Tema1

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Tema1

  1. 1. Tema 1. Nociones esenciales de Genética you can never have too many mutants La Genética aplicada a la investigación de los fenómenos biológicos. Utilidad de los mutantes en la elucidación de problemas biológicos
  2. 2. Qué es la Genética El uso de mutaciones y análisis mutacional para estudiar un proceso biológico y el estudio del proceso hereditario Hawley y Walker, 2003
  3. 3. La Genética hoy en día <ul><li>¿Para qué molestarnos en hacer Genética? </li></ul><ul><li>¿Qué podemos obtener del aislamiento e identificación de mutantes que no podamos aprender haciendo “-ómicas”? </li></ul><ul><li>La base de la Genética es la mutación </li></ul>
  4. 4. Hacer Genética: más que obtener mutantes <ul><li>Maximizar la probabilidad de resolver las preguntas iniciales </li></ul><ul><li>Proveer de tantas nuevas perspectivas biológicas como sea posible </li></ul><ul><li>Facilitar una mayor comprensión de la estructura y función del genoma en estudio </li></ul><ul><li>Comprender qué tipos de mutaciones se pueden obtener y cómo, y cómo analizarlas </li></ul>Aislamiento y caracterización de mutantes para: P.e. análisis de mutantes supresores
  5. 5. Hacer Genética <ul><li>Herramientas intelectuales básicas: </li></ul><ul><ul><li>Mutación </li></ul></ul><ul><ul><li>Complementación </li></ul></ul><ul><ul><li>Supresión </li></ul></ul><ul><ul><li>Recombinación </li></ul></ul><ul><ul><li>Regulación (epistasia) </li></ul></ul>
  6. 6. Mutación <ul><li>Muller (1932) </li></ul><ul><ul><li>Nulomorfos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sin función génica </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Hipomorfos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Algún grado de función génica, alelo “débil”. Frente a deleciones, se diferencia de los nulomorfos </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Hipermorfos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Producto hiperactivo o exceso de producto génico </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Antimorfos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Antagoniza, o envenena, el alelo silvestre </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Neomorfos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Aparición de función en otro lugar. Ganancia de función. </li></ul></ul></ul>
  7. 7. Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación amórfica (nula) Fenotipo mutante Pérdida de actividad génica en M coincide con la deleción de una copia del alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de actividad génica en M compensada por duplicación
  8. 8. Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación hipomórfica (rezumante) Fenotipo mutante Pérdida de actividad génica en M menos severa que la deleción del alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de actividad génica en M compensada por duplicación
  9. 9. Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Ganancia de función: mutación hipermórfica Fenotipo mutante Ganancia de actividad génica en M parcialmente compensada con la deleción Fenotipo mutante Ganancia de actividad génica en M más severa por duplicación
  10. 10. Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Ganancia de función: mutación neomórfica Nuevo fenotipo mutante Nueva actividad génica codificada por M insensible a la dosis génica del gen silvestre: siempre fenotipo M
  11. 11. Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación antimórfica, dominante negativa Fenotipo mutante La actividad génica codificada por M inactiva la actividad génica del silvestre, ofreciendo un fenotipo similar a un nulomorfo o un hipomorfo fuerte
  12. 12. Terminología moderna de los mutantes <ul><li>Pérdida de función: mutantes que reducen el nivel de expresión de un producto génico </li></ul><ul><ul><li>Nulos : pérdida de función completa </li></ul></ul><ul><ul><li>Pérdida de función parcial </li></ul></ul><ul><ul><li>Pérdida de función condicional : </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Termosensibles u otros condicionales </li></ul></ul></ul><ul><li>Dominante negativo : antimorfo </li></ul><ul><li>Ganancia de función : </li></ul><ul><ul><li>Expresión inapropiada durante el desarrollo </li></ul></ul><ul><ul><li>Producto regulado de forma inapropiada </li></ul></ul><ul><ul><li>Mutantes heterocrónicos : expresan genes en el momento incorrecto </li></ul></ul>
  13. 13. Terminología a nivel molecular <ul><li>Sustituciones de pares de bases </li></ul><ul><li>Inserciones </li></ul><ul><li>Deleciones </li></ul><ul><li>Relacionadas con traducción: </li></ul><ul><ul><li>Cambios de sentido ( missense ) </li></ul></ul><ul><ul><li>Sin sentido ( nonsense ) </li></ul></ul><ul><ul><li>Sustituciones silencionas ( silent ) </li></ul></ul><ul><ul><li>Cambio de fase ( frameshift ) </li></ul></ul>
  14. 14. Búsqueda de mutantes:¿por y para qué? <ul><li>Identificar genes requeridos en un proceso biológico </li></ul><ul><ul><li>Vuelo, meiosis, ciclo celular… </li></ul></ul><ul><li>Aislar más mutaciones en un gen de interés </li></ul><ul><ul><li>Muchos alelos de un gen de interés </li></ul></ul><ul><ul><li>Marcadores moleculares </li></ul></ul><ul><li>Herramientas mutacionales para análisis estructura-función </li></ul><ul><li>Aislar mutaciones en un gen identificado por aproximaciones moleculares (g. inversa) </li></ul>
  15. 15. Mutagénesis <ul><li>Radiaciones ionizantes </li></ul><ul><ul><li>Rayos X,  </li></ul></ul><ul><li>Mutágenos químicos </li></ul><ul><ul><li>Muy eficiente </li></ul></ul><ul><li>Elementos transponibles </li></ul><ul><ul><li>Trazabilidad </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Pérdida de función </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Disrupción secuencia codificante </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Disrupción secuencia reguladora </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Bloqueo de potenciador de promotores </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>Disrupción de secuencias de procesamiento o terminación </li></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Transposones diseñados para ganancia de función </li></ul></ul></ul><ul><li>Disrupción génica dirigida </li></ul><ul><ul><li>KO (knock out) génico </li></ul></ul>
  16. 16. Complementación <ul><li>Gran número de mutantes </li></ul><ul><ul><li>“ Nunca se pueden tener demasiados mutantes” J. Roth </li></ul></ul><ul><li>¿Cuántos genes diferentes están representados en los mutantes aislados? </li></ul><ul><li>Prueba de complementación </li></ul>
  17. 17. Complementación en haploides (ej. S. cerevisiae, E. coli ) <ul><li>Dos estirpes haploides mutantes, de distinto tipo sexual, E1 y E2, con el mismo fenotipo. Genotipos m1 y m2. </li></ul><ul><li>Formación de diploide entre las dos estirpes. Si su fenotipo es: </li></ul><ul><li>MUTANTE </li></ul><ul><li>Las mutaciones están en el mismo gen </li></ul><ul><li>Genotipo: m1/m2 </li></ul><ul><li>El defecto de una estirpe no es complementado por la otra </li></ul><ul><li>Son dos alelos mutantes del mismo gen </li></ul><ul><li>No hay complementación </li></ul>m2 m1 <ul><li>SILVESTRE </li></ul><ul><li>Las mutaciones están en distinto gen </li></ul><ul><li>Genotipo: m1 + /+ m2 </li></ul><ul><li>El defecto de una estirpe es complementado por la otra </li></ul><ul><li>Son dos alelos mutantes del genes distintos, m1 y m2 </li></ul><ul><li>Hay complementación </li></ul>+ m2 m1 +
  18. 18. Complementación en diploides (ej. Drosophila, Arabidopsis ) <ul><li>Dos estirpes mutantes homozigotas de distinto sexo, hermafroditas o monoicas, E1 y E2, con el mismo fenotipo. Genotipos m1/m1 y m2/m2. </li></ul><ul><li>Formación de gametos. Cruzamiento entre las estirpes. </li></ul><ul><li>Observación de la descendencia. Si su fenotipo es: </li></ul><ul><li>MUTANTE </li></ul><ul><li>Las mutaciones están en el mismo gen </li></ul><ul><li>Genotipo: m1/m2 </li></ul><ul><li>Gametos m1 y gametos m2 </li></ul><ul><li>El defecto de una estirpe no es complementado por la otra </li></ul><ul><li>Son dos alelos mutantes del mismo gen </li></ul><ul><li>No hay complementación </li></ul>m2 m1 <ul><li>SILVESTRE </li></ul><ul><li>Las mutaciones están en distinto gen </li></ul><ul><li>Genotipo: m1 + /+ m2 </li></ul><ul><li>Gametos m1 + y gametos + m2 </li></ul><ul><li>El defecto de una estirpe es complementado por la otra </li></ul><ul><li>Son dos alelos mutantes del genes distintos, m1 y m2 </li></ul><ul><li>Hay complementación </li></ul>+ m2 m1 +
  19. 19. Reglas de la prueba de complementación <ul><li>Sólo puede realizarse cuando los dos mutantes son recesivos </li></ul><ul><li>No requiere que los mutantes tengan exactamente el mismo fenotipo </li></ul><ul><li>Hay casos en los que un doble heterozigoto tiene un fenotipo más extremo que cualquiera de los homozigotos: complementación negativa (  alelos letales sintéticos) </li></ul>
  20. 20. ¿Cuándo miente la prueba de complementación? <ul><li>Cuando hay complementación, y las mutaciones están en el mismo gen </li></ul><ul><li>Complementación intragénica </li></ul><ul><li>Cuando no hay complementación, y las mutaciones están en distinto gen </li></ul><ul><li>Ausencia de complementación no alélica, no complementación de un segundo sitio (SSNC) </li></ul><ul><ul><li>Tipo I: interacciones venenosas </li></ul></ul><ul><ul><li>TipoII: secuestro </li></ul></ul><ul><ul><li>Tipo III: haploinsuficiencia combinada </li></ul></ul>
  21. 21. Complementación intragénica <ul><li>Proteínas con distintos dominios con papeles bien diferenciados: se requiere la presencia de al menos uno delos dominios funcionales </li></ul><ul><li>Proteínas homomultiméricas </li></ul><ul><li>Otros casos </li></ul>A + A + A 1 A 1 A 2 Silvestre Mutantes A 2 Silvestre Silvestre Mutante Mutante
  22. 22. SSNC tipo I: “envenenamiento” <ul><li> - y  -tubulina de Saccharomyces </li></ul><ul><li>Dos alelos mutantes de cada gen, que no producen subunidad funcional A B m y A m B: letales </li></ul><ul><li>La prueba de complementación A B m /A m B da negativo (no complementación) porque producen una subunidad venenosa (sigue siendo letal) </li></ul><ul><li>La interacción es específica de ambos alelos </li></ul>A + B + Subunidad funcional A m B m Mutantes que no se ensamblan con las proteínas silvestres Subunidad venenosa
  23. 23. SSNC tipo II: “secuestro” <ul><li> - y  -tubulina de Drosophila </li></ul><ul><li>Dos alelos mutantes de cada gen, A 1 y B 1 , recesivos </li></ul><ul><li>La prueba de complementación A B 1 /A 1 B da negativo (no complementación) </li></ul><ul><li>La interacción es específica de uno de los alelos (A 1 ) </li></ul>1/4 subunidades funcionales 3/4 subunidades no funcionales Estéril A + B 1 / A 1 B + A + B - / A - B + 1/2 funcionales Fértil A + B - / A 1 B + 1/2 no funcionales 1/4 subunidades funcionales Estéril A + B + A 1 B 1 A 1 B + B 1 A + A + B + A - B - A + B + A 1 B - A 1 B + B - A +
  24. 24. SSNC tipo III: haploinsuficiencia combinada <ul><li>No es necesaria la interacción física entre proteína </li></ul><ul><li>Reducir la dosis de un alelo no produce fenotipo, a no ser que se reduzca la dosis del alelo del otro gen </li></ul><ul><li>Más común y la menos interesante </li></ul><ul><li>La interacción no es específica de ninguno de los alelos </li></ul>Letal A + B - / A - B + A + B + / A - B + Viable A + B - / A + B + Viable
  25. 25. Complementación negativa <ul><li>Mutaciones letales sintéticas : dos alelos mutantes de genes distintos que son letales juntos en la misma estirpe </li></ul><ul><li>Dos motivos </li></ul><ul><ul><li>Acción de cada gen en una ruta redundante o de acción similar </li></ul></ul><ul><ul><li>Productos génicos que interaccionan físicamente </li></ul></ul>A + B + A - B + A + B - A - B - Silvestre Pérdida parcial de función Nulo (letal) Función (p.e. actividad)
  26. 26. Genética a partir de mutantes <ul><li>¿Cuál es el siguiente paso una vez identificados mutantes en una serie de genes? </li></ul><ul><ul><li>Mapeo genético </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Identificación de SSNC </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Análisis de reversión y supresión </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Supresión de sintéticos letales </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Clonación y análisis molecular </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Análisis de expresión </li></ul></ul></ul>
  27. 27. Reversión/supresión <ul><li>Obtener estirpes de fenotipo silvestre a partir de mutantes, mediante una nueva mutación </li></ul><ul><ul><li>Reversión verdadera: restauración del genotipo (ADN) silvestre </li></ul></ul><ul><ul><li>Reversión mismo sitio (pseudoreversión) </li></ul></ul><ul><ul><li>Reversión segundo sitio (supresión intragénica) </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Una segunda mutación en el mismo que no cambia la mutación original </li></ul></ul></ul><ul><li>Reversión: reservado para mutaciones en el mismo gen </li></ul>
  28. 28. Reversiones I Proteína silvestre Mutagénesis Proteína mutante inactiva Reversión: tres revertientes activos si los aminoácidos tienen carga opuesta Proteína silvestre Silvestre Reversión mismo sitio (pseudoreversión) Reversión segundo sitio (mutación compensatoria)
  29. 29. Reversiones II Proteína silvestre Mutagénesis Mutante inactivo Reversión Segundo stio (compensatoria Proteína activa: se restaura por condiciones estéricas Mutagénesis: adición de una base Reversión segundo sitio: deleción de una base
  30. 30. Supresión intragénica <ul><li>Pseudoreversión (reversión mismo sitio) </li></ul><ul><li>Mutación compensatoria (reversión segundo sitio) </li></ul><ul><li>Supresión traduccional </li></ul>Silvestre GGA (glicina) Mutante UGA (fin mensaje) Pseudo. AGA (arginina) UUA (leucina) UGC (tirptófano) Silvestre ACG GTC AGC AAC Mutante ACG GAT C AG C AA C Supres. ACG GAT CAG AAC
  31. 31. Supresión (extragénica) <ul><li>Una mutación en un gen suprime el efecto de una mutación en otro gen </li></ul><ul><ul><li>Transcripcional (ARN) </li></ul></ul><ul><ul><li>Traduccional </li></ul></ul><ul><ul><li>Modificación postraduccional </li></ul></ul><ul><ul><li>Interacción proteína-proteína </li></ul></ul><ul><ul><li>Sin interacción física </li></ul></ul>
  32. 32. Supresión transcripcional (ARN) <ul><li>Transposon gypsy de Drosophila impide la acción de potenciadores a través de la proteína SuHu </li></ul><ul><ul><li>Mutaciones en SuHu restauran la función del potenciador </li></ul></ul><ul><li>Estabilización mensajero en C. elegans </li></ul><ul><ul><li>Mutaciones de fin de mensaje, bajo nivel de lectura por error </li></ul></ul><ul><ul><li>Mutación que aumenta la estabilidad del mensajero, expresan con cierto nivel la proteína </li></ul></ul>Potenciador gypsy Gen SuHu SuHu + SuHu - Lectura por error del codón de terminación Nivel de proteína silvestre
  33. 33. Supresión traduccional <ul><li>ARNt supresores </li></ul><ul><ul><li>Mutación en el ARNt que suprime un fin de mensaje </li></ul></ul><ul><ul><li>Cambio de fase:anticodón de 4 bases </li></ul></ul><ul><ul><li>Aumento de número de copias de ARNt que se “equivoca” con mayor frecuencia </li></ul></ul><ul><ul><li>ARNt son redundantes: redundancia numérica y funcional. Usados en E. coli, S. cerevisiae, C. elegans </li></ul></ul><ul><li>Proteínas ribosómicas, factores de traducción, ARNr supresores. </li></ul><ul><ul><li>Fidelidad de la traducción </li></ul></ul>Silvestre ACG GTC AAG AAC Mutante ACG GAT U AG AAC Supres. ACG GAT U AG AAC Mutante ACG GAT A C A GAA C Supres. ACG GAT A C AG AAC UUC A UC STOP AGC GUU A C UC Fin mensaje Cambio fase
  34. 34. Supresión en proteínas <ul><li>Modificación postraduccional </li></ul><ul><ul><li>Fosforilación. Superproducción de quinasas que restauran los niveles de fosforilación de los mutantes </li></ul></ul><ul><li>Interacción proteína-proteína </li></ul><ul><ul><li>Ej.: Ciertos supresores de mutantes termosensibles de P22 eran de por sí criosensibles </li></ul></ul><ul><ul><li>Supresor conformacional: FliG y MotA, flagelo de E. coli </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Llave--cerradura </li></ul></ul></ul>- - - + + Arg Glu Asp Asp Arg FliG MotA + - - + + Lys Movimiento: 1 Movimiento: 0.23 - - - + - Glu Movimiento: 0 + - - + - Glu Movimiento: 0.77 Lys
  35. 35. Supresión sin interacción física <ul><li>Supresión de mutaciones anti- o neomórficas </li></ul><ul><li>Supresión “bypass”: </li></ul><ul><ul><li>La segunda mutación permite sobrellevar el defecto causado por la primera mutación </li></ul></ul><ul><li>Contrabalanceo de actividades opuestas </li></ul><ul><li>Supresión multicopia </li></ul>A B C D F A E G
  36. 36. Diseño de búsqueda de supresores <ul><li>Elección del mutante a suprimir </li></ul><ul><ul><li>Fin de mensaje </li></ul></ul><ul><ul><li>Cambio de sentido </li></ul></ul><ul><ul><li>Pérdida de función </li></ul></ul><ul><li>Elección del mutágeno </li></ul><ul><ul><li>Químico </li></ul></ul><ul><ul><li>Transposón </li></ul></ul><ul><li>¿Qué estamos buscando? </li></ul><ul><ul><li>¿Qué proteínas interaccionan con otra? </li></ul></ul><ul><ul><li>¿Cómo puede la célula o el organismo sobrellevar nuestra mutación? </li></ul></ul>
  37. 37. Epistasia: ordenar la función de los genes <ul><li>Dos mutantes que reducen 50% la duración de la vida de Drosophila </li></ul><ul><ul><li>Misma o diferente ruta </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Si A - A - /B - B - tiene un 50% de duración de la vida, actúan en la misma ruta </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Si actúan en la misma ruta, ¿cuál actúa primero? </li></ul></ul>50% duración vida 50% duración vida duración vida normal A B 50% duración vida (A B) Otras influencias duración vida normal
  38. 38. Ordenar función de genes <ul><li>Ruta biosintética: mutantes pérdida de función </li></ul><ul><ul><li>Mutantes posteriores en la ruta son epistáticos sobre los anteriores </li></ul></ul><ul><ul><li>Mutantes nulos en genes diferentes que no muetran epistasia no pueden estar en la misma ruta </li></ul></ul><ul><li>Rutas no biosintéticas </li></ul><ul><ul><li>Recombinación meiótica en Drosophila </li></ul></ul>A B C D E 1 2 3 4 Mutante 3 es epistático sobre 1 y 2 mei-9 mei-218 10% recombinación 10% recombinación mei-9/me218 10% recombinación Dos rutas recombinación mei-9/me218 1% recombinación Una ruta recombinación
  39. 39. Análisis de epistasia: conjugación en S. cerevisiae <ul><li>Conjugación (fecundación): reconocimiento de señales entre los tipos sexuales a y  </li></ul><ul><li>Mutantes con dos fenotipos diferentes: </li></ul><ul><li>Mutantes que no conjugan o que no señalan: ste2, 7, 11 </li></ul><ul><li>Mutantes que señalan constitutivamente: STE11c, STE4c </li></ul><ul><li>Análisis de dobles mutantes </li></ul><ul><li>mutantes fenotipo conclusión significado ruta </li></ul><ul><li>ste7 STE4c estéril ste7 espistático sobre STE4c STE4 necesita STE7 4  7 </li></ul><ul><li>ste11 STE4c estéril ste11 espistático sobre STE4c STE4 necesita STE11 4  7, 11 </li></ul><ul><li>ste2 STE4c señala STE4c espistático sobre ste2 STE4 no necesita STE2 2  4  7, 11 </li></ul><ul><li>ste7 STE11c estéril ste7 espistático sobre STE11c STE11 necesita STE7 2  4  7  11 </li></ul>

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