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Tecnicas procedimientos sifilis_2010

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Tecnicas procedimientos sifilis_2010

  1. 1. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 1 Manual de Técnicas y  Procedimientos para el  Diagnóstico de Sífilis  Laboratorio Nacional de Referencia en ETS  Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas  ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”     
  2. 2. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Redacción/Adaptación: Patricia G. Galarza (jefa de Servicio) y Mónica Díaz. Servicio Enfermedades de Transmisión Sexual, Laboratorio Nacional de Referencia. INEI, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Ministerio de Salud. República Argentina. Última revisión: Abril 2010 La realización de esta publicación se enmarca dentro del “Proyecto Seroprevalencia de Sífilis e Infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana en Pacientes Puérperas de Argentina” Dirección de SIDA y ETS, Dirección Maternidad e Infancia, Administración de Laboratorios e Institutos de Salud Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 1
  3. 3. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCION........................................................................................................................................................3 MANIFESTACIONES CLINICAS .....................................................................................................................................3 SEROLOGÍA: INTERPRETACIÓN....................................................................................................................4 SEGUIMIENTO SEROLÓGICO:........................................................................................................................4 DIAGNOSTICO DE LABORATORIO ........................................................................................................................5 1. EXÁMEN MICROSCÓPICO EN CAMPO OSCURO PARA DETECTAR T. pallidum......................................5 2. PRUEBA DIRECTA DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES PARA T. pallidum...........................................5 3. PRUEBAS SEROLÓGICAS INESPECIFICAS PARA LA SIFILIS .....................................................................6 3.1 VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) ...............................................................6 3.1.2. REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO .........................................................................9 3.1.3. REACCION DE VDRL CON LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO ...........................................................10 3.2 REACCION EN SUERO NO CALENTADO. USR (UNHEATED SERUM REAGIN)...........................12 OTRAS PRUEBAS NO TREPONÉMICAS.......................................................................................................19 4. PRUEBAS ESPECIFICAS O CONFIRMATORIAS PARA LA SIFILIS.............................................................21 4.1. ENSAYO DE LA MICROHEMAGLUTINACION PARA LOS ANTICUERPOS DE T. Pallidum (MHA-TP)......................................................................................................................................21 4.2 MÉTODO AGLUTINACIÓN PASIVA DE PARTÍCULAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA T. Pallidum (TP-PA)............................................................................................22 4.3 REACCIÓN DE ABSORCIÓN DE ANTICUERPOS TREPONÉMICOS FLUORESCENTES (FTA- Abs) CON SUERO Y LCR ..............................................................................................................................24 ANEXO 1: PRINCIPIOS GENERALES DE SEGURIDAD.......................................................................................30 ANEXO 2: TOMA DE MUESTRA DE SANGRE Y LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO ...........................................34 Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 2
  4. 4. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - INTRODUCCION La sífilis es una enfermedad crónica que se contagia por contacto directo, transfusiones o por transmisión vertical (de la madre al feto) a través de la placenta. Se caracteriza por presentar etapas sintomáticas separadas por períodos asintomáticos o de latencia. En estos períodos de latencia, sólo una reacción serológica puede detectar la enfermedad y evitar que continúe progresando. El agente responsable es el Treponema pallidum (TP), tiene forma de espiral y su longitud alcanza unos 10 a 15 µm con un espesor es de 0,15 µm. MANIFESTACIONES CLINICAS Las manifestaciones clínicas ocurren en 3 estadios diferentes: a) Primario b) Secundario c) Tardío Esta es la evolución natural de la sífilis que puede ser detenida en sus primeras manifestaciones por un tratamiento correcto. Los tratamientos inadecuados pueden abortar alguna etapa sin curar la infección que se manifestará en una etapa posterior. Se llama sífilis infecciosa, reciente o temprana a las etapas primaria y secundaria por ser contagiosas y factibles de curar totalmente. La sífilis tardía en sus diversas manifestaciones no contagia y si bien puede ser curada, siempre dejará secuelas. a) Sífilis primaria: La lesión característica primaria, el chancro duro, es una úlcera indurada e indolora que marca el sitio de inoculación de la bacteria, acompañada por alteraciones de los ganglios linfáticos regionales. El período de incubación promedio es de 2 a 3 semanas, pudiendo variar de 9 días a 3 meses. El treponema puede atravesar la mucosa sana, o bien aprovecha lesiones en la piel (traumáticas, por hongos, herpéticas). Asienta comúnmente en glande, surco balano-prepucial, vulva o cérvix; las formas extra-genitales más frecuentes son lengua, labios, orofaringe y también ano y recto. El fluido seroso de la lesión contiene numerosos treponemas los cuales son detectados por microscopía de campo oscuro (CO), que es el diagnóstico de elección en esta etapa. La serología no se recomienda para el diagnóstico de la lesión, pues el chancro suele corresponder con el período pre-serológico de la sífilis y puede inducir a error (de todos modos, la toma de muestra para serología debe efectuarse por protocolo, ante la presencia de una lesión). Es importante un cuidadoso interrogatorio del paciente sobre los tratamientos generales o locales efectuados antes de tomar la muestra; la antibioticoterapia general anula la posibilidad de efectuar CO, ya que el TP es sensible a dosis mínimas de varios antibióticos. En este caso deberá controlarse la evolución serológica del paciente; si se utiliza VDRL y esta fuera negativa (periodo pre-serológico) repetirla a los 15 y 30 días. La FTA-abs es la más precoz de las reacciones, aparece aproximadamente a los 10 días del chancro. En los chancros orales no se utiliza el CO por la presencia de T. denticola, saprofito, de morfología similar; en estos casos, se podría utilizar la prueba directa de anticuerpos fluorescentes, DAF-TP (aunque éstos no se comercializan en el país), la amplificación génica (PCR) derivando al laboratorio de referencia o, a la punción de la adenopatía sub-maxilar. Si un chancro sifilítico no es tratado, irá atenuándose después de unas semanas y desaparecerá en 30 a 45 días sin dejar cicatriz local. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 3
  5. 5. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - b) Sífilis secundaria: Si no hay tratamiento exitoso del chancro, luego de una latencia de 60-90 días (latencia temprana) aparecen los “secundarismos” en diversos sitios del organismo, a raíz del ingreso de treponemas a la sangre. Se puede observar el exantema o roséola, una erupción extendida sobre todo en torso, que no pica ni descama. Otros síntomas son: pápulas palmares y plantares, enantema orofaríngeo, condilomas planos anales, alopecias, adenopatías generalizadas. En los condilomas el diagnostico puede hacerse por CO, pero en general en este periodo el diagnóstico es serológico, pues todas las reacciones son fuertemente reactivas. c) Sífilis tardía: Aparece luego de varios años (10-20) de latencia (latencia tardía) cuando la infección no es tratada en las etapas anteriores. Las alteraciones que se producen en este período, ya no son infecciosas, sino post-infecciosas (Ej. gomas, cardiovasculares, nerviosas). Aunque se dé el caso de que alguna de estas lesiones aflore o esté ubicada en la piel, ningún foco de sífilis tardía es contagiante, porque carece de treponemas activos. En cualquiera de sus formas clínicas el diagnóstico es serológico. Aproximadamente el 71% de los pacientes con sífilis tardía presentan pruebas no-treponémicas reactivas (la VDRL presenta títulos bajos o puede negativizarse), pero las pruebas treponémicas (TP-PA o FTA-abs) casi siempre son reactivas y pueden ser la únicas bases para el diagnóstico. Es necesario además el análisis químico y la VDRL del LCR para saber si la infección ha afectado al sistema nervioso central (SNC) aun en ausencia de síntomas. SEROLOGÍA: INTERPRETACIÓN VDRL TP-PA o FTA-abs DIAGNOSTICO Reactiva Reactiva Sífilis actual o pasada Reactiva No reactiva Inespecífico (otras patologías) No reactiva Reactiva Sífilis tratada, sífilis primaria muy reciente, sífilis tardía o reacción de prozona en sífilis secundaria No reactiva No reactiva Ausencia de infección o período de incubación de sífilis SEGUIMIENTO SEROLÓGICO: Las pruebas no treponémicas (USR, VDRL o RPR) son las únicas reacciones útiles en el seguimiento serológico del paciente, mostrando la caída gradual del título en la curación (disminución del título > 4 veces, ej: 1:32 a 1:8); o un incremento frente a un tratamiento inadecuado; o una reinfección. La MHA-TP o TP-PA y la FTA-abs permanecen reactivas por muchos años, por ello no son adecuadas para el seguimiento serológico. Es importante que el control se realice en el mismo laboratorio, con la misma prueba no treponémica y, de ser posible, con la misma marca de reactivo a fin de obtener resultados comparables. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 4
  6. 6. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - DIAGNOSTICO DE LABORATORIO 1. EXÁMEN MICROSCÓPICO EN CAMPO OSCURO PARA DETECTAR T. pallidum Muestras: Exudado seroso del chancro con pocas células sanguíneas o punción ganglionar. Técnica: 1) Limpiar la lesión con gasa y agua estéril para retirar secreciones secas o costras; secar y frotar con gasa hasta que comience a sangrar, absorber y esperar que exude una serosidad amarilla poco o nada sanguinolenta. 2) Tomar la gota apoyando sobre ella un portaobjeto limpio o utilizar un ansa estéril para transferirla al portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto. Observar inmediatamente al microscopio óptico con condensador de campo oscuro y aumento de 400 X. Si la observación al microscopio se viera retrasada, se deberá utilizar una cámara húmeda para colocar los preparados a fin de evitar la desecación. 3) El T. pallidum presenta 8-14 espiras indeformables, es de movilidad lenta, se identifica como un espiral delgado, rígido y con 3 tipos de movimientos: rotación sobre su eje (como un tirabuzón), flexión en el centro y traslación. En los chancros recientes suelen verse numerosos treponemas en el preparado, estos disminuyen o desaparecen al envejecer la lesión. 4) Si el primer portaobjeto fuera negativo, insistir con 2 tomas más. Interpretación La demostración de treponemas con morfología y motilidad características del T. pallidum constituye un diagnóstico positivo de sífilis en cualesquiera de sus fases, independientemente del resultado de la reacción serológica. La imposibilidad de encontrar la bacteria no excluye un diagnóstico de sífilis. Criterio de informe Observación en campo oscuro: negativa o positiva. 2. PRUEBA DIRECTA DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES PARA T. pallidum Es una reacción de fluorescencia directa que se aplica sobre la exudación del chancro. Se utiliza una inmunoglobulina anti-Treponema marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) que ha sido absorbida con Treponema phagedensis, treponema Reiter, o un anticuerpo monoclonal anti-T. pallidum marcado con FITC. La inmunoglobulina marcada reacciona con el antígeno T. pallidum, subespecie pallidum en el material de la prueba. Es obviamente más costosa que el CO y requiere un microscopio de fluorescencia, así como experiencia en la observación. El material es fijado con acetona antes de la coloración, por lo tanto solo se verán formas espiraladas fluorescentes pero no la típica movilidad; presenta la ventaja de permitir el envío a distancia del portaobjeto fijado. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 5
  7. 7. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Técnica 1) Desparramar en un portaobjeto formando un círculo de 1 cm de ancho, aproximadamente 10 µl del material y secar al aire. Si es posible preparar 4 portaobjetos de cada espécimen. 2) Fijar los extendidos en acetona por 10 min. o con metanol 100 % por 10 seg. o con calor suave. 3) Cubrir cada extendido con conjugado diluido (aprox. 30 µl), y colocar en cámara húmeda a 35- 37 ºC por 30 min. Nota: con el anticuerpo monoclonal, adicionar azul de Evans que puede prepararse como una solución al 0,05 % en PBS. 4) Lavar los extendidos con PBS, y cubrir con PBS por 10 min. Hacer un lavado final con agua destilada. 5) Secar con papel de filtro, colocar una gota de líquido de montaje y colocar un cubreobjeto. Colocar los portaobjetos en una cámara oscura y leer entre las 4 horas. 6) Examinar en microscopio de fluorescencia con objetivo de 40X y con un objetivo de inmersión de 100X para confirmación. Criterio de informe: Se observaron por inmunofluorescencia directa, treponemas inmunológicamente específicos para T. pallidum. 3. PRUEBAS SEROLÓGICAS INESPECIFICAS PARA LA SIFILIS 3.1 VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) Es una reacción de floculación, donde el antígeno utilizado está compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponémica mide anticuerpos antilipídicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el huésped en respuesta al material lipídico liberado de las células huésped dañadas en la infección por TP y material lipídico de la superficie celular treponémica. A causa del antígeno utilizado, esta prueba reacciona frente a otras patologías: colagenopatías, parasitosis, drogadicción o en determinadas condiciones fisiológicas como embarazo, vejez, etc. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad. Reactivos: 1) Antígeno de VDRL: Es una solución alcohólica de 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol y 0,21% 0,01% de lecitina. 2) Buffer salino VDRL, pH 6,0  0,1 ( 1,0% NaCl). Puede ser comprado o preparado en el laboratorio (ver tabla siguiente) Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 6
  8. 8. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Formaldehído neutro 0,5ml Na2HPO4 anhidro 0,037g KH2PO4 0,170 g NaCl 10.00 g Agua destilada 1000 ml NOTA: Cuando ocurra un inexplicable cambio en la reactividad de los sueros controles, verificar el pH del buffer salino ya que esto puede ser la causa. Descartar el buffer si está fuera del rango de pH 6,0  0,1. 3) Sueros controles: Control reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo (N). Para la realización de las pruebas cuantitativas el suero control debe tener un título de al menos 4 dils. 4) Solución Salina 0,9%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 0,9 gr de NaCl. 5) Solución Salina 10,0%: Agregar a cada 100ml de agua destilada 10 gr de NaCl. Equipamiento: 1) Placas de vidrio: a) Suero: Placa de vidrio de 2 x 3 pulgadas (50 X 76 mm aproximadamente) con 12 círculos planos (no cóncavos) de 14mm de diámetro. El perímetro de cada círculo debe tener un espesor tal que evite el traspaso del suero de un anillo a otro. b) Líquido cefalorraquídeo: 1) Placa de vidrio como la descrita para suero. 2) Placa Kline de vidrio de 3 x 2 ¼ pulgadas (76 mm x 25 mm aproximadamente) x 3 mm de espesor, con 12 concavidades de 16 mm de diámetro y 1,75 mm de profundidad. 2) Rotador mecánico ajustable a 180  2 r.p.m. que circunscriba un círculo de 19 mm de diámetro sobre el plano horizontal. 3) Agujas no descartables calibradas (Ver Preparación y Calibración de Agujas, pag. 17 ) Para dispensar el antígeno sobre el suero: calibre 18 Para dispensar el antígeno sobre el líquido cefalorraquídeo: calibre 21 ó 22. Si no se disponen de agujas, se pueden utilizar pipetas automáticas considerando que se hallen bien calibradas. 4) Un frasco de vidrio para la preparación del antígeno de VDRL, de 30 ml de capacidad de 35 mm de diámetro con tapa de vidrio base plana. Nota: Como este tipo de frasco resulta difícil de conseguir en el comercio se recomienda un Erlenmeyer de vidrio de 25 ml con tapa de vidrio 5) Microscopio con ocular de 10X y objetivo 10X 6) Pipetas graduada: 1,0 ml graduada en 1/100 5,0 ml graduada en 1/10 10,0 ml graduada en 1/10 Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 7
  9. 9. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Conservación del suero: Conservar el suero límpido, separado del coágulo, en heladera (2 - 8 ºC) o congelado (-20 ºC) si la determinación demorará más de 5 días. Evitar el congelamiento y descongelamiento de los especimenes. Las muestras con contaminación bacteriana o hemólisis excesiva son insatisfactorias para el ensayo. Preparación del suero: Calentar a 56 ºC en baño de María durante 30 minutos. Los sueros que se analicen después de 4 hs del primer período de calentamiento, deben volver a calentarse a 56 ºC durante 10 minutos. NOTA: Las pruebas de floculación para la sífilis son afectadas por la temperatura ambiente (Ta). Para obtener resultados confiables y reproducibles, las muestras de suero control, el antígeno y los sueros a testear deben estar a una Ta de 23 a 29 ºC en el momento de la determinación. 3.1.1 REACCION DE VDRL CUALITATIVA, EN SUERO Preparación de la Suspensión del Antígeno VDRL: 1) Al momento de preparar la suspensión todos los reactivos deben estar entre 23° y 29°C. 2) Pipetear 0,4ml de Buffer salino VDRL y agregarlo al fondo del frasco de 30 ml o del erlenmeyer de 25ml. 3) Agregar 0,5 ml de suspensión de antígeno (de la mitad inferior de una pipeta 1 ml graduada hasta la punta) directamente sobre la solución salina mientras se hace girar el frasco suave pero continuamente sobre una superficie plana. NOTA: El antígeno se añade gota a gota, de modo que se permita unos seis segundos para los 0,5ml de antígeno. La punta de la pipeta debe quedar en el tercio superior del frasco y la rotación no debe ser tan vigorosa que salpique la pipeta con la solución salina. Se obtendrá la velocidad de rotación adecuada cuando el centro del frasco describa un círculo de 5 cm de diámetro, unas tres veces por segundo. 4) Expeler la última gota de antígeno de la pipeta sin que esta toque la solución salina. 5) Proseguir con la rotación del frasco durante 10 segundos. 6) Con una pipeta de 5ml añadir 4,1ml de buffer. 7) Tapar el frasco y agitar de abajo hacia arriba y viceversa unas 30 veces en 10 segundos. 8) La suspensión de antígeno está lista y puede ser utilizada durante un día (8Hs). 9) Cada vez que se utilice la suspensión agitarla suavemente. No debe mezclarse haciéndola pasar a la fuerza de un lado a otro de la jeringa y la aguja, puesto que podría ocasionar la ruptura de partículas y la pérdida de reactividad. Procedimiento: 1) En un anillo de 14 mm de la placa, depositar con pipeta 50 µl de suero calentado. 2) Añadir 1 gota (1/60 de ml) de suspensión de antígeno (previamente resuspendida) sobre cada suero, con una aguja no descartable calibrada sin bisel de calibre 18 . 3) Rotar las placas durante 4 minutos a 180 2 rpm sobre un rotador mecánico. 4) Leer la reacción al microscopio con ocular de 10X y objetivo de 10X. 5) Informar el resultado como: REACTIVO: formación de flóculos medianos o grandes. DÉBIL REACTIVO: pequeños flóculos. NO REACTIVO: ausencia de floculación o ligeramente rugoso. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 8
  10. 10. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 3.1.2. REACCION DE VDRL CUANTITATIVA, EN SUERO Todos los sueros que produzcan resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo ligeramente rugoso en la reacción de VDRL en placa, deben analizarse de nuevo cuantitativamente hasta un título en dilución final. Las diluciones de suero que deben analizarse son: sin diluir (1:1), 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. En casos especiales continuar hasta 1:256. 1) Para cada muestra a ser testada, colocar 50 µl de NaCl al 0,9 % en los círculos 2 a 5. 2) Colocar 50 µl del suero a testar en los círculos 1 y 2. 3) Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de burbujas. 4) Transferir 50 µl del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 µl del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 µl del círculo 4 (1:8) al círculo 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 µl. 5) Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del antígeno en posición vertical, dispensar 1 ó 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (1/60 ml) de la suspensión antigénica dentro de cada círculo de prueba con una aguja no descartable sin bisel de calibre 18. 6) Rotar 4 minutos a 180  2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 7) Anotar los resultados en términos de la mayor dilución de suero que produzca un resultado Reactivo (ver tabla 1). Diagrama para la reacción cuantitativa Suero Nª 1 Suero Nª 2 1:41:4 1:1 1:2 1:8 1:16 1:1 1:2 1:16 1:8 Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 9
  11. 11. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Tabla 1: Informe de los resultados cuantitativos en suero Suero no diluido Resultado en dilución de suero: Informe (1:1) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 R D N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) R R D N N N Reactivo, 2 dils R R R D N N Reactivo, 4 dils D D R R D N Reactivo, 8 dils N (rugoso) D R R R N Reactivo, 16 dils D N N N N N Débil Reactivo, 1 dil R: Reactivo, N: no reactivo, D: débil 8) Si la más alta dilución probada (1:16) es reactiva, proceder como sigue: a) Preparar una dilución 1:16 de la muestra por adición de 100 µl del suero a 1,5 ml de NaCl al 0,9 %. Mezclar. b) Colocar 50 µl de la solución de NaCl 0,9 % en los círculos 2, 3, 4 y 5 de la placa. c) Colocar 50 µl de la dilución 1:16 en los círculos 1 y 2. d) Con la misma pipeta, realizar diluciones seriadas dobles a partir del círculo 2 y completar la prueba como se describió antes en los pasos 3 a 6. e) Leer los resultados como se describió previamente. 3.1.3. REACCION DE VDRL CON LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO Preparación de la "Suspensión de antígeno sensibilizada": a) Preparar la suspensión de antígeno como describe el fabricante para la reacción en suero. b) Añadir una parte de solución salina al 10 % a una parte de suspensión del antígeno. c) Mezclar bien por rotación o inversión del tubo y dejar en reposo durante 5 minutos por lo menos, pero no más de 2 horas, antes de utilizarla. Control de la reactividad de la suspensión del antígeno sensibilizado Siempre se debe incluir en la realización de la reacción de VDRL LCR controles para verificar la reactividad de la suspensión de antígeno sensibilizado. Preparar muestras de LCR simulado diluyendo un suero que al menos sea reactiva su VDRL cuando es diluido en 1:80 en solución salina de NaCl al 0,9%. Para este control no se debe calentar a 56C el suero. Ejemplo: hacer una dilución en un tubo de ensayo de 50µl del suero en 3,95 ml de NaCl al 0,9%. También incluir un suero VDRL no reactivo. Realizar la reacción como esta indicado bajo el título de reacción de VDRL cualitativa con LCR. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 10
  12. 12. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Registrar los resultados de los controles como: REACTIVO: flóculos definidos de cualquier grado. NO REACTIVO: Sin flóculos o muy ligera rugosidad. No utilizar el antígeno sensibilizado si no cumple con estos criterios de reactividad. Preparación del LCR: Centrifugar y decantar el LCR. El LCR se analiza sin calentarlo previamente. Las muestras que a simple vista se vean contaminadas o que contengan sangre no son adecuadas para la reacción. Si el ensayo demora más de 4 hs. refrigerar la muestra (2-8 ºC), si demora más de 5 días congelar a –20 ºC o menor. 3.1.3.1. REACCION DE VDRL CUALITATIVA CON LCR. 1) En una concavidad de la placa de aglutinación depositar 50 µl de LCR con pipeta automática. 2) Añadir una gota (10 µl) de suspensión de antígeno sensibilizada con una aguja de calibre 21 o 22. 3) Agitar la placa durante 8 minutos a 180  2 rpm en un rotador automático. 4) Leer la reacción al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 5) Informar el resultado como: REACTIVO: flóculos definidos de cualquier grado. NO REACTIVO: Sin flóculos o muy ligera rugosidad. 3.1.3.2. REACCION CUANTITATIVA VDRL EN LCR. Se practican reacciones cuantitativas con todos los LCR que resulten Reactivos en la reacción cualitativa. 1) Para cada muestra a ser testada, colocar 50 µl de NaCl al 0,9 % en los círculos 2 a 5. 2) Colocar 50 µl del LCR a testar en los círculos 1 y 2. 3) Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de burbujas. 4) Transferir 50 µl del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. 5) Transferir 50 µl del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3. 6) Transferir 50 µl del círculo 4 (1:8) al 5 (1:16), mezclar como en el paso 3 y descartar 50 µl. 7) Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del antígeno en posición vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire, y luego colocar exactamente una gota (10 µl) de la suspensión antigénica dentro de cada círculo de testeo con una aguja de calibre 21 ó 22. 8) Rotar 8 minutos a 180  2 rpm y leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 9) Anotar los resultados en términos de la mayor dilución de LCR que produzca un resultado Reactivo. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 11
  13. 13. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Tabla 2: Informe de los resultados cuantitativos en LCR LCR no diluido Resultado en dilución de LCR: Informe (1:1) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 R N N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) R R N N N N Reactivo, 2 dils R R R N N N Reactivo, 4 dils R R R R N N Reactivo, 8 dils N (rugoso) R R R R N Reactivo, 16 dils R: Reactivo, N: no reactivo 3.2 REACCION EN SUERO NO CALENTADO. USR (UNHEATED SERUM REAGIN) PRINCIPIOS DE LA PRUEBA La USR es una prueba microscópica, no-treponémica y de floculación en placa. El antígeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crónicas. La prueba de microfloculacion USR usa una suspensión de antígeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscópicamente y es rápido y fácil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensión antigénica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente. RECOLECCION Y MANIPULEO DE LA MUESTRA Muestra 1. Evitar infecciones accidentales por pinchaduras o cortes cuando se colecta y procesa la muestra, observando las normas de bioseguridad correspondientes. 2. El suero es la única muestra apropiada para la USR. 3. Una muestra de suero aceptable no debería contener partículas que pudieran interferir con la lectura de los resultados. Las muestras de suero que estuvieran excesivamente hemolizadas, visiblemente contaminadas con bacterias, quilosas o extremadamente turbias, son insatisfactorias. Una muestra esta muy hemolizada cuando un impreso no puede ser leído a través de ella. Nota: La hemólisis puede ser causada por transportar la muestra en un clima extremadamente frío o caliente, sin el aislamiento apropiado. 4. No todas las muestras inadecuadas deberían ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra no satisfactoria es recibida en el laboratorio, avisar al medico solicitante y discutir si la Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 12
  14. 14. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - muestra debería ser analizada. Si el resultado de la prueba es aun requerida por el médico, la condición de la muestra debe ser indicada en el informe. Recolección Los procedimientos para la recolección y procesamiento de sangre venosa y líquido cefalorraquídeo se indican en el anexo 2. 1. Recolectar sangre entera en un tubo limpio y seco sin anticoagulante. 2. Rotular cada muestra con la identificación del paciente y la fecha. Procesamiento 1. Dejar el tubo a temperatura ambiente el tiempo suficiente (aproximadamente 20 minutos) para que se forme el coagulo en la muestra. 2. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, entre 1000 a 1200 x g a fin de sedimentar los elementos celulares. 3. Dejar la muestra de suero en el tubo de recolección original o transferirlo a un tubo limpio si el análisis va a demorarse más de 4 hs. o el suero va a ser calentado. Aunque la inactivación por calentamiento no es necesaria, el suero puede ser calentado a 56°C por 30 minutos para reducir el virus del VIH tipo 1, sin afectar la prueba en curso. 4. Si la muestra de suero va a ser derivada a otro sitio para el testeo, se deben utilizar los contenedores apropiados. 5. Si la prueba va a ser demorada, guardar el suero en la heladera (2 a 8°C). Si la prueba va a ser demorada más de 5 días, congelarla a –20°C o menos. Evitar repetidos congelamientos y descongelamientos de la muestra. 6. Las muestras deberán ser llevadas a temperatura ambiente (23 – 29°C) antes de realizar la prueba. MATERIALES Reactivos Adquiridos 1. Suspensión antigénica USR. Una combinación estabilizada de cardiolipina, colesterol y lecitina en una solución resuspendida de EDTA, cloruro de colina, fosfato y timerosal. La suspensión antigénica se guarda a 2 – 8 °C. Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 año desde la fecha de manufactura o hasta la fecha de expiración. 2. Alcohol, Etanol 95% 3. Acetona Preparados 1. Muestras de suero control. Reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo (NR). 2. Solución salina 0,9%. Agregar 0,9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100 ml de agua destilada. Equipamiento 1. Aguja no descartable calibrada, calibre 18 sin bisel (ver Preparación y Calibración de Agujas, pag. 17 ) 2. Jeringa de vidrio (2 a 5 ml) 3. Pipeta automática de 50 µl. 4. Portaobjetos, 2 x 3 pulgadas con 12 anillos parafinados o cerámicos de aproximadamente 14 mm de diámetro. 5. Rotador mecánico ajustable a 180 ± 2 rpm, circunscribiendo un círculo de 19 mm de diámetro sobre un plano horizontal. 6. Microscopio con oculares de 10X y un objetivo de 10X. 7. Centrífuga. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 13
  15. 15. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 8. Heladera de 2-8 °C. 9. Cobertor humidificante (opcional). 10. Guantes de latex descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora. 11. Contenedores para descartar y desinfectantes. PROCEDIMIENTOS Prueba Cualitativa 1. Las pruebas de floculación en placa para sífilis, son afectadas por la temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la suspensión antigénica de USR, los controles y la muestra a analizar deben estar a temperatura ambiente (23 – 29 °C) cuando se realiza la prueba. 2. Colocar con una pipeta automática 50 µl de suero no calentado en un anillo de parafina o cerámica de la placa. No usar placas de vidrio con concavidades, pocillos o anillos de vidrio. 3. Resuspender suavemente la suspensión de antígeno de USR. 4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensión antigénica y la jeringa en posición vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja; luego agregar exactamente 1 gota (22 µl) de suspensión antigénica a cada círculo conteniendo suero. 5. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar la placa por 4 minutos a 180 ± 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las placas con un cobertor humidificante durante la rotación para prevenir la evaporación excesiva. 6. Inmediatamente después de la rotación, sacar la placa del rotador y leer los resultados. 7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestra de suero que produzcan un resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Lectura e informe de los resultados cualitativos 1. Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y objetivo de 10X. 2. Informar los resultados de la siguiente manera: Lectura Informe Grumos grandes o medianos Reactivo (R) Grumos pequeños Débil reactivo (D) Sin grumos o muy ligera rugosidad No reactivo (NR) Prueba Cuantitativa 1. Diluir hasta un título de punto final todas las muestras que produzcan resultados reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Analizar la muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en una sola placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de suero, según se muestra en la figura siguiente. 1:1 1:2 1:4 1:8 1:1 1:2 1:4 1:1 1:2 1:4 1:8 1:8 Suero 1 Suero 2 Suero 3 Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 14
  16. 16. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 2. Colocar 50 µl de solución salina al 0,9 % en los círculos 2 a 4. No desparramar la solución salina. 3. Con una pipeta automática, colocar 50 µl del suero en el círculo 1 y 50 µl en el círculo 2. 4. Mezclar la solución salina y el suero en el círculo 2 utilizando la pipeta automática, por aspiración y eliminación, 8 veces. Evitar la formación de burbujas. 5. Transferir 50 µl del círculo 2 (1:2) al círculo 3 (1:4), mezclar como en el paso 3. Transferir 50 µl del círculo 3 (1:4) al círculo 4 (1:8), mezclar como en el paso 3 y descartar los últimos 50 µl. 6. Resuspender suavemente la suspensión antigénica. Sosteniendo el frasco del antígeno en posición vertical, dispensar 1 o 2 gotas a fin de liberar el pico vertedor de aire y luego colocar exactamente una gota (22 µl) de la suspensión antigénica dentro de cada círculo. 7. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar 4 minutos a 180  2 rpm. Cuando la prueba es realizada en un clima muy seco, colocar la placa bajo un cobertor humidificante durante la rotación para preservar la evaporación. 8. Inmediatamente después de la rotación, leer los resultados al microscopio con ocular y objetivo de 10X. 9. Anotar los resultados en términos de la mayor dilución de suero que produzca un resultado Reactivo (NO débil reactivo). Informe de los Resultados Cuantitativos Suero no diluido Resultado en diluciones del suero (1:1) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Informe R D N N N N Reactivo, no diluido (1 dil) R R D N N N Reactivo, 2 dils R R R D N N Reactivo, 4 dils D D R R D N Reactivo, 8 dils N (rugoso) D R R R N Reactivo, 16 dils D N N N N N Débil Reactivo, 1 dil 10. Si la dilución más alta probada (1:8) es reactiva, continuar de la siguiente manera: a. Preparar en un tubo una dilución 1:8 de la muestra de suero. Agregar 0,1 ml (100 µl) de suero a 0,7 ml de solución salina 0,9%. Mezclar adecuadamente. b. Colocar 50 µl de solución salina 0,9% en los círculos 2, 3 y 4 de la placa. Preparar diluciones seriadas adicionales para muestras fuertemente reactivas. c. Agregar 50 µl de la dilución 1:8 preparada anteriormente a los anillos 1 y 2. d. Realizar diluciones seriadas al medio, comenzando con el anillo 2 y descartar los últimos 50 µl. Completar la prueba como se describió en los pasos 6 a 9. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 15
  17. 17. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 11. Una vez finalizadas las pruebas del día, tapar el antígeno remanente. En el caso de utilizar una aguja y jeringa dispensadora o un dispositivo dispensador separado, limpiarlos enjuagando con agua, alcohol y acetona. Sacar la aguja de la jeringa después de limpiarlos. Interpretación de los Resultados 1. La prueba de USR es una gran ayuda en el diagnóstico de sífilis. Para arribar al diagnostico definitivo de sífilis, el profesional combina los resultados de la USR con otras pruebas serológicas, exámenes de campo oscuro, signos y síntomas clínicos y factores de riesgo. Sin alguna otro soporte para el diagnostico de sífilis, un resultado de USR reactivo, puede deberse a causas que no correspondan con una infección por treponema patógeno. El valor predictivo de una USR en el diagnóstico de sífilis se incrementa cuando se combina con una prueba treponémica reactiva. 2. La prueba reactiva puede sugerir infección pasada o presente con Treponema patógeno aunque también podría ser una reacción falso positiva. 3. Las reacciones falso positivas pueden deberse a un error de laboratorio como así también a anticuerpos séricos que no están relacionados con Treponemas patógenos. Los errores técnicos son detectados por la prueba USR no reactiva sobre una segunda muestra sérica. Un resultado reactivo de USR debido a infección no relacionada u otros factores, es identificada por los resultados de una prueba treponémica no reactiva simultánea. 4. La prueba USR no reactiva sin evidencia clínica de sífilis, puede sugerir una infección sifilítica pasada, infección con tratamiento efectivo u ocasionalmente, una infección de larga evolución. Una prueba no reactiva USR con evidencia clínica de sífilis puede deberse a sífilis primaria temprana; sífilis secundaria, como resultado de una reacción de prozona; y a algunos casos de sífilis tardía. Si se sospecha reacción de prozona, debería repetirse la prueba con diluciones del suero del paciente 1:16 antes de determinar que la muestra de suero es no reactiva. Una prueba USR no reactiva no excluye una sífilis en período de incubación. 5. Cuando se realiza la prueba USR cuantitativa en pacientes con sífilis, una subida de cuatro veces el título (1:4 a 1:16) en una muestra seriada puede sugerir una infección, una reinfección o un fallo de tratamiento; una disminución de 4 veces el título (1:64 a 1:16) después del tratamiento para sífilis temprana (estadío primario o secundario), usualmente sugiere que la terapia fue adecuada. 6. Todos los resultados de USR cualitativa reactivos, deberían ser cuantificados hasta un punto final y su título informado. De forma infrecuente, se pueden observar títulos altos de USR en pacientes con coinfección por HIV-1 y altos títulos falsos positivos en pacientes con linfomas. Fuentes de error 1- La reactividad de la prueba disminuye si la temperatura del área de trabajo, muestras y/o reactivos es menor a 23ºC y se incrementa si es mayor a 29ºC. 2- Si se trabaja con muestras de sueros hemolizados, contaminados o extremadamente turbios, los resultados son impredecibles. 3- Si el antígeno está vencido o carece de adecuada reactividad estándar los resultados pueden ser impredecibles. 4- Si no se siguen estrictamente las condiciones en cuanto a la velocidad y el tiempo de rotación de los antígenos y las muestras, los resultados pueden ser incorrectos. Limitaciones de la prueba 1- Ocasionalmente puede aparecer la reacción de prozona, en la cual ocurre una inhibición parcial o completa de la reactividad con suero no diluído y la maxima reactividad se obtiene solamente con suero diluído. El fenómeno de prozona puede sospecharse cuando la muestra produce un resultado no reactivo rugoso o débil reactivo en la prueba de tamizaje cualitativa. Todas las muestras probadas que producen algún grado de rugosidad o reactividad con el antígeno de USR en la prueba de tamizaje cualitativa Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 16
  18. 18. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - puede ser probado de nuevo usando un procedimiento cuantitativo. Una muestra debería ser analizada para el fenómeno de prozona cuando existe sospecha clínica de sífilis, pero la USR cualitativa es no reactiva. 2- La USR puede ser reactiva en personas provenientes de áreas geográficas done el yaws es endémico. Se hallaron títulos residuales de estas infecciones menores a 1:8 cuando se utilizaron otras pruebas treponémicas. 3- Las reacciones biológicas falso positivas ocurren ocasionalmente con antígenos cardiolipinicos, principalmente en muestras de drogadictos, en personas con lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, o neumonía viral, o en quienes recientemente han sido vacunados. 4- Los títulos séricos de pruebas no treponémicas de personas tratadas en estadío de sífilis latente o tardía o quienes se han reinfectado, no disminuyen tan rápidamente como en aquellas personas en estadíos más tempranos de su primera infección. De hecho, en estas personas los títulos séricos disminuyen rápidamente reteniendo un titulo de bajo nivel de reactividad de por vida. 5- La USR no ha sido evaluada para muestras de plasma, por lo tanto el plasma no debería ser usado en esta prueba. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 17
  19. 19. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Calibración de Agujas para las Pruebas de VDRL, USR y RPR Preparación y calibración de agujas no descartables para el ensayo de floculación en placa: Si no se cuenta con agujas sin bisel, este se puede eliminar utilizando alguna herramienta adecuada. 1) Hacer una muesca profunda por encima del bisel de la aguja. Romper la punta con un alicate. 2) Colocar la aguja en una jeringa de 1 ml, llenarla con 1 ml de la suspensión de antígeno, eliminar las burbujas y enrasar para que queden 0,5ml, (enrasar a 1ml en el caso del antígeno USR). Sostener la jeringa en posición vertical, y cuidadosamente presionar el émbolo. 3) Contar la cantidad de gotas que se liberan en el volumen medido. 4) Las agujas que no cumplan con las condiciones indicadas deben ser ajustadas antes de usarse, a fin de que rindan los volúmenes correctos. 5) Si la aguja libera demasiadas gotas, la abertura de la extremidad es pequeña. Para ajustarla, debe abrirse con un instrumento puntiagudo. 6) Si la aguja libera insuficiente cantidad de gotas, la abertura es demasiado grande. Ajústese aplastando ligeramente los bordes de la aguja hacia delante o limándolos. 7) Una vez calibrada, se debe proteger contra golpes y caídas. Limpiarla con agua, alcohol y acetona. 8) Controlar el volumen una vez al mes o cuando sufre algún golpe o deformación. Reacción (cuali y cuantitativa) Reactivo Calibre de la aguja Volúmen requerido por gota (l) N° de gotas liberadas por 0,5 ml de reactivo VDRL Suspensión de Ag 18 17 30  1 VDRL-LCR Suspensión de Ag sensibilizado 21 ó 22 10 50  1 USR Suspensión de Ag 18 22 45  1 ( por 1 ml) RPR Suspensión de Ag 20 17 30  1 Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 18
  20. 20. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - OTRAS PRUEBAS NO TREPONÉMICAS Con la excepción del antígeno de VDRL, los antígenos de las pruebas no treponémicas están estabilizados por el agregado de sal disódica de EDTA, además de cloruro de colina para eliminar la necesidad de inactivar el suero por calentamiento. Las pruebas no treponémicas se dividen en procedimientos microscópicos y macroscópicos. Microscópicos VDRL (venereal disease research laboratory) USR (unheated serum reagin) Los procedimientos se describieron anteriormente. Macroscópicos RPR (rapid plasma reagin) En esta prueba, se le agregan partículas de carbón al antígeno para facilitar la visualización de la floculación. TRUST (toluidine red unheated serum test) Esta prueba difiere de la anterior en que se agregan partículas de pintura pigmentada al antígeno. Esta prueba no se comercializa en nuestro país. En ambas pruebas, las partículas quedan atrapadas en el complejo antígeno-anticuerpo formado con el suero. Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponémicas Sensibilidad (%) por estadío de sífilis no tratada (rango) Prueba Primaria Secundaria Latente Tardía Especificidad No-sífilis % (rango) VDRL 78 (74-87) 100 96 (88-100) 71 (34-94) 98 (96-99) RPR 86 (77-99) 100 98 (95-100) 73 98 (93-99) USR 80 (72-88) 100 95 (88-100) - 99 TRUST 85 (77-86) 100 98 (95-100) - 99 (98-99) Limitaciones de los procedimientos no específicos A. Muestras de plasma inapropiadamente recolectadas, por ej. muestras procesadas después de 24 hs de su recolección o suero de cordón, pueden dar reacciones mínimamente reactivas. Por esta dificultad el uso de plasma y/o sangre de cordón debe restringirse a situaciones de pruebas especiales. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 19
  21. 21. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - B. Pueden ocurrir fenómenos de prozona en un 1 a 2 % de los pacientes con sífilis secundaria. Un fenómeno de prozona ocurre cuando el anticuerpo esta en exceso, es incompleto o bloquea la reacción normal antígeno-anticuerpo. Si el fenómeno de prozona ocurre como resultado del exceso de anticuerpo, como es usualmente el caso en las pruebas serológicas para sífilis, entonces una dilución del anticuerpo a 1:16 es adecuado para obtener la concentración proporcional óptima y una reacción realmente detectable. Inicialmente estas muestras pueden exhibir un patrón de no reactividad, la cual es ligeramente granular o rugosa, o mostrar una apariencia atípica. Por encima de la dilución, la reactividad se incrementará y luego decrecerá hasta que el punto final del título sea alcanzado. C. Un porcentaje entre 1-2 % de resultados falso positivos ocurren en la población general, sin tener en cuenta la prueba no treponémica usada. En poblaciones de drogadictos endovenosos, más del 10 % de las muestras de suero pueden dar resultados falso positivos. Los títulos falso positivos son usualmente menores que 1:8, pero títulos bajos pueden observarse durante la sífilis latente y tardía y títulos altos de resultados falso positivos ocurren en drogadictos endovenosos y en algunos pacientes con linfomas. Los resultados falso positivos pueden ser excluidos por la repetición de la prueba, confirmación por una prueba treponémica, y subsiguiente evaluación de una segunda muestra. D. La mala interpretación de las pruebas ocurren más frecuentemente por: 1) Falla en reconocer que una variación de ± 1 título de punto final es inherente a la mayoría de las pruebas serológicas. 2) Falla para establecer la verdadera positividad de los resultados de la prueba. 3) Falla para obtener una adecuada historia del paciente. E. Un error particular que puede conducir a una mala interpretación, es usar más de una prueba no treponémica para monitorear el tratamiento. La misma prueba deberá ser usada en la determinación cualitativa inicial y subsecuentes pruebas cuantitativas. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 20
  22. 22. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 4. PRUEBAS ESPECIFICAS O CONFIRMATORIAS PARA LA SIFILIS Todas las pruebas treponémicas usan T. pallidum o sus componentes como antígeno. Los ensayos treponémicos son usados primariamente para verificar la reactividad en las pruebas no- treponémicas, sensibles pero menos específicas. Estos ensayos pueden ser usados para confirmar una impresión clínica de sífilis en pacientes con resultados no reactivos en ensayos no-treponémicos, tal como ocurre en la sífilis tardía. Los ensayos treponémicos standardizados de uso actual consisten en técnicas que utilizan anticuerpos anticuerpos indirectos, técnicas de hemoaglutinación y aglutinación de partículas. 4.1. ENSAYO DE LA MICROHEMAGLUTINACION PARA LOS ANTICUERPOS DE T. Pallidum (MHA-TP) Preparar los reactivos de acuerdo a las indicaciones del fabricante del equipo. Preparación del suero: Añadir 20 µl de suero no calentado de prueba y control a 0,38 ml de diluente sorbente en tubo (dilución de 1:20). Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Valoración cualitativa: 1) Colocar 25 µl de cada suero de prueba absorbido en dos celdillas contiguas de la placa de microhemoglutinación (96 hoyos fondo en U). 2) Con una pipeta automática añadir 75 µl de la dilución de trabajo de células sensibilizadas (antígeno) a cada celdilla de las hileras A, C, E y G (reacción de suero absorbido). 3) Añadir 75 µl de la dilución de trabajo de células no sensibilizadas a cada una de las celdillas de las hileras B, D, F y H (suero control absorbido). 4) La dilución sérica final en cada celdilla de prueba y control es de 1:80. 5) Preparación de sueros control Reactivos y No Reactivos: a) Preparar diluciones al doble del suero control Reactivo absorbido en diluente sorbente que exceda del título terminal (dilución sérica final) establecido para este suero, por ejemplo, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, etc. Medir 25 µl del suero control Reactivo absorbido en otra celdilla para los sueros-control con eritrocitos no sensibilizados. b) Medir 25 µl de suero control No reactivo absorbido en cada una de dos celdillas contiguas (suero de prueba y control). c) Añadir 75 µl de células no sensibilizadas a cada celdilla para los sueros control con eritrocitos no sensibilizados Reactivos y No reactivos. d) Añadir 75 µl de las células sensibilizadas a todas las demás celdillas que contengan diluciones de sueros control Reactivas y la dilución de suero control No Reactiva. 6) Preparación de los reactivos control: a) Añadir 75 µl de eritrocitos sensibilizados a 25 µl de diluente sorbente en una celdilla. b) Añadir 75 µl de eritrocitos no sensibilizados a 25 µl de diluente en otra celdilla. 7) Agitar suavemente la bandeja y cubrir con una bandeja vacía. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 21
  23. 23. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 8) Incubar la bandeja a temperatura ambiente durante 4 horas, por lo menos. El período de incubación puede extenderse toda la noche. 9) Hacer la lectura de las características de sedimentación de los glóbulos rojos. Criterio de Informe: REACTIVO: Capa celular lisa que cubre todo el fondo de la celdilla o un área menor de la celdilla. NO REACTIVO: Fondo compacto bien definido en el centro de la celdilla. 4.2 MÉTODO AGLUTINACIÓN PASIVA DE PARTÍCULAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA T. Pallidum (TP-PA) Fundamento El método utiliza como soporte partículas de gelatina sensibilizadas con Treponema pallidum patógeno (cepa Nichols). El principio de la reacción se basa en que las partículas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos contra TP en suero/plasma humano. Técnica Preparar los reactivos de acuerdo a las indicaciones del fabricante del equipo. 1) En una microplaca de fondo en U colocar 100 µl de diluyente de muestra en los pocillos 1A, 1B, 1C, 1D, y 1E. 2) Colocar 25 µl de diluyente de muestra en los pocillos 2 a 11 de la hilera A y en los pocillos 2 a 4 de las hileras B a E. 3) Agregar 25 µl del control positivo al pocillo N°1A (dilución 1:5 ). 4) Con la misma pipeta mezclar bien y transferir 25 µl al pocillo 2A . Mezclar bien y repetir el procedimiento hasta el pocillo 9A descartando 25µl para obtener diluciones seriadas al doble. 5) Colocar 25µl del suero Nª1 al pocillo 1B, mezclar bien y transferir 25µl al pocillo 2B. Mezclar y repertir el procedimiento hasta el pocillo 4B descartando 25µl 6) Realizar la misma operación con los sueros: Nº 2 en la hilera C Nº 3 en la hilera D Nº 4 en la hilera E 7) Colocar 25µl de partículas no sensibilizadas (PNS) en los pocillos: 3ª, 3B, 3C, 3D, 3E y 11A 8) Colocar 25µl de partículas sensibilizadas (PS) en los pocillos 4A hasta 10A y en los pocillos 4B, 4C, 4D y 4E . Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 22
  24. 24. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 9) Agitar suavemente la placa. Luego cubrirla y dejarla reposar a temperatura ambiente (entre 15- 30 °C) por 2 hs horas antes de la lectura. La incubación puede extenderse toda la noche sin diferencias perceptibles en los patrones. 10) Controles: a) Confirmar que cada muestra y el control reaccionen negativamente (en la dilución final 1:40) con las partículas no sensibilizadas, pocillos: 3A, 3B, 3C, 3D, y 3E. b) Confirmar que el diluyente de muestra reaccione negativamente con las partículas sensibilizadas, pocillo 9A y con las partículas no sensibilizadas, pocillo 10A [control de reactivos (C )]. c) Confirmar que, el título del control positivo sea de 1:320 ± 1 dilución. Esquema de la microplaca: diluciones finales 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Control Positivo A 1:40 PNS 1:80 PS 1:160 PS 1:320 PS 1:640 PS 1:1280 PS 1:2560 PS C PS C PNS Suero 1 B 1:40 PNS 1:80 PS Suero 2 C “ “ Suero 3 D “ “ Suero 4 E “ “ Interpretación de los resultados: Colocar suavemente la microplaca sobre un lector de placa, comparar los patrones de aglutinación con los de los reactivos control e interpretar según el siguiente criterio: Patrón de aglutinación Lectura Interpretación Partículas concentradas en forma de botón en el centro del hoyo con un suave círculo marginal externo. (-) No reactivo Partículas concentradas en forma de anillo compacto con un contorno externo redondeado y liso (±) No concluyente Anillo grande definido con un margen externo desparejo y aglutinación periférica. (+) Reactivo Partículas aglutinadas extendidas cubriendo el fondo del hoyo uniformemente. (++) Reactivo Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 23
  25. 25. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 3.4 REACCIÓN DE ABSORCIÓN DE ANTICUERPOS TREPONÉMICOS FLUORESCENTES (FTA-Abs) CON SUERO Y LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) Fundamento del ensayo: Es una técnica de inmunofluorescencia indirecta utilizada como ensayo confirmatorio para sífilis. El suero del paciente, el cual es diluído1:5 en sorbente (un extracto de cultivo de Treponema phagedenis, treponema Reiter), es colocado sobre un círculo de una placa que contiene fijado T. pallidum subespecie pallidum. Si el suero del paciente contiene anticuerpos anti T. pallidum - IgG e IgM- estos se unirán a los treponemas. A continuación se agrega un antigamma humana marcada con isocianato de fluoresceína que se unirán a estos anticuerpos y como resultado se observará, con microscopía de fluorescencia , espiroquetas con morfología típica fluorescente de color verde limón. Materiales necesarios: Pipetas de 1ml y 5ml Propipetas Cubre objetos Tubos de ensayo Microtubos de ensayo de 1,5 ml Tips amarillos Cámara húmeda Cámara para lavar portaobjetos (Jarra de Coplin) Planchuela de telgopor para colocar los tubos de ensayos en el baño termostatizado Equipos: Incubador 35-37ºC Baño termostatizado de agua a 56°C Microscopio de fluorescencia Micropipetas de 5-40ul y 50-200ul Vortex phmetro Cronómetro Reactivos: 1) Antígeno de Treponema pallidum Placa de vidrio con círculos de 6mm de díametro conteniendo el antígeno fijado de Treponema pallidum (cepa Nichols) extraída de tejido testicular de conejo. 2) Sorbente para la reacción de FTA-Abs. Sorbente obtenido a partir de cultivo de treponema Reiter. Se puede comprar en estado liofilizado. 3) Globulina antihumana marcada con fluoresceína (conjugado) Determinar el título de trabajo de cada nuevo lote de acuerdo a lo detallado bajo el título de: Titulación de Globulina antihumana marcada con fluoresceína (conjugado). 4) Sueros controles: a) Control reactivo (4+): Mezcla de sueros humanos obtenidos de donadores sifilíticos que presenta fuerte fluorescencia (4+) al diluirse 1:5 en PBS, y una fluorescencia solo ligeramente disminuida cuando es diluido 1:5 en sorbente. b) Control mínimo reactivo (1+): Una dilución de suero reactivo que presente el grado mínimo de fluorescencia notificado como “Reactivo” a fin de usarla como estándar para la lectura. El suero control Reactivo (4+) puede usarse para este control cuando se diluye en PBS. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 24
  26. 26. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - c) Control de suero inespecífico: Una mezcla de sueros no sifilítico que muestre una fluorescencia inespecífica mayor o igual a 2+ cuando es diluido 1:5 en PBS y que no muestre fluorescencia inespecífica cuando es diluido 1:5 en sorbente. 5) Solución salina amortiguada de fosfato, pH 7,2 ± 0,1 (PBS) NaCL 7.65 g Na2HPO4 0.724 g KH2PO4 0.21 g Agua destilada 1000 ml Determinar el pH y ajustarlo a pH 7,2 ± 0,1 con NaOH 1N 6) PBS con 2% de Tween 80: Precalentar a 56ºC el Tween 80 y el PBS a utilizar. Agregarle a 49ml de PBS, 1 ml de Tween 80 midiéndolo desde la parte inferior de la pipeta y enjuagar la pipeta para lograr una buena disolución. Ajustar a pH 7,2 con NaOH 0,1 N. Descartar la solución cuando aparezcan precipitados o cambia el pH. 7) Líquido de montar: Agregarle a una parte de PBS, pH 7,2, nueve partes de glicerina ( grado reactivo) 8) Agua destilada, cantidad necesaria Procedimiento: 1) Desactivar en microtubos de ensayo como mínimo 30l de los sueros incógnitas y los sueros controles -reactivo (4+), mínimo reactivo (1+), control inespecífico- en el baño termostatizado a 56°C durante 30 minutos. Si los sueros fueron previamente desactivado el tiempo requerido será de 10 minutos. Dejar la placa del antígeno que tome temperatura ambienta antes de sacarla de su envoltorio. 2) Control de calidad diario: Preparar los siguientes controles para cada corrida ensayada (ver tabla 4) a) Control reactivo (4+): 1) Sin absorber: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control reactivo con 40 l de PBS. 2) Absorbido: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control reactivo con 40 l de sorbente. b) Control mínimo reactivo (1+): Este es una dilución en PBS de un suero control reactivo el cual da un grado de fluorescencia (1+) considerado reactivo. c) Control de suero inespecífico: Una mezcla de sueros no sifilítico que muestre una fluorescencia inespecífica  2+ sin absorber y que esencialmente no muestre fluorescencia (N ó ) cuando es absorbido. 1) Sin absorber: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control de suero inespecífico con 40 l de PBS. 2) Absorbido: En un microtubo de ensayo mezclar bien 10 l de control de suero inespecífico con 40 l de sorbente. d) Control de fluorescencia no específica por el conjugado: 1) Cubrir un círculo de antígeno con 10l de PBS en lugar del suero Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 25
  27. 27. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 2) Cubrir un círculo de antígeno con 10l de sorbente en lugar del suero Tabla 4: Patrón de controles para FTA-Abs Controles Dilución Lectura a. 1:5 dilución en PBS R 4+ Reactivo b. 1:5 dilución en sorbente R (4+ a 3+) Mínimo reactivo dilución en PBS del control reactivo R1+ a. 1:5 dilución en PBS R (2+ a 4+) Suero no específico b. 1:5 dilución en sorbente N a  Fluorescencia no específica por el conjugado a. Antígeno, PBS, conjugado b. Antígeno, sorbente, conjugado N N N: No reactivo R: Reactivo 3) Para cada suero a ensayar, agregar 10 l de suero en un microtubo de ensayo. 4) Pipetear 40 l de sorbente y mezclarlo con el suero ochos veces, aspirando y expulsando con la micropipeta. 5) Colocar el portaobjeto que contiene los círculos del antígeno sobre la base de la cámara húmeda. 6) Se cubren los círculos del antígeno con 10 l de: CírculoN°1: Control Reactivo 4+, dilución en PBS CírculoN°2: Control Reactivo 4+, dilución en sorbente CírculoN°3: Control mínimo reactivo 1+ CírculoN°4: Control suero no específico, dilución en PBS CírculoN°5: Control suero no específico, dilución en sorbente CírculoN°6: Control de fluorescencia no específica por el conjugado, PBS CírculoN°7: Control de fluorescencia no específica por el conjugado, sorbente CírculoN°8: Suero a ensayar, dilución 1:5 en sorbente CírculoN°9: Suero a ensayar, dilución 1:5 en sorbente CírculoN°10: Suero a ensayar, dilución 1:5 en sorbente 7) Se coloca la tapa de la cámara húmeda y se incuba a 35°-37°C durante 30 minutos 8) Procedimiento de lavados: a) Lavar haciéndole correr PBS durante 5 segundos, manteniendo la placa del antígeno inclinada. b) Sumergirla dentro de PBS en la jarra de Coplin durante 5 minutos. c) Agitar la placa levantándola y sumergiéndola al menos 30 veces d) Cambiando el PBS repetir los pasos b y c. e) Lavar la placa haciéndole correr agua destilada y secarla cuidadosamente con papel secante. Dejarla sobre la plataforma de la cámara húmeda 9) Diluir el conjugado a su título de trabajo con PBS conteniendo 2% de Tween 80 y colocar 10 l de esta dilución en cada círculo 10) Repetir los pasos 7 y 8. 11) Inmediatamente, colocar una pequeña gota de líquido de montar en cada círculo y colocarles un cubre objetos. 12) Colocar la placa en una caja oscura y leerla dentro de las 4 horas. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 26
  28. 28. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - NOTA: Si la placa no será leída dentro de las 4 Hs desde la preparación, se la debe proteger de la luz y se guarda entre 2° y 8°C. 13) Leer con ocular de 10X y objetivos de 40X y 60X cada círculo con microscopio de fluorescencia. Lectura e informe de resultados 1) Usando el control mínimo reactivo (1+) de fluorescencia como el estándar de lectura, registrar la intensidad de fluorescencia de los treponemas como muestra la tabla 5. 2) Informar los resultados del ensayo de FTA-Abs como describe en la tabla 6. Si los controles no muestran los resultados, de acuerdo a la tabla 4, se debe repetir el ensayo. No informar los resultados de los sueros de los pacientes cuando los resultados obtenidos de los controles son insatisfactorios. Tabla 5: Registro de Intensidad de Fluorescencia Lectura Intensidad de fluorescencia 2+ hasta 4+ Moderada a intensa 1+ * Equivalente al control reactivo mínimo (1+) + a < 1+ Débil pero definida, menor que el control reactivo mínimo (1+) - Ninguna o vagamente visible Atípica † Variado: los treponemas aparecen como “apolillados” o como perlas de un collar sobre su longitud * Repetir las muestras de pacientes que inicialmente den una intensidad de fluorescencia 1+. † Fluorescencia atípica han sido descrita en pacientes con lupus u otra enfermedad autoinmune. Tabla 6: Sistema de Informe para FTA-Abs Lectura del ensayo inicial: Lectura de la repetición del ensayo Informe 4+ Reactiva 3+ Reactiva 2+ Reactiva 1+ >1+ Reactiva 1+ Reactiva mínimo* <1+ No reactivo <1+ No reactivo N No reactivo “apolillada”/perla de collar Fluorescencia atípica observada *Sin historia o evidencia clínica de infección por treponema, este resultado del ensayo sería considerado equívoco. Un segundo ensayo se realizará con una nueva muestra obtenida entre una y dos semanas mas tarde de la primera. Interpretación de los resultados: El ensayo de FTA-Abs no debe utilizarse como un procedimiento de tamizaje. Su mayor valor es distinguir un verdadero positivo de una prueba no treponémica (VDRL, USR, RPR, TRUST), de un resultado falso positivo. También permite establecer el diagnóstico de sífilis latente o tardía. Una prueba de FTA-Abs reactiva:  Confirma la reactividad de una prueba no treponémica utilizada como primera prueba para sífilis. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 27
  29. 29. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis -  Sugiere infección actual o pasada con treponemas patogénicos.  También puede apoyar el diagnóstico de sífilis tardía o latente tardía, en aquella pequeña proporción de casos donde las pruebas no treponémicas ya son negativas, pero se sospecha la infección por la presentación clínica o por una historia consecuente con sífilis. Un resultado no reactivo de FTA-Abs sugiere que un resultado reactivo de un ensayo no treponémico es una falsa reacción positiva. Consideraciones para el procedimiento del ensayo de FTA-Abs en LCR. Mientras que el ensayo de VDRL-LCR es la única prueba recomendada para detectar neurosífilis, la FTA-Abs LCR es altamente sensible y específica para detectar anticuerpos treponémicos. Un resultado no reactivo de una prueba de FTA-Abs LCR puede ser usado para descartar neurosífilis. Sin embargo, un resultado positivo de esta prueba es incierto, ya que puede indicar un remanente de anticuerpos provenientes de una infección de sífilis pasada y tratada adecuadamente o provocada por una mínima cantidad de suero reactivo que contamina el LCR. Procedimiento para FTA-ABS LCR Realizar este ensayo como está descrito bajo “Procedimiento” para FTA-Abs con la siguiente excepción: No calentar el LCR a 56°C antes del ensayo. Los controles son los mismos que se utilizan para el ensayo con sueros. Lectura e Informe de los resultados del ensayo FTA-ABS LCR Los resultados son leídos como están descritos para el ensayo de FTA-Abs en las tablas 5 y 6. Además, la siguiente aclaración deberá acompañar al informe: “El significado de una prueba reactiva de FTA-Abs en LCR es incierto. Las personas que fueron tratadas durante el período secundario o latente de sífilis y que no presentan signos de neurosífilis, pueden tener reactivo el ensayo FTA-Abs LCR. Un resultado no reactivo en el ensayo de FTA-Abs LCR, sugiere la ausencia de neurosífilis”. Titulación de Globulina antihumana marcada con fluoresceína (conjugado) La mayoría de los fabricantes indican en la etiqueta el título de trabajo del conjugado que fue determinado en condiciones de prueba y con el equipo de sus laboratorios. En vista de las condiciones y el equipo, varían de un laboratorio a otro, es necesario titular y comprobar un lote nuevo de conjugado con el microscopio provisto de iluminación fluorescente. 1) Preparar diluciones al doble del nuevo conjugado en PBS pH 7,2 conteniendo 2% de Tween 80 de manera tal que las diluciones incluyan el título sugerido por el fabricante. Ejemplos: i) 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 ii) 1:12,5, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 2) Ensayar cada dilución de conjugado con un control reactivo 4+ diluido 1:5 en PBS, y con un control mínimo reactivo 1+ siguiendo las indicaciones detalladas arriba. 3) Incluir un control de fluorescencia no específica con cada dilución de conjugado. 4) Simultaneamente preparar una dilución de trabajo del conjugado de referencia, con el cual se estaba teniendo resultados satisfactorios, para utilizarlo como control de los reactivos y las Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 28
  30. 30. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - condiciones del ensayo. Este conjugado se prueba con el control reactivo 4+ y 1+ y con los controles de fluorescencia inespecífica. 5) Leer los círculos de la placa del antígeno en el siguiente orden: a) Examinar los tres controles (4+, 1+ e inespecíficos) realizado con el conjugado de referencia para asegurar que los reactivos y las condiciones del ensayo sean satisfactorias. b) Examinar los círculos de la placa con el nuevo conjugado; comenzar con la menor dilución de conjugado. Registrar la lectura como 4+, 3+, 2+ ó 1+. c) El punto terminal de la titulación es la máxima dilución que permite obtener una lectura de 4+ con el suero control reactivo 4+ y una lectura menor a 1+ con el suero control 1+. El título de trabajo del nuevo conjugado es una dilución al doble por debajo del punto terminal y deberá ser el punto final del suero control 1+. En el ejemplo, la dilución seleccionada para el título de trabajo es 1:200 (ver tabla 7: Titulación del conjugado) d) El nuevo conjugado no debe tomar coloración inespecífica a tres diluciones al doble por debajo del título de trabajo del conjugado. Tabla 7: Titulación del conjugado Control de fluorescencia no específica (PBS) Control suero reactivo (4+) (1:5 en PBS) Control suero reactivo (1+) Dilución Conjugado de referencia (1:400) - 4+ 1+ Diluciones nuevo conjugado 1:12,5 <1+ 4+ 3+ 1:25 - 4+ 3+ 1:50 - 4+ 2+ 1:100 - 4+ 2+ 1:200 - 4+ 1+* 1:400 - 4+ <1+ 1:800 - 3+  *La dilución seleccionada para el título de trabajo es 1:200, una dilución al doble por debajo del punto terminal (1:400), 1+ con el suero control mínimo 1+, y ninguna fluorescencia inespecífica a tres diluciones al doble (1:25) por debajo del título de trabajo. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 29
  31. 31. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - ANEXO 1: PRINCIPIOS GENERALES DE SEGURIDAD Este capítulo es una versión abreviada de las recomendaciones de bioseguridad del Centro para el Control de Enfermedades y Prevención (Larsen S; Pope V; Jonson R; Kennedy E. 1998. A Manual of test for SYPHILIS) Manual de Bioseguridad Debe estar disponible un manual de bioseguridad, con instrucciones fáciles de entender e incluir la siguiente información:  Teléfonos de emergencia  Procedimientos de primeros auxilios  Manejo de inflamables y tóxicos cáusticos  Manejo y almacenamiento de gases comprimidos  Uso de decontaminantes y desinfectantes e información de bioseguridad. Precauciones generales: Debido a que el exámen médico o la historia clínica no permiten identificar de buena fuente si los pacientes están infectados con el virus del VIH u otros patógenos que afectan a la sangre, todo paciente debe ser considerado infeccioso. Se deben seguir las precauciones universales cuando un operador se expone a la sangre y otros fluidos corporales (líquido amniótico, peritoneal, pericárdico, pleural, cefalorraquídeo, sinovial, semen y secreción vaginal) u otro fluido visiblemente contaminado con sangre. Inmunización Todo trabajador involucrado en tareas que puede estar expuesto a sangre u otro fluido debe ser vacunado con la vacuna de la hepatitis B. Áreas del Laboratorio Limitar o restringir el acceso al laboratorio. En las entradas colocar el signo de peligro biológico. Diseñar el laboratorio de manera que se pueda limpiar fácilmente. Las mesadas deben ser impermeables a los derrames y resistentes a los solventes orgánicos, ácidos, álcalis y al calor moderado. Cada laboratorio debe tener una pileta para lavarse las manos y disponibilidad de un autoclave para decontaminar el material infeccioso. No se debe comer, beber, fumar, preparar alimentos, aplicar cosméticos o lentes de contacto en el área de trabajo. Almacenar los alimentos en heladeras o gabinetes preparados para este propósito localizados fuera del área de trabajo. Decontaminar las superficies con un apropiado germicida químico (dilución 1:10 de lavandina de 55 g/l de cloro libre) cuando se produce una salpicadura con sangre u otro fluido corporal y de manera rutinaria cuando se completa la tarea. Manos La frecuencia y el cuidadoso lavado de las manos es una de las mejores medidas de prevención enfermedades en el laboratorio. Deben lavarse las manos frecuentemente y con un efectivo detergente (jabón bactericida). Si se produjo una contaminación con fluidos inmediatamente lavarse las manos y otras superficies. Siempre lavarse las manos luego de sacarse los guantes y dejar el laboratorio, antes de comer, beber, fumar o usar el baño. No tocar elementos tales como el teléfono, picaportes, equipamiento de laboratorio y teclados de computadoras con las manos contaminadas. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 30
  32. 32. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Guantes (látex)* Usar guantes protectores todo el tiempo cuando se trabaja con sangre, muestras de fluidos corporales y tejidos; al extraer o manipular membranas de las mucosas de los pacientes, piel lastimada, lesiones o material de lesiones. Cuando los guantes están visiblemente contaminados, quitárselos cuidadosamente y descartarlos; inmediatamente lavarse las manos y colocarse guantes nuevos. Los guantes contaminados pueden ser una fuente de infección. Mientras se usan evitar tocarse la cara. Quitarse los guantes y lavarse las manos antes de tocar elementos como el teléfono o teclados de computadora. No se deben lavar los guantes o desinfectarlos para volverlos a usar. *El personal con dermatitis u otras lesiones sobre las manos, brazos, cuello, cara y aquellas personas que potencialmente puedan tocar material infeccioso, deberán cubrir las lesiones con un vendaje o con una vestimenta impermeable al agua. El personal con alergia al látex deberá usar guantes recomendados por su dermatólogo. Bajo ciertas circunstancias el personal puede estar temporalmente asignado a un área sin riesgo. Vestimenta de laboratorio Usar guardapolvo o uniforme de mangas largas cuando se trabaja con muestras. Los camisolines de manga larga y abertura trasera protegen mejor que los de abertura frontal y son preferibles en los laboratorios de microbiología y cuando se trabaja en una cabina de seguridad biológica (CSB). Los camisolines se pueden utilizar encima de los guardapolvos cuando se necesita mayor protección por el riesgo de derrame de sustancias químicas o material biológico como sangre. Los servicios de lavandería deben encontrarse en las instalaciones o cerca de ellas. Antes de abandonar el laboratorio tendrán que quitarse las prendas protectoras y lavarse las manos. Protectores faciales Usar barbijos y gafas o viseras que protegen todo el rostro cuando hay probabilidad que se generen salpicaduras y aerosoles. Por ejemplo cuando se destapa un tubo colector de sangre por vacío fuera de la CSB, usar protectores faciales. Cubrir la tapa con papel absorbente y suavemente remover la tapa del tubo. Luego descartar el papel en el recipiente de residuos biológicos. Cabinas de seguridad biológica No es necesario utilizar una cabina de seguridad biológica para los procedimientos de rutina tales como estudios histológicos y patológicos, o de rotación de las muestras en las pruebas no treponémicas Sin embargo se deben utilizar CSB (Clase I o II) cuando exista la potencial formación de salpicaduras y aerosoles o cuando concentraciones altas de agentes infecciosos están presentes. Esto incluye actividades tales como, sonicado, vortexeado y otras agitaciones vigorosas. Limpiar y desinfectar la cabina luego de cada uso. Centrífugas Los aerosoles producidos durante la centrifugación pueden contribuir a la extensión de algunas enfermedades infecciosas Las centrífugas se utilizaran de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los tubos y los recipientes de muestras deben estar bien cerrados (con tapa a rosca si es posible) para la centrifugación. Operar la centrífuga con la tapa cerrada y no abrirla hasta que el rotor no se haya detenido. Si es posible localizarla alejada de otras áreas del laboratorio. Posicionar el extractor de aire de la centrífuga en dirección contraria a la del personal del laboratorio. Limpiar la centrífuga diariamente y cuando una contaminación se produjo, con una solución germicida de 1:10 de lavandina de 55g/l de cloro libre. El mayor peligro es cuando se rompen tubos dentro de la centrífuga. Retirar los tubos que no estén rotos y desinfectarlos externamente. Empapar los cestillos con un desinfectante y luego retirarlos y sumergirlos en la solución desinfectante. Desinfectar el interior de la centrífuga. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 31
  33. 33. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Otros equipamientos de laboratorio Antes de enviar a reparar el equipamiento, tales como freezers, centrífugas, planos móviles, desinfectarlos con germicida químico. Algunos instrumentos deberán ser desinfectados con un detergente desinfectante en vez de un desinfectante químico o autoclave. Agujas e instrumental corto punzante Se deben tomar precauciones para prevenir injurias causadas por agujas, escalpelos y otro instrumental corto punzante. Para prevenir inoculación accidental con agujas no se deben volver a cubrirse, ni sacarlas con la mano de la jeringa, ni doblarlas o romperlas. Una vez que haya sido utilizada, descartarla en un recipiente resistente al material punzante. El descartador debe estar ubicado tan cerca como haga falta. Informar inmediatamente al supervisor cuando ocurra un pinchazo con aguja u otro tipo de injuria. Material de Vidrio Descontaminar preferentemente en un autoclave el material de vidrio contaminado o sospechoso de estarlo, antes de lavarlo, descartarlo o reciclarlo. El material que se junta para autoclavar se debe depositar sumergido en un desinfectante. El material de vidrio roto o resquebrajado se debe descartar. No manipular material de vidrio roto con la mano desnuda. Colocar el material roto en un descartador resistente y si estaba contaminado, autoclavarlo antes de descartarlo. Pipetas No se debe pipetear con la boca. Utilizar propipetas para pipetear todos los reactivos, muestras y otros líquidos de laboratorio. Después de utilizarlas, cuidadosamente colocarlas en un pipetero horizontal conteniendo solución desinfectante. Los aerosoles pueden producirse cuando se colocan las pipetas en el pipetero vertical. Esterilización, descontaminación y desinfección Se procede de acuerdo a los procedimientos estandarizados de esterilización y desinfección utilizados en hospitales y en los laboratorios de microbiología. Descontaminación de derrames Recomendaciones para descontaminar derrames y salpicaduras de sangre, fluidos corporales u otro material infeccioso. 1. Usar guantes y delantal. Son recomendados los guantes resistentes a los instrumentos corto punzantes, como los utilizados para lavar la vajilla. Si el derrame contiene vidrios rotos, estos deberán ser removidos sin tocarlos con la mano. Una caja rígida de cartón será utilizada para colocarlos, y luego descartarlos en un contenedor apropiado de residuos biológico. 2. Absorción de derrames* Ya que la mayoría de los desinfectantes son menos activos o ineficaces cuando existe alta concentración de proteínas (como en sangre y suero), la mayor cantidad del líquido derramado deberá ser absorbido con toallas de papel antes de la desinfección. *Con grandes derrames de cultivos o de agentes infecciosos concentrados. El área deberá ser cubierta con abundante solución líquida germicida antes de la desinfección. El objetivo es diluir el material derramado, lisar los glóbulos rojos y remover las proteínas del área contaminada. Desinfectar el sitio del derrame usando un desinfectante con lavandina diluida al 10% (partiendo de lavandina 55 g/l de Cl libre). Mojar el sitio o empaparlo con toallas de papel embebidas en desinfectantes. El tiempo de acción del desinfectante será el recomendado por el fabricante. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 32
  34. 34. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - 3. Absorber la solución desinfectante con material absorbente o alternativamente, permitir que el desinfectante se seque. 4. Enjuagar el sitio con agua. 5. Colocar todo el material descartable, utilizado para descontaminar el sitio. Limpieza en un contenedor de residuos biológicos. Manejar el material de la misma manera como otros desechos infecciosos. Limpieza general de paredes y pisos Las superficies tales como las paredes y pisos deberán ser limpiadas rutinariamente. Además un programa de control de insectos y roedores deberá llevarse a cabo, incluyendo una revisión de las ventanas que abren al exterior. Desechos infecciosos Tomar especial precaución con los desechos provenientes del laboratorio de microbiología, los desechos de patología y las muestras de sangre o productos sanguíneos. Aunque cualquier elemento que haya estado en contacto con sangre, exudados o secreciones puede ser potencialmente infeccioso, no son necesariamente considerados desechos infecciosos. Los desechos infecciosos, en general deberán se incinerados o autoclavados antes de descartarlos. Cada laboratorio deberá redactar los procedimientos a seguir según la normativa de cada hospital con respecto al descarte de material infeccioso. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 33
  35. 35. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - ANEXO 2: TOMA DE MUESTRA DE SANGRE Y LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO Extracción de sangre El suero es la muestra de elección para la mayoría de las pruebas para sífilis. El plasma como muestra, no puede utilizarse en los ensayos que se requiere calentar la muestra (FTA- Abs, VDRL) y su uso no ha sido evaluado en la prueba de microhemoaglutinación para anticuerpos de T. pallidum (MHA-TP). El plasma puede ser utilizado en la prueba RPR pero solo está limitado a los laboratorios especializados, tales como bancos de sangre, y en situaciones donde no se puede conseguir suero. El plasma debe ser utilizado solamente en pruebas cualitativas. Equipamiento 1. Aguja descartable estéril de calibre 18 a 21 G (Gauge) para adultos o 21 a 23 G para niños. 2. Jeringa y tubos de plástico sin anticoagulante 3. Torniquete 4. Alcohol 70% y gasa 5. Gasa seca y cinta adhesiva 6. Guantes de látex, guardapolvo y protectores faciales de bio-seguridad 7. Gradilla de tubos de ensayo 8. Descartador de agujas y de residuos biológicos 9. Solución de lavandina (55 g/l Cl libre) diluída al 1:10 en agua. Sangre venosa 1. Rotular el tubo de recolección para identificar la muestra. 2. El paciente deberá sentarse y apoyar el antebrazo en el apoya brazos. Cerrará la mano en forma de puño para que las venas sean más prominentes. 3. Las venas mayores superficiales del antebrazo son las más frecuentemente utilizadas. 4. Palpar la trayectoria de la vena con el dedo índice. 5. Limpiar el área de venipunción con una gasa embebida en alcohol y dejar que se seque la zona. 6. Aplicar un torniquete entre 7 y 9 centímetros del sitio de punción, procurando que la éstasis venosa sea mínima. 7. Ensamblar la aguja a la jeringa y sacarle el capuchón 8. Agarrar firmemente con el pulgar, a 3 - 5 cm por debajo de la zona de punción para mantener tensa la piel. 9. Con el bisel hacia arriba, realizar la punción. Sacar el torniquete tan rápido fluya la sangre. Llenar la jeringa a una velocidad del flujo sanguíneo de 0,5 ml por segundo, desplazando el émbolo hacia fuera. 10. Indicar al paciente que abra la mano, colocar una gasa seca sobre el sitio de punción, aplicar una suave presión sobre la gasa y lentamente retirar la aguja. 11. Indicarle al paciente que se sostenga la gasa con la otra mano. 12. Sacar la aguja con el descartador de aguja (no recolocar el capuchón). 13. Traspasar la sangre apoyando el pico de la jeringa sobre la pared del tubo para que escurra. La velocidad debe ser similar a la de extracción. Debe evitarse la formación de espuma. 14. Descartar la jeringa y colocar el tubo en la gradilla. 15. Regresar al paciente, presionar suavemente la gasa y colocar una cinta adhesiva. 16. Indicar al paciente que permanezca con el vendaje al menos 15 minutos. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 34
  36. 36. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Sangre de cordón umbilical: consideraciones Cuando la madre tiene serología reactiva, la mejor muestra para los neonatos es el suero obtenido por punción del talón del bebé. Sin embargo la sangre de cordón puede ser usada para tamizaje de base cuando no se dispone de otra muestra. La sangre de cordón se contamina fácilmente con la jalea de Wharton, lo cual causa falsos positivos en los ensayos no treponémicos, por lo tanto el laboratorio deberá aceptar solamente las muestras que han sido recolectadas apropiadamente. La serología realizada con una muestra de sangre de cordón no puede ser usada en lugar de la serología sobre sangre venosa de la madre. Equipamiento adicional 1. Pinzas (Clamps) 2. Tubos con abertura superior a los 25 mm y tapa. Procedimiento 1. Usar guantes, guardapolvo y protectores faciales de seguridad. 2. Limpiar superficialmente el cordón umbilical hacer un doble pinzado y un corte. 3. Recolectar la sangre de manera que no corra fuera del tubo. 4. Si es necesario, descontaminar la superficie exterior del tubo con desinfectante y cerrar el tubo. 5. Colocar el tubo en la gradilla. Procesamiento de la sangre Equipamiento 1. Centrífuga con o sin refrigeración (cuando se usa una refrigerada colocar la temperatura a 20°- 25°C.) 2. Tubos, tapas para tubos y gradilla (si se derivara la muestra, utilizar de preferencia tubos con tapa a rosca). 3. Guantes de latex, guardapolvo y gafas protectoras. 4. Pipetas y propipetas. 5. Etiquetas adhesivas (son preferibles etiquetas numeradas que puedan ser transferidas del tubo con la muestra al tubo receptor del suero). 6. Descartador de residuos biológicos. 7. Pipetero. Suero 1. Luego de la extracción de sangre, dejar el tubo en posición vertical durante 20-30 minutos como mínimo a temperatura ambiente (23° a 29°C) para que se forme el coágulo. 2. Cuando se haya formado, en lo posible centrifugar la muestra dentro de los 60 minutos posteriores a la extracción a 1000-1200 g por 10 ± 5 minutos. Si la centrífuga está equipada con portatubos con tapa de seguridad se deben utilizar. 3. Si un tubo se rompe durante la centrifugación, retirar los tubos que no estén rotos con un papel empapado de desinfectante y desinfectarlos externamente. Empapar los portatubos con un desinfectante, retirarlos y sumergirlos en la solución desinfectante. No intentar remover los tubos rotos del interior de los portatubos hasta que no hayan sido sumergidos al menos por 10 minutos en solución de lavandina 1:10. Desinfectar el interior de la centrífuga. 4. Al finalizar la centrifugación si se está trabajando en una cabina de seguridad biológica (CSB), clase I o II, destapar el tubo. Si se esta trabajando en un lugar del laboratorio fuera de la CSB, Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 35
  37. 37. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - usar gafas protectoras y cubrir la tapa con papel absorbente y suavemente abrir el tubo. Luego descartar el papel y la tapa. 5. Pipetear y transferir el suero libre de células a un tubo rotulado, cerrar el tubo. No pipetear con la boca. Si el tubo se encuentra contaminado superficialmente, limpiarlo con solución de lavandina diluída 1:10. 6. Descartar el tubo conteniendo el coágulo. 7. Como medida de precaución, las muestras de suero pueden ser calentadas 20 minutos a 56°C en un baño de agua sin que esto afecte los resultados de las pruebas de sífilis. Calentar pequeños volúmenes de suero reduce la infectividad del HIV a niveles menores de los detectables. La modalidad de calentar el suero no debe alterar o remplazar la adherencia a las precauciones universales. El calentamiento del suero puede descartar su uso para realizarle las pruebas de detección de anticuerpos HIV-1 (verificar las indicaciones del fabricante del ensayo) 8. Mientras se calientan los sueros, rotular los tubos de transferencia. Los sueros deben estar a temperatura ambiente antes del calentamiento y de realizarles las pruebas (10-30 minutos). 9. Conservar los sueros refrigerados (2°-8°), si se demorara más de 4 horas en realizarles las pruebas. Si se realizará mas allá de los 5 días, congelarlos a -20°C. Evitar repetidas congeladas y descongelados de los sueros. Plasma El procesamiento y manejo del plasma es idéntico al del suero pero con las siguientes excepciones: 1. El plasma puede ser retenido en el tubo de recolección si la prueba se realizara inmediatamente. De otro modo, el plasma deberá ser removido de los elementos celulares. Las muestras recolectadas con anticoagulante pueden ser centrifugadas a los pocos minutos de ser recolectada. 2. El plasma debe ser usado dentro de las 48 hs. 3. Guardar el plasma refrigerado (2°-8°C) si la demora es superior a 4 hs para hacerles las pruebas. Las muestras de plasma deberán estar entre 23 y 29 °C en el momento del ensayo. 4. Las muestras de plasma no deben ser calentadas. Criterio de aceptación de muestras de suero y plasma 1. Para que una muestra sea aceptada no deberá contener partículas que interfieran en la lectura de los resultados 2. Las muestras excesivamente hemolizadas, contaminadas con bacterias, quilosas o turbias, son inadecuadas para los ensayos. Una muestra está demasiado contaminada cuando al colocar un papel impreso por detrás del tubo, no se puede leer a través de él. No todas las muestras inadecuadas deberán ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicárselo al médico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden médica, entonces deberá ser informada la condición de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretación de los resultados. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 36
  38. 38. - Manual de Técnicas y Procedimientos para el Diagnóstico de Sífilis - Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” 37 Recolección de LCR La punción lumbar será realizada únicamente por personal médico calificado. Ciertos riesgos son asociados con la punción lumbar, incluyendo con poca frecuencia, complicaciones serias como infección y dolor persistente; más comúnmente dolor de cabeza transitorio y parestesia. La punción lumbar debe ser contraindicada en pacientes con presión intracraneal incrementada o déficit en la coagulación debido al riesgo incrementado de hernia cerebral o sangrado local, respectivamente. La prueba Venereal Disease Research Laboratory -(VDRL) LCR– es el único ensayo serológico estandarizado para LCR. Equipamiento 1. Agujas (el uso de 20 G o menor puede reducir la frecuencia de dolor de cabeza) 2. Estilete 3. Tres tubos y gradilla 4. Tintura de yodo al 2% 5. Gasa y cinta adhesiva 6. Guantes de látex , guardapolvo y protectores faciales de seguridad 7. Descartadores de aguja y de residuos biológicos Procedimiento 1. Mantener el paciente en forma de “ovillo” recostado de un lado, sobre una superficie firme con la espalda en el borde de la mesa. La espalda deberá estar en plano vertical con respecto a la superficie de la mesa. 2. Desinfectar el sitio con tintura de yodo al 2% 3. Insertar la aguja con el estilete en L3-L4 ó mas abajo para los adultos. En niños pequeños el cono medular se extiende mas abajo que en los adultos; insertar la aguja con estilete en L4-L5 o mas abajo. 4. Una vez alcanzado el espacio subaracnoide, remover el estilete. 5. Recolectar 1-2ml de fluído en cada uno de de los tres tubos 6. Para reducir el riesgo de dolor de cabeza, el paciente deberá permanecer en posición decúbito ventral varias horas después de la punción lumbar. Procesamiento del LCR 1. Realizar la determinación de proteínas de acuerdo al procedimiento estándar. 2. Recuento celular: deberá ser hecho dentro de las 2hs de la punción lumbar. 3. Centrifugar a 1000-1200 x g por 10  5 minutos y transferir a un tubo limpio y rotulado. 4. Si se demorara más de 4 horas en realizar las pruebas, conservar los LCRs refrigerados (2°-8°). Si se realizaran mas allá de los 5 días, congelarlos a  -20°C. Evitar congelados y descongelados repetidos de los LCRs. 5. Las muestras deberán estar a temperatura ambiente, entre 23° a 29°C en el momento de la prueba. 6. No calentar el LCR antes del ensayo Criterio de aceptación de muestras de LCR 1. Para que una muestra de LCR sea aceptada no deberá contener partículas que interfieran en la lectura de los resultados. 2. Para la prueba de VDRL-LCR, son adecuadas las muestras de LCR con trazas de sangre ( > 0,8 µL de sangre /1ml de LCR), en cambio son inadecuadas para los otros ensayos. Son inadecuadas para la VDRL-LCR las muestras ligeramente rojas (rosa) (> 3 µL de sangre /1ml de LCR) 3. No todas las muestras inadecuadas deberán ser descartadas o no analizadas. Cuando una muestra insatisfactoria es recibida, comunicárselo al médico solicitante y discutir si es apropiado realizarle las pruebas. Si se decide realizarlas por orden médica, entonces deberá informarse la condición de la misma y las indicaciones sobre las limitaciones en la interpretación de los resultados.

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