 1.397 1.860 2.306 9 1.383 1.833 2.262 10 1.372 1.812 2.228“A través del ejercicio se puede observar que para la medición de Nitritos en agua el sesgo obtenidopara el método utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable”. GUÍA TÉCNICA N º 1 39
  41. 41. b) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes delanálisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.La recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extraccióny la cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperación estaintrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra.Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres niveles. Se debeconsiderar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibración del método, el LOD y el LMPestablecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información posiblerespecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos valores criticos.Se calcula de la siguiente manera: R= Ce –Co CaSiendo:R= RecuperaciónCe = es la concentración de analito de la muestra enriquecida.C0 = es la concentración de analito medida en la muestra sin adicionar.Ca = es la concentración de analito adicionado a la muestra enriquecida.Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperación (%R): se calcula de la siguiente manera: %R = [ R ] x 100En caso de evaluar la recuperación, se deberá realizar prueba t , en la cual el tcalc<t crit: t calc = [ 100 – %R] S x √nDonde :t calc= t observado o calculadoR= RecuperaciónS= Desviación estándar de las lecturas del porcentaje de recuperaciónn= Nº de lecturas o valores observadosBuscar t-Student teórico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridaddeseado ( 1-α) para un error α de 0,05, es decir con un 95% de confianza.Si el tcalc> tcrit (hay diferencia estadísticamente significativa), los resultados reportados deberán sercorregidos. GUÍA TÉCNICA N º 1 40
  42. 42. Si el tcalc ≤ tcrit (no hay diferencia estadísticamente significativa), no es necesario ninguna corrección.El Criterio de aceptación en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperación puede utilizarselos criterios de AOAC. En caso de utilizar criterio de AOAC ( Ver Anexo III), se debe buscar en tabla deacuerdo a la concentración esperada del analito y si el % R obtenido de la experiencia analítica, seencuentra dentro del rango de %R teóricos esperados.En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango de aceptabilidad señalado en el certificado comocriterio de aceptabilidad. Es decir, el valor determinado analíticamente deberá encontrase dentro delrango de tolerancia establecido a través de certificado, es decir, del limite superior (LS) o limite inferior(LI).Cabe señalar que el Codex Alimentarius señala que existen directrices relativas a los intervalos previstosde recuperación en áreas específicas de análisis, como por ejemplo: Residuos de plaguicidas (RP) oresiduos de medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya demostrado que larecuperación es una función de la matriz, podrán aplicarse otros requisitos especificados.Ejemplo de Ejercicio de Recuperación:Se utilizo fortificó una muestra de carne de marisco a una concentración 15 mg/100g de Cadmio y seanalizo por fotometría de absorción atómica. Lectura Co Ca Ce R %R 1 0,1 15,0 15,0 0,993 99,3 2 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3 3 0,1 15,0 13,0 0,860 86,0 4 0,1 15,0 16,0 1,060 106,0 5 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3 6 0,2 15,0 13,0 0,853 85,3El promedio obtenido del porcentaje de recuperación es de : %R = 93,9i) De acuerdo a tabla de AOAC al nivel de 10 ppm el valor aceptable es de 80 a 110 %R por lo cual elvalor obtenido en la experiencia seria aceptable para el nivel medido en la matriz analizada.ii) En caso de utilizar como criterio de aceptabilidad la prueba t, entonces, la determinación del valorde t calculado, sería:Desviación estándar del % R, S%R = 7,90Mediciones, n=6 t calc = [ 100 – 93,9] =0,315 7,90 x√6 GUÍA TÉCNICA N º 1 41
  43. 43. Se desea determinar si existe diferencia significativa entre el valor de % recuperación determinado y el10% de Recuperación. Para determinar el t critico para grados de libertad de ν= n-1 ( es decir de 6-1=5), 2 colas y un valor α =0,05 , se extrae de tabla t-student: 2 colas 80% 90% 95% α/2 0.10 0.05 0.025 v 1 3.078 6.314 12.706 2 1.886 2.920 4.303 3 1.638 2.353 3.182 4 1.533 2.132 2.776 5 1.476 2.015 2.571 6 1.440 1.943 2.447El t teórico o critico es de 2,015, cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,315 < 2,571. Es decir no existendiferencias significativas. PRECISION: La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se calcula como desviación estándar de los resultados (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.).a) Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVr%).b) Reproducibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros. Para determinar la precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) ( es decir, la precisión dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un Material de Referencia (MRC o material control) una vez por cada semana o el comportamiento de la curva de calibración en 3 días distintos. También, se puede determinar registrando a lo menos 10 mediciones en días distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviación estándar (SRi)y el porcentaje de coeficiente de variación (CVRi%). GUÍA TÉCNICA N º 1 42
  44. 44. Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validación de un método, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en consideración que estos utilicen el mismo método y misma muestra, en un intervalo de tiempo preferentemente establecido, se determina de este modo la desviación estándar de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios (SR). El criterio de aceptabilidad para la precisión se puede hacer en base a coeficiente de variación de Horwitz : CVh% = 2 (1-0.5)log C ó también se expresa como; CVh%= 0,02 x c 0.8495 Donde: C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L =10-6 En este sentido se establece para la repetibilidad, el CVr% obtenido debe ser < (CVh%/2). En el caso de la reproducibilidad interlaboratorio el CVR% <CVh%, para la reproducibilidad interna (intralaboratorio) CVRi% < (2CVh%/3). -7 El Codex menciona que para coeficientes de concentración < 10 , se aplica la teoría de Horwitz- Thompson, esto es, CV = 22%. T En cuanto a la repetibilidad podríamos señalar el siguiente ejemplo: Se realizó la medición simultánea (mismo día) de 10 sub-muestras para el analito (organofosforados) de un material de referencia de tomate de 1,2 mg/Kg, obteniéndose los siguientes resultados: C obtenida Lectura mg/kg 1 1,08 2 1,07 3 0,84 4 0,83 5 0,94 6 0,87 7 1,02 8 1,06 9 0,95 10 0,88 Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg La desviación estándar obtenida es de Sr = 0,099 mg/Kg El coeficiente de variación porcentual obtenido es CV% =10,41%GUÍA TÉCNICA N º 1 43
  45. 45. Si el valor asignado es de 1 mg/Kg , para el calculo de Coeficiente de variación porcentual de horwitz ,el valor nominal del analito es equivalente a 0,00000120, es decir a 1,2 x 10-6. y el CV%hr pararepetibilidad es la mitad del valor calculado del CV%h . CVh% = 2 (1-0.5)log 0,0000012 = 7,78% 2De acuerdo a Horwitz el CV% para repetibilidad es de 7,78%. Por lo cual se cumple el criterio deaceptabilidad establecido.En caso que se desee se puede realizar el estudio de reproducibilidad y repetibilidad, a través de unanálisis de varianza (ver anexo Nº III). El estudio ANOVA (de factores totalmente anidados yhomogéneos) consiste en el análisis simple de varianza de las desviaciones estándar para cada uno delos niveles de ensayo, para su determinación se podrá utilizar si se dispone de un software estadístico ouna planilla Excel.Ejemplo de estudio de reproducibilidad:Se realizó el análisis de varianza a 10 muestras de sulfatos en aguas 1 mg/L en un total de 10experiencias. Lectura Fecha C obtenida mg/L 1 día 1 1,08 2 día 1 1,07 3 día 2 1,00 4 día 3 1,10 5 día 4 0,99 6 día 5 1,00 7 día 6 1,02 8 día 8 1,05 9 día 8 1,06 10 día 8 1,09Promedio obtenido X= 0,95 mg/KgLa desviación estándar obtenida es de SRi = 0,041 mg/KgEl coeficiente de variación porcentual obtenido es CVRi% =3,88%El coeficiente de variación porcentual de Horwitz es: CVhRi% = 2 x 2 (1-0.5)log 0,0000010 = 10,67% 3De acuerdo a Horwitz el CV% para reproducibilidad es de 10,67%. Por lo cual se cumple el criterio deaceptabilidad establecido, ya que . CVRi% < CVhRi% GUÍA TÉCNICA N º 1 44
  46. 46. ROBUSTEZLa robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado porvariaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros del método; proporciona una indicación de lafiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez esoptimizar el método analítico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo quecondiciones analíticas ( incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a través de este resultadosconfiables.Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a unamodificación de las condiciones analíticas.Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:• Analistas• Equipos• Reactivos• pH• temperatura.• Tiempo de reacción.• Estabilidad de la muestra.• Otros.Para esta determinación se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de unmétodo químico analítico. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete variables con sóloocho análisis de una muestra.Para proceder a realizar el estudio de robustez se deben identificar aquellos factores del método queposiblemente afectarían los resultados finales obtenidos a través de este.Estas factores están presentes habitualmente en el método (ejemplo: temperatura, composición defase móvil o soluciones reactivas, pH de solución, tamaño de celda espectrofotométrica, flujo gascarrier, split, etc.). Para estudiar la robustez se procede a exponer a cada factor a un estudio devariable, es decir se expone a una variación respecto de la establecida en el método, es decir, cadavariable se estudia mediante un valor alto (A, B,...,G) y otro bajo (a,b,...,g). Una vez establecidos estosvalores se diseñan ocho pruebas de ensayo como, por ejemplo, muestra la tabla Nº 3.Los factores a estudiar no deben ser necesariamente siete; puede considerarse un número menor devariables. Esto no afectará el balance del diseño del experimento, pero es importante considerar quesiempre se den llevar a cabo los ocho pruebas de ensayo indicado.Los resultados de la experiencia analítica obtenidos con las variaciones realizadas en estas 8 pruebas serepresentan con las letras s hasta la z. GUÍA TÉCNICA N º 1 45
  47. 47. A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media delos cuatro análisis que contienen la variable en su valor más alto (mayúscula) y aquellas quecorresponden al valor más bajo (minúscula). Así, para evaluar el efecto de la primera variable obsérveseque: (s + t +u +v) = 4A = A y (w + x + y +z) = 4a = a 4 4 4 4Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivalen a “A” porque las seis restantes variablespresentes en estos cuatro resultados se anulan entre sí como consecuencia de que existen siempre dosmayúsculas y dos minúsculas de cada variable. Análogamente, la media de los resultados (w + x + y + z)equivalen a “a”.Para cualquier otra variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente:Tabla Nº 3: Prueba de Robustez de Younden y Steiner Valor de la ANALISIS condición 1 2 3 4 5 6 7 8 variable A,a A A A A a a a a B,b B B B b B b b b C,c C c C c C c C c D.d D D d d d d D D E,e E e E e e E e E F,f F f f F F f f F G,g G g g G g G G g RESULTADOS s t u v w x y zSe deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de mayorvalor versus la de menor valor: (A – a), (B – b), (C – c), (D – d), (E – e), (F – f) y (G – g)De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido, cuanto mayor sea ladiferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor menor (∆ = X-x), mayor influencia tendrádicha variable en el método analítico.Como criterio de aceptación para la robustez del método se considera que la diferencia entre el valoralto y el valor bajo sea superior a √2 de la desviación estándar de la precisión del método (S), es decir: ( X-x ) < √2 S. GUÍA TÉCNICA N º 1 46

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