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Tecniche avanzate per la valutazione del trasporto di farmaci e nanoparticelle nella cute

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Presentazione della mia tesi sperimentale in Legislazione e Tecnologia Farmaceutiche

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Tecniche avanzate per la valutazione del trasporto di farmaci e nanoparticelle nella cute

  1. 1. Tecniche avanzate per la valutazione del trasporto di farmaci e nanoparticelle nella cute Candidato Mariana Villante Matr. 512/3152 Relatori Ch.ma Prof. Fabiana Quaglia Ch.mo Dr Pellegrino Musto ANNO ACCADEMICO 2012/2013
  2. 2. La cute è costituita da tre strati: Epidermide Derma Ipoderma La cute La fase limitante per l’assorbimento dei farmaci attraverso la cute è rappresentata dal superamento dello strato corneo (strato più esterno dell’epidermide)
  3. 3. Le nanoparticelle (NPs) sono vettori colloidali polimerici di forma sferica con dimensioni tra 10- 300 nm NPs a base di polimeri biodegradabili stanno attirando l’attenzione in ragione della loro:  biocompatibilità  capacità di assemblarsi spontaneamente in nanostrutture ad architettura core-shell ed incapsulare farmaci idrofili e lipofili H2O >CMC Porzione idrofila Porzione lipofila Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm H2O >CMC Porzione idrofila Porzione lipofila Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm10-100 nm10-100 nm Core Shell Farmaco lipofilo H2O >CMC Porzione idrofila Porzione lipofila Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm H2O >CMC Porzione idrofila Porzione lipofila Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo 10-100 nm10-100 nm10-100 nm Core Shell Farmaco lipofilo Architettura core-shell di un nanosistema Nanoparticelle polimeriche Veicolazione di differenti farmaci attraverso la cute
  4. 4. Valutare il trasporto e la permeazione di nanoparticelle contenenti il farmaco attraverso la cute. Microscopia a fluorescenza Spettroscopia Raman Confocale Microspettroscopia FTIR
  5. 5. Nanoparticelle: copolimero a blocchi a base di poli(ε-caprolattone) (PCL) e di polietilenossido (PEO) Farmaco: Zinco-ftalocianina (ZnPht) Zinco-ftalocianina Tessuto cutaneo: pelle di orecchio di maiale
  6. 6. 1. Preparazione NPs Formulazione ZnPht (mg) PEG 400 (ml) Acqua (ml) Sepigel (g) NPs (mg) ZnPht-NPs/W 7,5 - 800 - 3,75 ZnPht-NPs(crio)/W 7,5 - 100 - 3,75 ZnPht-NPs/PEG 7,5 200 - - 3,75 ZnPht-NPs/gel 7,5 - - 1 3,75 Composizione delle formulazioni di NPs caricate con ZnPht W = acqua, PEG = polietilenglicole, gel = Sepigel, crio = HPβCD 2. Preparazione dei tessuti Campione Descrizione A skin non trattata B skin + ZnPht-NPs/W C skin + ZnPht-NPs(crio)/W D skin + ZnPht-NPs/PEG E skin + ZnPht-NPs/gel EtOH/THF 1:1 ZnPht Copolimero in acqua a 75°C Sonicazione  Raffreddamento  Evaporazione  Filtrazione (0.45 mm)  HPbCD 10:1 come crioprotettore Sonda ad ultrasuoni Melting/Sonication cella di Franz Quantità iniziale di ZnPht: 0,2% p/p rispetto al copolimero
  7. 7. Microscopia a fluorescenza di sezioni di orecchio di maiale trattate con le ZnPht- NPs dopo 24 ore di permeazione Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm Il PEG e la ciclodestrina hanno potenziato notevolmente il passaggio percutaneo delle NPs, aumentando l’accumulo del farmaco nello strato corneo
  8. 8. Spettroscopia Raman confocale L’effetto Raman è un esempio di interazione anelastica tra radiazione e materia La maggior parte dell’onda elettromagnetica incidente passa indisturbata attraverso il campione. Un fotone su un milione ha un urto anelastico. Urto elastico  effetto Rayleigh Urto anelastico  effetto Raman 1. Stokes 2. anti-Stokes L’onda emessa può avere una frequenza minore dell’onda incidente di una quantità pari al salto energetico vibrazionale (Stokes) o maggiore della stessa quantità (anti-Stokes) I fotoni che interagiscono con la materia possono essere diffusi in 3 modi: E’ una tecnica non invasiva e non distruttiva , non richiede alcuna preparazione del campione ed è in grado di produrre una mappa spettrale, punto per punto, della distribuzione chimica del campione.
  9. 9. Np-Ctr Campione non trattato Np-ZnPht ZnPht Np-ZnPht Contrasto spettroscopico a 1730 e 1114 cm-1 Efficienza di incapsulazione del farmaco nelle nanoparticelle ARAMIS (Horiba-Jobin Yvon) Fettine di circa 200 µm di spessore Parametri di acquisizione dello spettro: laser 532 nm, Obiettivo 50x/0.75
  10. 10. Band Band position (cm-1) Functional group Mode of vibration 1 870 C–C Stretch 2 973 =C–H Out-of-plane bend cis 3 1068 C–C Aliphatic out-of-phase stretch 4 1082 C–C Aliphatic stretch 5 1123 C–C Aliphatic in-phase stretch 6 1269 =C–H Symmetric rock cis 7 1305 CH2 Twisting (all-in-phase) 8 1440 CH2 Symmetric deformation (scissor) 9 1461 CH3 Antisymmetric deformation 10 1657 C = C Stretch 11 1750 C = O Stretch Scansione effettuata partendo dall’ epidermide fino a 50 µm all’interno del campione. I segnali osservati in tutti gli spettri sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco campione B (skin + Np-ZnPht/W)
  11. 11. -2 0 2 4 6 8 10 12 14 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 x 10 5 Immagine Raman elaborata considerando l’intensità del picco a 1440 cm-1 Area di mappatura 15 x 15 µm Non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco Si esclude l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensioni micrometriche campione B (skin + Np-ZnPht/W) 1440 cm-1
  12. 12. Microspettroscopia FTIR Metodo di indagine che combina la spettroscopia infrarossa e la microscopia ottica Permette quindi di ottenere informazioni su porzioni molto piccole di campione La zona sulla quale ottenere lo spettro viene identificata mediante il microscopio ottico. Lo stesso cammino ottico viene poi percorso dal raggio IR La presenza di un microscopio permette di vedere il proprio campione e selezionare il punto in cui eseguire lo spettro
  13. 13. Np-Ctr Np-ZnPht ZnPht Campione non trattato Np-ZnPht Contrasto spettroscopico nelle regioni 1430 – 1260 cm-1 e 1000 – 800 cm-1 Lo spettro della nanoparticella nativa è coincidente con quello della nanoparticella caricata Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm e fissati su speciali vetrini. Parametri di acquisizione dello spettro: Apertura 50 x 50 µm
  14. 14. Lo spettro varia fortemente in base alla posizione in cui viene raccolto Lo spettro della regione esterna (traccia rossa) è tipico dei componenti lipidici Verso gli strati più interni del tessuto emergono: o le bande proteiche (un doppietto a 1650 e 1555 cm-1, rispettivamente, bande ammide I e ammide II e un picco a 1243 cm-1, banda ammide III) o la banda (OH) dell’acqua, centrata a circa 3350 cm-1 campione non trattato
  15. 15. Diagramma bidimensionale frequenza – posizione campione non trattato campione B (skin + Np-ZnPht/W) In entrambi i campioni esiste uno strato esterno idrofobico in cui la concentrazione d’acqua è praticamente nulla C’è un punto di discontinuità in cui la concentrazione d’acqua ha un improvviso incremento. Questo punto che caratterizza la profondità dello strato idrofobico è notevolmente più interno nel caso del campione non trattato
  16. 16. campione non trattato campione trattato Area della banda analitica dell’acqua (circa 3350 cm-1) in funzione della posizione La presenza delle nanoparticelle sembra favorire il processo di idratazione del tessuto L’idratazione cutanea nel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto al riferimento
  17. 17. I risultati ottenuti mediante tecnica a fluorescenza hanno evidenziato la capacità delle NPs di permeare attraverso la cute, superando la barriera dello strato corneo, distribuendosi negli strati cutanei più profondi dell’epidermide Tutti gli spettri sia IR che Raman sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco. Evidentemente, la concentrazione di nanocarica e/o del farmaco è troppo bassa per poter essere rilevata data la sensibilità di tali tecniche I risultati ottenuti dalle misure di Raman imaging in modalità mappatura x-y ci consentono comunque di escludere l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensioni micrometriche È stata sviluppata, mediante microscopia FTIR, una metodica semi-quantitativa molto promettente per la valutazione dell’ idratazione tissutale in funzione della profondità di campionamento Sono stati ottenuti profili di concentrazione d’acqua che mostrano che l’idratazione cutanea nel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto al riferimento, proprietà che spiegherebbe il trasporto efficiente del nanosistema fino al derma

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